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La melamina es un contaminante alimentario reconocido que puede estar presente en ciertas categorías de alimentos, tanto de forma accidental como intencionada. El objetivo de este estudio fue verificar la detección y cuantificación de la melamina en fórmulas infantiles y leche en polvo. Se analizaron 40 muestras de alimentos disponibles comercialmente, incluyendo fórmulas infantiles y leche en polvo, procedentes de diferentes regiones de Irán. El contenido aproximado de melamina de las muestras se determinó mediante cromatografía líquida de alta resolución con luz ultravioleta (HPLC-UV). Se construyó una curva de calibración (R² = 0,9925) para la detección de melamina en un rango de 0,1 a 1,2 μg mL−1. Los límites de cuantificación y detección fueron de 1 μg mL−1 y 3 μg mL−1, respectivamente. Se analizó la melamina en fórmulas infantiles y leche en polvo, y los resultados mostraron que los niveles de melamina en las muestras de fórmula infantil y leche en polvo fueron de 0,001 a 0,095 mg kg−1 y de 0,001 a 0,004 mg kg−1, respectivamente. Estos valores se ajustan a la legislación de la UE y al Codex Alimentarius. Cabe destacar que el consumo de estos productos lácteos con contenido reducido de melamina no supone un riesgo significativo para la salud del consumidor. Esto también se ve respaldado por los resultados de la evaluación de riesgos.
La melamina es un compuesto orgánico con la fórmula molecular C₃H₃N₃, derivado de la cianamida. Presenta una solubilidad muy baja en agua y contiene aproximadamente un 66 % de nitrógeno. Es un compuesto industrial ampliamente utilizado con una amplia gama de usos legítimos en la producción de plásticos, fertilizantes y equipos de procesamiento de alimentos (incluidos envases de alimentos y utensilios de cocina)1,2. También se utiliza como portador de fármacos para el tratamiento de enfermedades. La alta proporción de nitrógeno en la melamina puede provocar un uso indebido del compuesto y la transmisión de las propiedades de las moléculas proteicas a los ingredientes alimentarios3,4. Por lo tanto, la adición de melamina a productos alimenticios, incluidos los lácteos, aumenta el contenido de nitrógeno. Por lo tanto, se concluyó erróneamente que el contenido proteico de la leche era mayor de lo que realmente era.
Por cada gramo de melamina añadido, el contenido proteico de los alimentos aumenta un 0,4 %. Sin embargo, la melamina es muy soluble en agua y puede causar daños más graves. Añadir 1,3 gramos de melamina a productos líquidos como la leche puede aumentar su contenido proteico en un 30 %5,6. Si bien se añade melamina a alimentos de origen animal e incluso humano para aumentar su contenido proteico7, la Comisión del Codex Alimentarius (CAC) y las autoridades nacionales no la han aprobado como aditivo alimentario y la han clasificado como peligrosa en caso de ingestión, inhalación o absorción cutánea. En 2012, el Centro Internacional de Investigaciones sobre el Cáncer de la Organización Mundial de la Salud (OMS) clasificó la melamina como carcinógeno de clase 2B por su potencial efecto perjudicial para la salud humana8. La exposición prolongada a la melamina puede causar cáncer o daño renal2. La melamina presente en los alimentos puede formar complejos con el ácido cianúrico para formar cristales amarillos insolubles en agua que pueden causar daño al tejido renal y vesical, así como cáncer del tracto urinario y pérdida de peso9,10. Puede causar intoxicación alimentaria aguda y, en altas concentraciones, la muerte, especialmente en bebés y niños pequeños.11 La Organización Mundial de la Salud (OMS) también ha establecido la ingesta diaria tolerable (IDT) de melamina para humanos en 0,2 mg/kg de peso corporal por día según las directrices de la CAC.12 La Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) ha establecido el nivel máximo de residuos de melamina en 1 mg/kg en fórmulas infantiles y 2,5 mg/kg en otros alimentos.2,7 En septiembre de 2008, se informó que varios fabricantes nacionales de fórmulas infantiles habían añadido melamina a la leche en polvo para aumentar el contenido proteico de sus productos, lo que provocó una intoxicación por leche en polvo y desencadenó un incidente de intoxicación por melamina a nivel nacional que enfermó a más de 294.000 niños y hospitalizó a más de 50.000. 13
La lactancia materna no siempre es posible debido a diversos factores, como las dificultades de la vida urbana y las enfermedades de la madre o el niño, lo que lleva al uso de fórmulas infantiles. Por ello, se han establecido fábricas para producir fórmulas infantiles con una composición lo más parecida posible a la de la leche materna14. Las fórmulas infantiles que se venden en el mercado suelen elaborarse con leche de vaca y suelen contener una mezcla especial de grasas, proteínas, carbohidratos, vitaminas, minerales y otros compuestos. Para lograr una composición similar a la de la leche materna, el contenido de proteínas y grasas varía y, según el tipo de leche, se fortifican con vitaminas y minerales como el hierro15. Dado que los bebés son un grupo vulnerable y existe riesgo de intoxicación, la seguridad del consumo de leche en polvo es fundamental para la salud. Tras el caso de intoxicación por melamina en bebés chinos, países de todo el mundo han prestado mucha atención a este problema, y ​​la sensibilidad en este ámbito también ha aumentado. Por lo tanto, es especialmente importante reforzar el control de la producción de fórmulas infantiles para proteger la salud de los bebés. Existen diversos métodos para detectar melamina en alimentos, como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), la electroforesis, el método sensorial, la espectrofotometría y el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas antígeno-anticuerpo16. En 2007, la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) desarrolló y publicó un método de HPLC para la determinación de melamina y ácido cianúrico en alimentos, que es el método más eficaz para determinar el contenido de melamina17.
Las concentraciones de melamina en fórmulas infantiles, medidas mediante una nueva técnica de espectroscopia infrarroja, oscilaron entre 0,33 y 0,96 miligramos por kilogramo (mg/kg-1).¹⁸ Un estudio realizado en Sri Lanka halló que los niveles de melamina en la leche entera en polvo oscilaban entre 0,39 y 0,84 mg/kg-1. Además, las muestras de fórmulas infantiles importadas contenían los niveles más altos de melamina, con 0,96 y 0,94 mg/kg, respectivamente. Estos niveles están por debajo del límite reglamentario (1 mg/kg), pero se necesita un programa de monitoreo para garantizar la seguridad del consumidor.¹⁹
Varios estudios han examinado los niveles de melamina en las fórmulas infantiles iraníes. Aproximadamente el 65 % de las muestras contenían melamina, con un promedio de 0,73 mg/kg y un máximo de 3,63 mg/kg. Otro estudio indicó que el nivel de melamina en las fórmulas infantiles osciló entre 0,35 y 3,40 μg/kg, con un promedio de 1,38 μg/kg. En general, se ha evaluado la presencia y el nivel de melamina en las fórmulas infantiles iraníes en diversos estudios, y algunas muestras con melamina superaron el límite máximo establecido por las autoridades reguladoras (2,5 mg/kg/pienso).
Considerando el gran consumo directo e indirecto de leche en polvo en la industria alimentaria y la especial importancia de las fórmulas infantiles en la alimentación infantil, este estudio tuvo como objetivo validar el método de detección de melamina en leche en polvo y fórmulas infantiles. De hecho, el primer objetivo de este estudio fue desarrollar un método cuantitativo rápido, sencillo y preciso para detectar la adulteración de melamina en fórmulas infantiles y leche en polvo mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y detección ultravioleta (UV). En segundo lugar, el objetivo de este estudio fue determinar el contenido de melamina en fórmulas infantiles y leche en polvo comercializadas en el mercado iraní.
Los instrumentos utilizados para el análisis de melamina varían según el lugar de producción de alimentos. Se utilizó un método de análisis HPLC-UV sensible y confiable para medir los residuos de melamina en la leche y las fórmulas infantiles. Los productos lácteos contienen diversas proteínas y grasas que pueden interferir con la medición de melamina. Por lo tanto, como lo señalan Sun et al. 22, es necesaria una estrategia de limpieza adecuada y efectiva antes del análisis instrumental. En este estudio, utilizamos filtros de jeringa desechables. En este estudio, utilizamos una columna C18 para separar la melamina en fórmulas infantiles y leche en polvo. La Figura 1 muestra el cromatograma para la detección de melamina. Además, la recuperación de las muestras que contenían 0,1–1,2 mg/kg de melamina osciló entre el 95% y el 109%, la ecuación de regresión fue y = 1,2487x − 0,005 (r = 0,9925) y los valores de la desviación estándar relativa (DER) oscilaron entre el 0,8 y el 2%. Los datos disponibles indican que el método es fiable en el rango de concentración estudiado (Tabla 1). El límite de detección instrumental (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ) de la melamina fueron de 1 μg mL−1 y 3 μg mL−1, respectivamente. Además, el espectro UV de la melamina presentó una banda de absorción a 242 nm. El método de detección es sensible, fiable y preciso. Este método puede utilizarse para la determinación rutinaria del nivel de melamina.
Resultados similares han sido publicados por varios autores. Se desarrolló un método de cromatografía líquida de alto rendimiento-arreglo de fotodiodos (HPLC) para el análisis de melamina en productos lácteos. Los límites inferiores de cuantificación fueron 340 μg kg−1 para leche en polvo y 280 μg kg−1 para fórmula infantil a 240 nm. Filazzi et al. (2012) informaron que no se detectó melamina en fórmula infantil por HPLC. Sin embargo, el 8% de las muestras de leche en polvo contenían melamina a un nivel de 0,505–0,86 mg/kg. Tittlemiet et al.23 realizaron un estudio similar y determinaron que el contenido de melamina de la fórmula infantil (número de muestra: 72) por cromatografía líquida de alto rendimiento-espectrometría de masas/MS (HPLC-MS/MS) era de aproximadamente 0,0431–0,346 mg kg−1. En un estudio realizado por Venkatasamy et al. (2010), se utilizó un enfoque de química verde (sin acetonitrilo) y cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC) para estimar la melamina en fórmulas infantiles y leche. El rango de concentración de la muestra fue de 1,0 a 80 g/mL y la respuesta fue lineal (r > 0,999). El método mostró recuperaciones de 97,2–101,2 en el rango de concentración de 5–40 g/mL y la reproducibilidad fue inferior al 1,0% de desviación estándar relativa. Además, el LOD y el LOQ observados fueron 0,1 g mL−1 y 0,2 g mL−124, respectivamente. Lutter et al. (2011) determinaron la contaminación con melamina en leche de vaca y fórmulas infantiles a base de leche mediante HPLC-UV. Las concentraciones de melamina variaron de < 0,2 a 2,52 mg kg−1. El rango dinámico lineal del método HPLC-UV fue de 0,05 a 2,5 mg kg−1 para leche de vaca, de 0,13 a 6,25 mg kg−1 para fórmula infantil con una fracción de masa proteica <15%, y de 0,25 a 12,5 mg kg−1 para fórmula infantil con una fracción de masa proteica del 15%. Los resultados de LOD (y LOQ) fueron 0,03 mg kg−1 (0,09 mg kg−1) para leche de vaca, 0,06 mg kg−1 (0,18 mg kg−1) para fórmula infantil <15% proteína, y 0,12 mg kg−1 (0,36 mg kg−1) para fórmula infantil 15% proteína, con una relación señal-ruido de 3 y 1025 para LOD y LOQ, respectivamente. Diebes et al. (2012) investigaron los niveles de melamina en muestras de fórmula infantil y leche en polvo mediante HPLC/DMD. En la fórmula infantil, los niveles mínimo y máximo fueron de 9,49 mg kg−1 y 258 mg kg−1, respectivamente. El límite de detección (LOD) fue de 0,05 mg kg−1.
Javaid et al. informaron que los residuos de melamina en fórmulas infantiles estaban en el rango de 0,002–2 mg kg−1 mediante espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FT-MIR) (LOD = 1 mg kg−1; LOQ = 3,5 mg kg−1). Rezai et al.27 propusieron un método HPLC-DDA (λ = 220 nm) para estimar la melamina y lograron un LOQ de 0,08 μg mL−1 para leche en polvo, que fue inferior al nivel obtenido en este estudio. Sun et al. desarrollaron un RP-HPLC-DAD para la detección de melamina en leche líquida mediante extracción en fase sólida (SPE). Obtuvieron un LOD y LOQ de 18 y 60 μg kg−128, respectivamente, que es más sensible que el estudio actual. Montesano et al. confirmaron la eficacia del método HPLC-DMD para la evaluación del contenido de melamina en suplementos proteicos con un límite de cuantificación de 0,05–3 mg/kg, que fue menos sensible que el método utilizado en este estudio29.
Sin duda, los laboratorios analíticos desempeñan un papel importante en la protección del medio ambiente mediante el monitoreo de contaminantes en diversas muestras. Sin embargo, el uso de una gran cantidad de reactivos y solventes durante el análisis puede resultar en la formación de residuos peligrosos. Por lo tanto, la química analítica verde (CAG) se desarrolló en el año 2000 para reducir o eliminar los efectos adversos de los procedimientos analíticos en los operadores y el medio ambiente26. Los métodos tradicionales de detección de melamina, incluyendo cromatografía, electroforesis, electroforesis capilar y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), se han utilizado para identificar melamina. Sin embargo, entre los numerosos métodos de detección, los sensores electroquímicos han atraído mucha atención debido a su excelente sensibilidad, selectividad, tiempo de análisis rápido y características de fácil uso30,31. La nanotecnología verde utiliza vías biológicas para sintetizar nanomateriales, lo que puede reducir la generación de residuos peligrosos y el consumo de energía, promoviendo así la implementación de prácticas sostenibles. Los nanocompuestos, por ejemplo, fabricados a partir de materiales respetuosos con el medio ambiente, pueden utilizarse en biosensores para detectar sustancias como la melamina32,33,34.
El estudio demuestra que la microextracción en fase sólida (SPME) se utiliza eficazmente gracias a su mayor eficiencia energética y sostenibilidad en comparación con los métodos de extracción tradicionales. Su respeto al medio ambiente y eficiencia energética la convierten en una excelente alternativa a los métodos de extracción tradicionales en química analítica y ofrecen un método más sostenible y eficiente para la preparación de muestras35.
En 2013, Wu et al. desarrollaron un biosensor de resonancia de plasmón superficial (mini-SPR) altamente sensible y selectivo que utiliza la interacción entre melamina y anticuerpos antimelamina para detectar rápidamente la melamina en fórmulas infantiles mediante inmunoensayo. El biosensor SPR, combinado con un inmunoensayo (que utiliza albúmina sérica bovina conjugada con melamina), es una tecnología fácil de usar y económica, con un límite de detección de tan solo 0,02 μg mL-136.
Nasiri y Abbasian utilizaron un sensor portátil de alto potencial en combinación con compuestos de óxido de grafeno y quitosano (GOCS) para detectar melamina en muestras comerciales37. Este método mostró una selectividad, precisión y respuesta ultraaltas. El sensor GOCS demostró una sensibilidad notable (239,1 μM−1), un rango lineal de 0,01 a 200 μM, una constante de afinidad de 1,73 × 104 y un LOD de hasta 10 nM. Además, un estudio realizado por Chandrasekhar et al. en 2024 adoptó un enfoque ecológico y rentable. Utilizaron extracto de cáscara de papaya como agente reductor para sintetizar nanopartículas de óxido de zinc (ZnO-NP) en un método ecológico. Posteriormente, se desarrolló una técnica única de espectroscopia micro-Raman para la determinación de melamina en fórmulas infantiles. Las nanopartículas de ZnO derivadas de residuos agrícolas han demostrado tener potencial como herramienta de diagnóstico valiosa y como una tecnología confiable y de bajo costo para monitorear y detectar melamina38.
Alizadeh et al. (2024) utilizaron una plataforma de fluorescencia de estructura metalorgánica (MOF) de alta sensibilidad para determinar la melamina en leche en polvo. El rango lineal y el límite inferior de detección del sensor, determinados mediante 3σ/S, fueron de 40 a 396,45 nM (equivalente a 25 μg kg−1 a 0,25 mg kg−1) y 40 nM (equivalente a 25 μg kg−1), respectivamente. Este rango está muy por debajo de los límites máximos de residuos (LMR) establecidos para la identificación de melamina en fórmulas infantiles (1 mg kg−1) y otras muestras de alimentos/piensos (2,5 mg kg−1). El sensor fluorescente (terbio (Tb)@NH₂-MIL-253(Al)MOF) demostró una mayor precisión y una capacidad de medición más precisa que la HPLC₃9 en la detección de melamina en leche en polvo. Los biosensores y nanocompuestos en la química verde no sólo mejoran las capacidades de detección, sino que también minimizan los riesgos ambientales de acuerdo con los principios de desarrollo sostenible.
Los principios de la química verde se han aplicado a diversos métodos para la determinación de melamina. Un enfoque consiste en el desarrollo de un método de microextracción en fase sólida dispersiva verde que utiliza el polímero polar natural β-ciclodextrina reticulado con ácido cítrico para la extracción eficiente de melamina 40 de muestras como fórmulas infantiles y agua caliente. Otro método utiliza la reacción de Mannich para la determinación de melamina en muestras de leche. Este método es económico, respetuoso con el medio ambiente y de alta precisión, con un rango lineal de 0,1 a 2,5 ppm y un bajo límite de detección 41. Además, se desarrolló un método rentable y respetuoso con el medio ambiente para la determinación cuantitativa de melamina en leche líquida y fórmulas infantiles mediante espectroscopia de transmisión infrarroja por transformada de Fourier con alta precisión y límites de detección de 1 ppm y 3,5 ppm, respectivamente 42. Estos métodos demuestran la aplicación de los principios de la química verde al desarrollo de métodos eficientes y sostenibles para la determinación de melamina.
Varios estudios han propuesto métodos innovadores para la detección de melamina, como la extracción en fase sólida y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)43, así como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) rápida, que no requiere pretratamiento complejo ni reactivos de pares iónicos, lo que reduce la cantidad de residuos químicos44. Estos métodos no solo proporcionan resultados precisos para la determinación de melamina en productos lácteos, sino que también cumplen con los principios de la química verde, minimizando el uso de sustancias químicas peligrosas y reduciendo el impacto ambiental general del proceso analítico.
Se analizaron por triplicado cuarenta muestras de diferentes marcas, cuyos resultados se presentan en la Tabla 2. Los niveles de melamina en las muestras de fórmula infantil y leche en polvo oscilaron entre 0,001 y 0,004 mg/kg y entre 0,001 y 0,095 mg/kg, respectivamente. No se observaron cambios significativos entre los tres grupos de edad de la fórmula infantil. Además, se detectó melamina en el 80 % de la leche en polvo, pero el 65 % de las fórmulas infantiles estaban contaminadas con melamina.
El contenido de melamina en la leche en polvo industrial fue mayor que en la fórmula infantil y la diferencia fue significativa (p<0,05) (Figura 2).
Los resultados obtenidos se situaron por debajo de los límites establecidos por la FDA (menos de 1 y 2,5 mg/kg). Además, los resultados se ajustan a los límites establecidos por la CAC (2010) y la UE45,46, es decir, el límite máximo permitido es de 1 mg/kg para fórmulas infantiles y de 2,5 mg/kg para productos lácteos.
Según un estudio de 2023 realizado por Ghanati et al.47, el contenido de melamina en diferentes tipos de leche envasada en Irán osciló entre 50,7 y 790 μg kg−1. Sus resultados estuvieron por debajo del límite permisible de la FDA. Nuestros resultados son inferiores a los de Shoder et al.48 y Rima et al.49. Shoder et al. (2010) encontraron que los niveles de melamina en la leche en polvo (n = 49) determinados por ELISA oscilaron entre 0,5 y 5,5 mg/kg. Rima et al. analizaron los residuos de melamina en la leche en polvo mediante espectrofotometría de fluorescencia y encontraron que el contenido de melamina en la leche en polvo era de 0,72–5,76 mg/kg. En 2011, se realizó un estudio en Canadá para monitorear los niveles de melamina en la fórmula infantil (n = 94) mediante cromatografía líquida (LC/MS). Se encontraron concentraciones de melamina por debajo del límite aceptable (norma preliminar: 0,5 mg kg−1). Es improbable que los niveles fraudulentos de melamina detectados fueran una táctica utilizada para aumentar el contenido proteico. Sin embargo, esto no puede explicarse por el uso de fertilizantes, la reubicación del contenido de los envases ni factores similares. Además, no se reveló el origen de la melamina presente en la leche en polvo importada a Canadá.
Hassani et al. midieron el contenido de melamina en leche en polvo y leche líquida en el mercado iraní en 2013 y encontraron resultados similares. Los resultados mostraron que, a excepción de una marca de leche en polvo y leche líquida, todas las demás muestras estaban contaminadas con melamina, con niveles que oscilaban entre 1,50 y 30,32 μg g−1 en leche en polvo y entre 0,11 y 1,48 μg ml−1 en leche. Cabe destacar que no se detectó ácido cianúrico en ninguna de las muestras, lo que reduce la posibilidad de intoxicación por melamina para los consumidores. 51 Estudios previos han evaluado la concentración de melamina en productos de chocolate que contienen leche en polvo. Alrededor del 94 % de las muestras importadas y el 77 % de las muestras iraníes contenían melamina. Los niveles de melamina en las muestras importadas oscilaron entre 0,032 y 2,692 mg/kg, mientras que los de las muestras iraníes oscilaron entre 0,013 y 2,600 mg/kg. En general, se detectó melamina en el 85% de las muestras, pero solo una marca específica tuvo niveles superiores al límite permitido.44 Tittlemier et al. informaron niveles de melamina en la leche en polvo que oscilaron entre 0,00528 y 0,0122 mg/kg.
La Tabla 3 resume los resultados de la evaluación de riesgos para los tres grupos de edad. El riesgo fue inferior a 1 en todos los grupos de edad. Por lo tanto, no existe ningún riesgo no cancerígeno para la salud derivado de la melamina en las fórmulas infantiles.
Los niveles más bajos de contaminación en los productos lácteos pueden deberse a una contaminación no intencionada durante la preparación, mientras que los niveles más altos pueden deberse a adiciones intencionadas. Además, el riesgo general para la salud humana derivado del consumo de productos lácteos con bajos niveles de melamina se considera bajo. Se puede concluir que consumir productos con niveles tan bajos de melamina no supone ningún riesgo para la salud del consumidor52.
Considerando la importancia de la gestión de la seguridad alimentaria en la industria láctea, especialmente en términos de protección de la salud pública, es de suma importancia desarrollar y validar un método para evaluar y comparar los niveles y residuos de melamina en la leche en polvo y las fórmulas infantiles. Se desarrolló un método espectrofotométrico HPLC-UV simple y preciso para la determinación de melamina en fórmulas infantiles y leche en polvo. El método fue validado para garantizar su confiabilidad y precisión. Los límites de detección y cuantificación del método demostraron ser lo suficientemente sensibles para medir los niveles de melamina en fórmulas infantiles y leche en polvo. Según nuestros datos, se detectó melamina en la mayoría de las muestras iraníes. Todos los niveles de melamina detectados estuvieron por debajo de los límites máximos permitidos establecidos por la CAC, lo que indica que el consumo de este tipo de productos lácteos no representa un riesgo para la salud humana.
Todos los reactivos químicos utilizados fueron de grado analítico: melamina (2,4,6-triamino-1,3,5-triazina) con una pureza del 99 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); acetonitrilo de grado HPLC (Merck, Darmstadt, Alemania); agua ultrapura (Millipore, Morfheim, Francia). Filtros de jeringa desechables (Chromafil Xtra PVDF-45/25, tamaño de poro de 0,45 μm, diámetro de membrana de 25 mm) (Macherey-Nagel, Düren, Alemania).
Para preparar las muestras se utilizaron un baño ultrasónico (Elma, Alemania), una centrífuga (Beckman Coulter, Krefeld, Alemania) y HPLC (KNAUER, Alemania).
Se utilizó un cromatógrafo líquido de alta resolución (KNAUER, Alemania) equipado con un detector UV. Las condiciones de análisis por HPLC fueron las siguientes: se utilizó un sistema UHPLC Ultimate equipado con una columna analítica ODS-3 C18 (4,6 mm × 250 mm, tamaño de partícula 5 μm) (MZ, Alemania). El eluyente de HPLC (fase móvil) fue una mezcla de TFA/metanol (450:50 mL) con un caudal de 1 mL min-1. La longitud de onda de detección fue de 242 nm. El volumen de inyección fue de 100 μL, la temperatura de la columna fue de 20 °C. Dado que el tiempo de retención del fármaco es largo (15 minutos), la siguiente inyección debe realizarse después de 25 minutos. La melamina se identificó comparando el tiempo de retención y el pico del espectro UV de los estándares de melamina.
Se preparó una solución estándar de melamina (10 μg/mL) con agua y se almacenó en refrigerador (4 °C), protegida de la luz. Se diluyó la solución madre con la fase móvil y se prepararon las soluciones estándar de trabajo. Cada solución estándar se inyectó en el HPLC 7 veces. La ecuación de calibración 10 se calculó mediante análisis de regresión del área del pico y la concentración determinadas.
Se adquirieron leche de vaca en polvo comercialmente disponible (20 muestras) y muestras de diferentes marcas de fórmula infantil a base de leche de vaca (20 muestras) en supermercados y farmacias locales de Irán para la alimentación de lactantes de diferentes grupos de edad (0-6 meses, 6-12 meses y >12 meses) y se almacenaron a temperatura refrigerada (4 °C) hasta su análisis. A continuación, se pesó 1 ± 0,01 g de leche en polvo homogeneizada y se mezcló con acetonitrilo:agua (50:50, v/v; 5 mL). La mezcla se agitó durante 1 min, luego se sonicó en un baño ultrasónico durante 30 min y finalmente se agitó durante 1 min. A continuación, la mezcla se centrifugó a 9000 × g durante 10 min a temperatura ambiente y el sobrenadante se filtró en un vial de muestreador automático de 2 ml utilizando un filtro de jeringa de 0,45 μm. Luego, el filtrado (250 μl) se mezcló con agua (750 μl) y se inyectó en el sistema HPLC10,42.
Para validar el método, se determinaron la recuperación, la exactitud, el límite de detección (LOD), el límite de cuantificación (LOQ) y la precisión en condiciones óptimas. El LOD se definió como el contenido de muestra con una altura de pico tres veces superior al nivel de ruido de referencia. Por otro lado, el contenido de muestra con una altura de pico diez veces superior a la relación señal-ruido se definió como el LOQ.
La respuesta del dispositivo se determinó utilizando una curva de calibración que consta de siete puntos de datos. Se utilizaron diferentes contenidos de melamina (0, 0,2, 0,3, 0,5, 0,8, 1 y 1,2). Se determinó la linealidad del procedimiento de cálculo de melamina. Además, se añadieron varios niveles diferentes de melamina a las muestras en blanco. La curva de calibración se construyó inyectando continuamente 0,1–1,2 μg mL−1 de una solución estándar de melamina en muestras de fórmula infantil y leche en polvo y su R2 = 0,9925. La precisión se evaluó mediante la repetibilidad y reproducibilidad del procedimiento y se logró inyectando muestras en el primer día y los tres días posteriores (por triplicado). La repetibilidad del método se evaluó calculando el % de RSD para tres concentraciones diferentes de melamina añadida. Se realizaron estudios de recuperación para determinar la precisión. El grado de recuperación por el método de extracción se calculó en tres niveles de concentración de melamina (0,1, 1,2, 2) en muestras de fórmula infantil y leche en polvo9,11,15.
La ingesta diaria estimada (IDE) se determinó utilizando la siguiente fórmula: IDE = Ci × Cc/PC.
Donde Ci es el contenido promedio de melamina, Cc es el consumo de leche y BW es el peso promedio de los niños.
El análisis de datos se realizó con el programa SPSS 24. Se comprobó la normalidad mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov; todos los datos se obtuvieron mediante pruebas no paramétricas (p = 0). Por lo tanto, se utilizaron las pruebas de Kruskal-Wallis y de Mann-Whitney para determinar las diferencias significativas entre los grupos.
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