Los metabolitos inmunomoduladores son una característica clave del microambiente tumoral (EMT), pero con algunas excepciones, sus identidades siguen siendo en gran parte desconocidas. Aquí, analizamos tumores y células T de los tumores y ascitis de pacientes con carcinoma seroso de alto grado (CEAG) para revelar el metaboloma de estos diferentes compartimentos del EMT. La ascitis y las células tumorales tienen amplias diferencias de metabolitos. En comparación con la ascitis, las células T que infiltran el tumor están significativamente enriquecidas en 1-metilnicotinamida (MNA). Aunque el nivel de MNA en las células T es elevado, la expresión de la nicotinamida N-metiltransferasa (una enzima que cataliza la transferencia de grupos metilo de la S-adenosilmetionina a la nicotinamida) se limita a fibroblastos y células tumorales. Funcionalmente, el MNA induce a las células T a secretar el factor de necrosis tumoral alfa, una citocina promotora de tumores. Por lo tanto, el MNA derivado de TME contribuye a la regulación inmunitaria de las células T y representa un objetivo potencial de inmunoterapia para el tratamiento del cáncer humano.
Los metabolitos derivados de tumores pueden tener un profundo efecto inhibidor sobre la inmunidad antitumoral, y cada vez hay más evidencia que demuestra que también pueden servir como un factor clave para la progresión de la enfermedad (1). Además del efecto Warburg, trabajos recientes han comenzado a caracterizar el estado metabólico de las células tumorales y su relación con el estado inmunitario del microambiente tumoral (EMT). Estudios en modelos murinos y células T humanas han demostrado que el metabolismo de la glutamina (2), el metabolismo oxidativo (3) y el metabolismo de la glucosa (4) pueden actuar de forma independiente sobre varios subgrupos de células inmunitarias. Varios metabolitos en estas vías inhiben la función antitumoral de las células T. Se ha demostrado que el bloqueo de la coenzima tetrahidrobiopterina (BH4) puede dañar la proliferación de células T, y el aumento de BH4 en el cuerpo puede potenciar la respuesta inmunitaria antitumoral mediada por CD4 y CD8. Además, el efecto inmunosupresor de la quinurenina puede ser rescatado por la administración de BH4 (5). En el glioblastoma mutante de la isocitrato deshidrogenasa (IDH), la secreción del enantiometabólico (R)-2-hidroxiglutarato (R-2-HG) inhibe la activación, proliferación y citólisis de las células T (6). Recientemente, se ha demostrado que el metilglioxal, un subproducto de la glucólisis, es producido por células supresoras de origen mieloide, y la transferencia de metilglioxal a las células T puede inhibir la función de las células T efectoras. En el tratamiento, la neutralización del metilglioxal puede superar la actividad de las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) y mejorar sinérgicamente la terapia de bloqueo de puntos de control en modelos murinos (7). Estos estudios enfatizan colectivamente el papel clave de los metabolitos derivados de TME en la regulación de la función y la actividad de las células T.
La disfunción de células T se ha reportado ampliamente en el cáncer de ovario (8). Esto se debe en parte a las características metabólicas inherentes a la hipoxia y la vasculatura tumoral anormal (9), que resulta en la conversión de glucosa y triptófano en subproductos como ácido láctico y quinurenina. El lactato extracelular excesivo reduce la producción de interferón-γ (IFN-γ) e impulsa la diferenciación de subgrupos mielosupresores (10, 11). El consumo de triptófano inhibe directamente la proliferación de células T e inhibe la señalización del receptor de células T (12-14). A pesar de estas observaciones, mucho trabajo en torno al metabolismo inmunológico se llevó a cabo en cultivos de células T in vitro utilizando medios optimizados, o limitado a modelos de ratón homólogos in vivo, ninguno de los cuales refleja completamente la heterogeneidad de los cánceres humanos y el macro y microambiente fisiológico.
Una característica común del cáncer de ovario es la diseminación peritoneal y la aparición de ascitis. La acumulación de líquido celular en la ascitis se asocia con enfermedad avanzada y mal pronóstico (15). Según informes, este compartimento único es hipóxico, presenta altos niveles de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) e indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO), y está infiltrado por células T reguladoras y células inhibidoras mieloides (15-18). El entorno metabólico de la ascitis puede ser diferente al del propio tumor, por lo que la reprogramación de las células T en el espacio peritoneal no está clara. Además, las diferencias clave y la heterogeneidad entre la ascitis y los metabolitos presentes en el entorno tumoral pueden dificultar la infiltración de células inmunitarias y su función en los tumores, por lo que se necesita más investigación.
Para resolver estos problemas, diseñamos un método sensible de separación celular y espectrometría de masas en tándem con cromatografía líquida (LC-MS/MS) para estudiar diferentes tipos de células (incluidas las células T CD4+ y CD8+), así como dentro y entre tumores. Sus metabolitos abarcan células en el mismo entorno ascítico y tumoral del paciente. Usamos este método junto con la citometría de flujo de alta dimensión y la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) para proporcionar un retrato altamente resuelto del estado metabólico de estas poblaciones clave. Este método reveló un aumento significativo en el nivel de 1-metilnicotinamida (MNA) en células T tumorales, y los experimentos in vitro mostraron que el efecto inmunomodulador de MNA en la función de las células T era previamente desconocido. En general, este método revela las interacciones metabólicas mutuas entre tumores y células inmunes, y proporciona conocimientos únicos sobre los metabolitos de regulación inmune, que pueden ser útiles para el tratamiento de la inmunoterapia del cáncer de ovario basada en células T Oportunidades de tratamiento.
Utilizamos citometría de flujo de alta dimensión para cuantificar simultáneamente la captación de glucosa [2-(N-(7-nitrofenil-2-oxa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-desoxiglucosa (2-NBDG) y la actividad mitocondrial [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) son marcadores típicos que distinguen a las células inmunes y las poblaciones de células tumorales (Tabla S2 y Figura S1A). Este análisis mostró que, en comparación con las células T, las ascitis y las células tumorales tienen niveles de captación de glucosa más altos, pero tienen diferencias más pequeñas en la actividad mitocondrial. La captación de glucosa promedio de las células tumorales [CD45-EpCAM (EpCAM)+] es de tres a cuatro veces mayor que la de las células T, y la captación de glucosa promedio de las células T CD4+ es 1,2 veces mayor que la de las células T CD8+, lo que indica que los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) tienen diferentes requisitos metabólicos incluso en el mismo TME (Figura 1A). Por el contrario, la actividad mitocondrial en las células tumorales es similar a la de las células T CD4+, y la actividad mitocondrial de ambos tipos de células es mayor que la de las células T CD8+ (Figura 1B). En general, estos resultados revelan el nivel metabólico. La actividad metabólica de las células tumorales es mayor que la de las células T CD4+, y la actividad metabólica de las células T CD4+ es mayor que la de las células T CD8+. A pesar de estos efectos entre los tipos de células, no hay una diferencia consistente en el estado metabólico de las células T CD4+ y CD8+ o sus proporciones relativas en la ascitis en comparación con los tumores (Figura 1C). Por el contrario, en la fracción de células CD45-, la proporción de células EpCAM+ en el tumor aumentó en comparación con la ascitis (Figura 1D). También observamos una clara diferencia metabólica entre los componentes celulares EpCAM+ y EpCAM-. Las células EpCAM+ (tumorales) tienen una mayor captación de glucosa y actividad mitocondrial que las células EpCAM-, que es mucho mayor que la actividad metabólica de los fibroblastos en las células tumorales en TME (Figura 1, E y F).
(A y B) Intensidad de fluorescencia media (MFI) de la captación de glucosa (2-NBDG) (A) y actividad mitocondrial de células T CD4+ (MitoTracker rojo oscuro) (B) Gráficos representativos (izquierda) y datos tabulados (Derecha), células T CD8+ y células tumorales EpCAM+ CD45-de ascitis y tumor. (C) Relación de células CD4+ y CD8+ (de células T CD3+) en ascitis y tumor. (D) Proporción de células tumorales EpCAM+ en ascitis y tumor (CD45−). (E y F) Captación de glucosa de EpCAM+ CD45-tumor y EpCAM-CD45-matriz (2-NBDG) (E) y actividad mitocondrial (MitoTracker rojo oscuro) (F) Gráficos representativos (izquierda) y datos tabulados (Derecha) Ascitis y células tumorales. (G) Gráficos representativos de la expresión de CD25, CD137 y PD1 por citometría de flujo. (H e I) Expresión de CD25, CD137 y PD1 en linfocitos T CD4+ (H) y linfocitos T CD8+ (I). (J y K) Fenotipos de linfocitos naive, de memoria central (Tcm), efectores (Teff) y de memoria efectora (Tem) basados ​​en la expresión de CCR7 y CD45RO. Imágenes representativas (izquierda) y datos tabulares (derecha) de linfocitos T CD4+ (J) y linfocitos T CD8+ (K) en ascitis y tumores. Valores de p determinados mediante la prueba t pareada (*P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001). La línea representa pacientes emparejados (n = 6). FMO: fluorescencia menos uno; MFI: mediana de la intensidad de fluorescencia.
Análisis posteriores revelaron otras diferencias significativas entre el estado fenotípico de las células T altamente resueltas. Las células T activadas (Figura 1, G a I) y las células efectoras de memoria (Figura 1, J y K) en tumores son mucho más frecuentes que en ascitis (proporción de células T CD3+). De manera similar, analizar el fenotipo mediante la expresión de marcadores de activación (CD25 y CD137) y marcadores de depleción [proteína de muerte celular programada 1 (PD1)] mostró que, aunque las características metabólicas de estas poblaciones son diferentes (Figura S1, B a E), no se observaron diferencias metabólicas significativas de forma consistente entre los subconjuntos naive, efector o de memoria (Figura S1, F a I). ​​Estos resultados se confirmaron mediante el uso de métodos de aprendizaje automático para asignar automáticamente los fenotipos celulares (21), lo que reveló además la presencia de una gran cantidad de células de médula ósea (CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+) en la ascitis del paciente (Figura S2A). Entre todos los tipos celulares identificados, esta población de células mieloides mostró la mayor captación de glucosa y actividad mitocondrial (Figura S2, B a G). Estos resultados resaltan las marcadas diferencias metabólicas entre los múltiples tipos celulares presentes en la ascitis y los tumores en pacientes con HGSC.
El principal desafío para comprender las características metabonómicas de los TIL es la necesidad de aislar muestras de células T con suficiente pureza, calidad y cantidad de los tumores. Estudios recientes han demostrado que los métodos de clasificación y enriquecimiento de microesferas basados ​​en citometría de flujo pueden provocar cambios en los perfiles de metabolitos celulares (22-24). Para superar este problema, optimizamos el método de enriquecimiento de microesferas para aislar y aislar TIL de cáncer de ovario humano resecado quirúrgicamente antes del análisis por LC-MS/MS (véase Materiales y métodos; Figura 2A). Para evaluar el impacto general de este protocolo en los cambios de metabolitos, comparamos los perfiles de metabolitos de las células T activadas por donantes sanos después del paso de separación de microesferas mencionado anteriormente con células que no se separaron mediante microesferas, sino que permanecieron en hielo. Este análisis de control de calidad encontró que existe una alta correlación entre estas dos condiciones (r = 0,77), y la repetibilidad técnica del grupo de 86 metabolitos es alta (Figura 2B). Por lo tanto, estos métodos pueden realizar un análisis preciso de metabolitos en células sometidas a enriquecimiento de tipos celulares, proporcionando así la primera plataforma de alta resolución para identificar metabolitos específicos en HGSC, permitiendo así a las personas obtener una comprensión más profunda del programa de metabolismo sexual de especificidad celular.
(A) Diagrama esquemático del enriquecimiento con perlas magnéticas. Antes del análisis por LC-MS/MS, las células se someterán a tres rondas consecutivas de enriquecimiento con perlas magnéticas o permanecerán en hielo. (B) El efecto del tipo de enriquecimiento en la abundancia de metabolitos. El promedio de tres mediciones para cada tipo de enriquecimiento ± EE. La línea gris representa una relación 1:1. La correlación intraclase (CCI) de mediciones repetidas se muestra en la etiqueta del eje. NAD, nicotinamida adenina dinucleótido. (C) Diagrama esquemático del flujo de trabajo del análisis de metabolitos del paciente. Se recolectan ascitis o tumores de los pacientes y se criopreservan. Una pequeña porción de cada muestra se analizó por citometría de flujo, mientras que las muestras restantes se sometieron a tres rondas de enriquecimiento para células CD4+, CD8+ y CD45-. Estas fracciones celulares se analizaron utilizando LC-MS/MS. (D) Mapa de calor de la abundancia estandarizada de metabolitos. El dendrograma representa la agrupación de Ward de las distancias euclidianas entre muestras. (E) Análisis de componentes principales (PCA) del mapa de metabolitos de la muestra, que muestra tres réplicas de cada muestra; las muestras del mismo paciente están conectadas por una línea. (F) El PCA del perfil de metabolitos de la muestra, condicionado al paciente (es decir, utilizando redundancia parcial); el tipo de muestra está limitado por la envoltura convexa. PC1, componente principal 1; PC2, componente principal 2.
A continuación, aplicamos este método de enriquecimiento para analizar 99 metabolitos en las fracciones de células CD4+, CD8+ y CD45- en la ascitis primaria y tumores de seis pacientes con HGSC (Figura 2C, Figura S3A y Tabla S3 y S4). La población de interés representa del 2% al 70% de la muestra grande original de células vivas, y la proporción de células varía considerablemente entre pacientes. Después de separar las perlas, la fracción de interés enriquecida (CD4+, CD8+ o CD45-) representa más del 85% de todas las células vivas en la muestra en promedio. Este método de enriquecimiento nos permite analizar poblaciones celulares del metabolismo del tejido tumoral humano, lo cual es imposible de hacer a partir de muestras grandes. Usando este protocolo, determinamos que la l-quinurenina y la adenosina, estos dos metabolitos inmunosupresores bien caracterizados, estaban elevados en las células T tumorales o células tumorales (Figura S3, B y C). Por lo tanto, estos resultados demuestran la fidelidad y la capacidad de nuestra tecnología de separación de células y espectrometría de masas para encontrar metabolitos biológicamente importantes en los tejidos de los pacientes.
Nuestro análisis también reveló una fuerte separación metabólica de los tipos de células dentro y entre los pacientes (Figura 2D y Figura S4A). En particular, en comparación con otros pacientes, el paciente 70 mostró diferentes características metabólicas (Figura 2E y Figura S4B), lo que indica que puede haber una heterogeneidad metabólica sustancial entre los pacientes. Vale la pena señalar que, en comparación con otros pacientes (1,2 a 2 litros; Tabla S1), la cantidad total de ascitis recolectada en el paciente 70 (80 ml) fue menor. El control de la heterogeneidad interpaciente durante el análisis de componentes principales (por ejemplo, utilizando análisis de redundancia parcial) muestra cambios consistentes entre los tipos de células, y los tipos de células y/o el microambiente se agregan claramente de acuerdo con el perfil de metabolitos (Figura 2F). El análisis de metabolitos individuales enfatizó estos efectos y reveló diferencias significativas entre los tipos de células y el microambiente. Vale la pena señalar que la diferencia más extrema observada es MNA, que generalmente se enriquece en células CD45- y en células CD4+ y CD8+ que infiltran el tumor (Figura 3A). En el caso de las células CD4+, este efecto es más evidente, y el MNA en las células CD8+ también parece verse fuertemente afectado por el entorno. Sin embargo, esto no es relevante, ya que solo en tres de los seis pacientes se pueden evaluar las puntuaciones tumorales de CD8+. Además del MNA, en diferentes tipos de células presentes en ascitis y tumores, otros metabolitos poco caracterizados en TIL también presentan una riqueza diferencial (Figuras S3 y S4). Por lo tanto, estos datos revelan un prometedor conjunto de metabolitos inmunomoduladores para futuras investigaciones.
(A) Contenido normalizado de MNA en células CD4+, CD8+ y CD45- de ascitis y tumor. El diagrama de cajas muestra la mediana (línea), el rango intercuartil (bisagra del marco) y el rango de los datos, hasta 1,5 veces el rango intercuartil (bigotes del marco). Como se describe en Materiales y métodos para el paciente, utilice el valor de limma del paciente para determinar el valor de p (*P < 0,05 y **P < 0,01). (B) Diagrama esquemático del metabolismo de MNA (60). Metabolitos: S-adenosil-1-metionina; SAH, S-adenosina-1-homocisteína; NA, nicotinamida; MNA, 1-metilnicotinamida; 2-PY, 1-metil-2-piridona-5-carboxamida; 4-PY, 1-metil-4-piridona-5-carboxamida; NR, nicotinamida ribosa; NMN, nicotinamida mononucleótido. Enzimas (verde): NNMT, nicotinamida N-metiltransferasa; SIRT, sirtuinas; NAMPT, nicotinamida fosforribosil transferasa; AOX1, aldehído oxidasa 1; NRK, nicotinamida ribósido quinasa; NMNAT, nicotinamida mononucleótido adenilato transferasa; Pnp1, purina nucleósido fosforilasa. (C) t-SNE de scRNA-seq de ascitis (gris) y tumor (rojo; n = 3 pacientes). (D) Expresión de NNMT en diferentes poblaciones celulares identificadas usando scRNA-seq. (E) Expresión de NNMT y AOX1 en SK-OV-3, riñón embrionario humano (HEK) 293T, células T y células T tratadas con MNA. La expresión plegada se muestra en relación con SK-OV-3. Se muestra el patrón de expresión con SEM (n = 6 donantes sanos). Los valores de Ct superiores a 35 se consideran indetectables (UD). (F) Expresión de SLC22A1 y SLC22A2 en SK-OV-3, HEK293T, células T y células T tratadas con MNA 8 mM. Se muestra la expresión plegada en relación con SK-OV-3. Se muestra el patrón de expresión con SEM (n = 6 donantes sanos). Los valores de Ct superiores a 35 se consideran indetectables (UD). (G) Contenido de MNA celular en células T activadas de donantes sanos tras 72 horas de incubación con MNA. Se muestra el patrón de expresión con SEM (n = 4 donantes sanos).
El MNA se produce mediante la transferencia del grupo metilo de la S-adenosil-1-metionina (SAM) a la nicotinamida (NA) por la nicotinamida N-metiltransferasa (NNMT; Figura 3B). La NNMT se sobreexpresa en diversos cánceres humanos y se asocia con la proliferación, la invasión y la metástasis (25-27). Para comprender mejor el origen del MNA en las células T en TME, utilizamos scRNA-seq para caracterizar la expresión de NNMT en distintos tipos celulares en la ascitis y los tumores de tres pacientes con HGSC (Tabla S5). El análisis de aproximadamente 6500 células mostró que, en la ascitis y los entornos tumorales, la expresión de NNMT se limitaba a las presuntas poblaciones de fibroblastos y células tumorales (Figura 3, C y D). Cabe destacar que no hay una expresión obvia de NNMT en ninguna población que exprese PTPRC (CD45+) (Figura 3D y Figura S5A), lo que indica que el MNA detectado en el espectro de metabolitos se ha introducido en las células T. La expresión de la aldehído oxidasa 1 (AOX1) convierte la MNA en 1-metil-2-piridona-5-carboxamida (2-PYR) o 1-metil-4-piridona-5-carboxamida (4-PYR); Figura 3B) también está restringida a la población de fibroblastos que expresan COL1A1 (Figura S5A), lo que en conjunto indica que las células T carecen de la capacidad del metabolismo convencional de la MNA. El patrón de expresión de estos genes relacionados con la MNA se verificó utilizando un segundo conjunto de datos celulares independientes de ascitis de pacientes con HGSC (Figura S5B; n = 6) (16). Además, el análisis de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) de células T de donantes sanos tratadas con MNA mostró que, en comparación con las células tumorales ováricas de control SK-OV-3, NNMT o AOX1 casi no se expresaron (Figura 3E). Estos resultados inesperados indican que la MNA puede secretarse desde fibroblastos o tumores hacia células T adyacentes en TME.
Aunque los candidatos incluyen la familia de transportadores de cationes orgánicos 1 a 3 (OCT1, OCT2 y OCT3) codificados por la familia del transportador soluble 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 y SLC22A3), los transportadores potenciales de MNA aún no están definidos (28). La QPCR de ARNm de células T de donantes sanos mostró niveles bajos de expresión de SLC22A1 pero niveles indetectables de SLC22A2, lo que confirmó que se había informado previamente en la literatura (Figura 3F) (29). Por el contrario, la línea celular de tumor de ovario SK-OV-3 expresó altos niveles de ambos transportadores (Figura 3F).
Para evaluar la capacidad de las células T para absorber MNA foráneo, se cultivaron células T sanas de donantes durante 72 horas en presencia de diferentes concentraciones de MNA. En ausencia de MNA exógeno, no se pudo detectar el contenido celular de MNA (Figura 3G). Sin embargo, las células T activadas tratadas con MNA exógeno mostraron un aumento dosis-dependiente del contenido de MNA en las células, hasta 6 mM de MNA (Figura 3G). Este resultado indica que, a pesar del bajo nivel de expresión del transportador y la ausencia de la principal enzima responsable del metabolismo intracelular de MNA, los TIL aún pueden absorber MNA.
El espectro de metabolitos en las células T de los pacientes y los experimentos de absorción de MNA in vitro aumentan la posibilidad de que los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) secreten MNA y las células tumorales puedan regular el fenotipo y la función de TIL. Para determinar el efecto de MNA en las células T, se activaron in vitro células T sanas de donantes en presencia o ausencia de MNA, y se evaluó su proliferación y producción de citocinas. Después de 7 días de añadir MNA a la dosis más alta, el número de duplicación de la población se redujo moderadamente, mientras que el vigor se mantuvo en todas las dosis (Figura 4A). Además, el tratamiento con MNA exógeno resultó en un aumento en la proporción de células T CD4 + y CD8 + que expresan el factor de necrosis tumoral-α (TNFα; Figura 4B). Por el contrario, la producción intracelular de IFN-γ se redujo significativamente en las células T CD4 +, pero no en las células T CD8 +, y no hubo cambios significativos en la interleucina 2 (IL-2; Figura 4, C y D). Por lo tanto, el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de sobrenadantes de estos cultivos de células T tratados con MNA mostró un aumento significativo en TNFα, una disminución en IFN-γ y ningún cambio en IL-2 (Figura 4, E a G). . La disminución de IFN-γ indica que MNA puede desempeñar un papel en la inhibición de la actividad antitumoral de las células T. Con el fin de simular el efecto de MNA en la citotoxicidad mediada por células T, las células T del receptor de antígeno quimérico (FRα-CAR-T) dirigidas al receptor de folato α y las células CAR-T (GFP) reguladas por la proteína fluorescente verde (GFP) -CAR-T) son producidas por células mononucleares de sangre periférica de donantes sanos (PBMC). Las células CAR-T se cultivaron durante 24 horas en presencia de MNA y luego se cocultivaron con células tumorales de ovario SK-OV-3 humanas que expresaban el receptor de folato α en una relación efector a diana de 10:1. El tratamiento con MNA resultó en una disminución significativa en la actividad letal de las células FRα-CAR-T, que fue similar a la de las células FRα-CAR-T tratadas con adenosina (Figura 4H).
(A) Recuento total de células viables y duplicación de la población (PD) directamente del cultivo en el día 7. El gráfico de barras representa la media + SEM de seis donantes sanos. Representa datos de al menos n = 3 experimentos independientes. (B a D) Se utilizaron CD3/CD28 e IL-2 para activar las células T en sus respectivas concentraciones de MNA durante 7 días. Antes del análisis, las células se estimularon con PMA/ionomicina con GolgiStop durante 4 horas. Expresión de TNFα (B) en células T. Imagen de ejemplo (izquierda) y datos tabulares (derecha) de la expresión de TNFα en células vivas. Expresión de IFN-γ (C) e IL-2 (D) en células T. La expresión de citocinas se midió por citometría de flujo. El gráfico de barras representa la media (n = 6 donantes sanos) + SEM. Utilice análisis de varianza unidireccional y medidas repetidas (*P < 0,05 y **P < 0,01) para determinar el valor P. Representa datos de al menos n = 3 experimentos independientes. (E a ​​G) Se utilizaron CD3/CD28 e IL-2 para activar las células T en sus respectivas concentraciones de MNA durante 7 días. El medio se recolectó antes y después de 4 horas de estimulación con PMA/ionomicina. Las concentraciones de TNFα (E), IFN-γ (F) e IL-2 (G) se midieron por ELISA. El gráfico de barras representa la media (n = 5 donantes sanos) + SEM. El valor de p se determinó utilizando un análisis de varianza unidireccional y mediciones repetidas (*P < 0,05). La línea punteada indica el límite de detección de la detección. (H) Ensayo de lisis celular. Las células FRα-CAR-T o GFP-CAR-T se ajustaron con adenosina (250 μM) o MNA (10 mM) durante 24 horas, o se dejaron sin tratar (Ctrl). Se midió el porcentaje de muerte de células SK-OV-3. Valor P determinado mediante prueba t de Welch (*P<0,5 y **P<0,01).
Para obtener una comprensión mecanicista de la regulación de la expresión de TNFα dependiente de MNA, se evaluaron los cambios en el ARNm de TNFα de las células T tratadas con MNA (Figura 5A). Las células T sanas de donantes tratadas con MNA mostraron un aumento de dos veces en los niveles de transcripción de TNFα, lo que indica que MNA depende de la regulación transcripcional de TNFα. Para investigar este posible mecanismo regulador, se evaluaron dos factores de transcripción conocidos que regulan TNFα, a saber, el factor nuclear de células T activado (NFAT) y la proteína específica 1 (Sp1), en respuesta a la unión de MNA al promotor proximal de TNFα (30). El promotor de TNFα contiene 6 sitios de unión de NFAT identificados y 2 sitios de unión de Sp1, superpuestos en un sitio [-55 pares de bases (pb) desde la tapa 5'] (30). La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) mostró que cuando se trató con MNA, la unión de Sp1 al promotor de TNFα aumentó tres veces. La incorporación de NFAT también aumentó y alcanzó una importancia cercana (Figura 5B). Estos datos indican que MNA regula la expresión de TNFα mediante la transcripción de Sp1 y, en menor medida, la expresión de NFAT.
(A) Comparado con células T cultivadas sin MNA, el cambio en la expresión de TNFα en células T tratadas con MNA. Se muestra el patrón de expresión con SEM (n = 5 donantes sanos). Representa datos de al menos n = 3 experimentos independientes. (B) El promotor de TNFα de células T tratadas con o sin MNA 8 mM después de que NFAT y Sp1 se combinaran con (Ctrl) y estimulación con PMA/ionomicina durante 4 horas. La inmunoglobulina G (IgG) y H3 se usaron como controles negativo y positivo para la inmunoprecipitación, respectivamente. La cuantificación de ChIP mostró que la unión de Sp1 y NFAT al promotor de TNFα en células tratadas con MNA aumentó varias veces en comparación con el control. Representa datos de al menos n = 3 experimentos independientes. Valor de p determinado por múltiples pruebas t (*** P <0,01). (C) En comparación con la ascitis de HGSC, las células T (no citotóxicas) mostraron una mayor expresión de TNF en el tumor. Los colores representan diferentes pacientes. Las células mostradas se muestrearon aleatoriamente a 300 y se varió su tamaño para limitar el sobredibujado (** Padj = 0,0076). (D) Modelo propuesto de MNA para el cáncer de ovario. El MNA se produce en células tumorales y fibroblastos en el TME y es captado por las células T. El MNA aumenta la unión de Sp1 al promotor de TNFα, lo que aumenta la transcripción de TNFα y la producción de citocinas TNFα. El MNA también causa una disminución de IFN-γ. La inhibición de la función de las células T reduce la capacidad de destrucción y acelera el crecimiento tumoral.
Según informes, TNFα tiene efectos antitumorales y antitumorales dependientes frontal y posterior, pero tiene un papel bien conocido en la promoción del crecimiento y la metástasis del cáncer de ovario (31-33). Según informes, la concentración de TNFα en ascitis y tejidos tumorales en pacientes con cáncer de ovario es mayor que en tejidos benignos (34-36). En términos de mecanismo, TNFα puede regular la activación, función y proliferación de glóbulos blancos, y cambiar el fenotipo de las células cancerosas (37, 38). En consonancia con estos hallazgos, el análisis de expresión génica diferencial mostró que TNF estaba significativamente regulado al alza en células T en tejidos tumorales en comparación con ascitis (Figura 5C). El aumento en la expresión de TNF solo fue evidente en poblaciones de células T con un fenotipo no citotóxico (Figura S5A). En resumen, estos datos respaldan la opinión de que MNA tiene efectos inmunosupresores y promotores de tumores duales en HGSC.
El marcaje fluorescente basado en citometría de flujo se ha convertido en el método principal para estudiar el metabolismo de los TIL. Estos estudios han demostrado que, en comparación con los linfocitos de sangre periférica o las células T de órganos linfoides secundarios, los TIL murinos y humanos tienen una mayor tendencia a captar glucosa (4, 39) y la pérdida gradual de la función mitocondrial (19, 40). Aunque hemos observado resultados similares en este estudio, el desarrollo clave es comparar el metabolismo de las células tumorales y los TIL del mismo tejido tumoral resecado. En consonancia con algunos de estos informes previos, las células tumorales (CD45-EpCAM +) de ascitis y tumores tienen una mayor captación de glucosa que las células T CD8 + y CD4 +, lo que respalda que la alta captación de glucosa de las células tumorales puede compararse con las células T. El concepto de competencia de células T. TME. Sin embargo, la actividad mitocondrial de las células tumorales es mayor que la de las células T CD8 +, pero la actividad mitocondrial es similar a la de las células T CD4 +. Estos resultados refuerzan el tema emergente de que el metabolismo oxidativo es importante para las células tumorales (41, 42). También sugieren que las células T CD8+ pueden ser más susceptibles a la disfunción oxidativa que las células T CD4+, o que las células T CD4+ pueden usar fuentes de carbono distintas de la glucosa para mantener la actividad mitocondrial (43, 44). Cabe señalar que no observamos diferencias en la captación de glucosa o la actividad mitocondrial entre los efectores T CD4+, las células T de memoria efectora y las células T de memoria central en la ascitis. De manera similar, el estado de diferenciación de las células T CD8+ en los tumores no tiene nada que ver con los cambios en la captación de glucosa, lo que destaca la diferencia significativa entre las células T cultivadas in vitro y las TIL humanas in vivo (22). Estas observaciones también se confirmaron mediante el uso de la asignación automática no sesgada de la población celular, que reveló además que las células CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+ con mayor captación de glucosa y actividad mitocondrial que las células tumorales son prevalentes pero tienen una población celular metabólicamente activa. Esta población podría representar la posible subpoblación de células supresoras mieloides o células dendríticas plasmocitoides identificadas en el análisis de scRNA-seq. Si bien ambas se han descrito en tumores ováricos humanos [45], aún se requieren más estudios para describir esta subpoblación mieloide.
Aunque los métodos basados ​​en la citometría de flujo pueden aclarar las diferencias generales en el metabolismo de la glucosa y el metabolismo oxidativo entre tipos celulares, aún no se han determinado los metabolitos precisos producidos por la glucosa u otras fuentes de carbono para el metabolismo mitocondrial en la EMT. Asignar la presencia o ausencia de metabolitos a un subconjunto dado de TIL requiere la purificación de la población celular del tejido extirpado. Por lo tanto, nuestro método de enriquecimiento celular, combinado con la espectrometría de masas, puede proporcionar información sobre los metabolitos que se enriquecen diferencialmente en las poblaciones de células T y células tumorales en muestras de pacientes compatibles. Si bien este método presenta ventajas sobre la clasificación celular activada por fluorescencia, ciertas bibliotecas de metabolitos pueden verse afectadas debido a su estabilidad inherente o a su rápida tasa de recambio (22). No obstante, nuestro método logró identificar dos metabolitos inmunosupresores reconocidos, la adenosina y la quinurenina, debido a su gran variación entre los tipos de muestra.
Nuestro análisis metabonómico de tumores y subtipos de TIL proporciona más información sobre el papel de los metabolitos en la TME ovárica. En primer lugar, mediante citometría de flujo, determinamos que no había diferencia en la actividad mitocondrial entre tumores y células T CD4+. Sin embargo, el análisis LC-MS/MS reveló cambios significativos en la abundancia de metabolitos entre estas poblaciones, lo que indica que las conclusiones sobre el metabolismo de TIL y su actividad metabólica general requieren una interpretación cuidadosa. En segundo lugar, MNA es el metabolito con la mayor diferencia entre las células CD45 y las células T en ascitis, no tumores. Por lo tanto, la compartimentación y la ubicación del tumor pueden tener diferentes efectos en el metabolismo de TIL, lo que destaca la posible heterogeneidad en un microambiente dado. En tercer lugar, la expresión de la enzima productora de MNA, NNMT, se limita principalmente a CAF, que son células tumorales en menor medida, pero se observan niveles detectables de MNA en células T derivadas de tumores. La sobreexpresión de NNMT en CAF ovárico tiene un conocido efecto promotor del cáncer, en parte debido a la promoción del metabolismo de CAF, la invasión tumoral y la metástasis (27). Aunque el nivel general de TIL es moderado, la expresión de NNMT en CAF está estrechamente relacionada con el subtipo mesenquimal del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA), que se asocia con un mal pronóstico (27, 46, 47). Finalmente, la expresión de la enzima AOX1 responsable de la degradación de MNA también se limita a la población de CAF, lo que indica que las células T carecen de la capacidad de metabolizar MNA. Estos resultados respaldan la idea de que, aunque se necesita más investigación para verificar este hallazgo, los altos niveles de MNA en las células T pueden indicar la presencia de un microambiente inmunosupresor de CAF.
Dado el bajo nivel de expresión de los transportadores de MNA y los niveles indetectables de proteínas clave implicadas en su metabolismo, la presencia de MNA en linfocitos T es inesperada. Ni NNMT ni AOX1 pudieron detectarse mediante análisis de scRNA-seq ni PCR cuantitativa dirigida de dos cohortes independientes. Estos resultados indican que el MNA no es sintetizado por los linfocitos T, sino absorbido del tejido tumoral circundante. Experimentos in vitro muestran que los linfocitos T tienden a acumular MNA exógeno.
Nuestros estudios in vitro han demostrado que la MNA exógena induce la expresión de TNFα en células T y mejora la unión de Sp1 al promotor de TNFα. Aunque el TNFα tiene funciones tanto antitumorales como antitumorales, en el cáncer de ovario, el TNFα puede promover el crecimiento del cáncer de ovario (31-33). La neutralización del TNFα en cultivos de células tumorales de ovario o la eliminación de la señal de TNFα en modelos murinos puede mejorar la producción de citocinas inflamatorias mediada por TNFα e inhibir el crecimiento tumoral (32, 35). Por lo tanto, en este caso, la MNA derivada de TME puede actuar como un metabolito proinflamatorio a través de un mecanismo dependiente de TNFα a través del bucle autocrino, promoviendo así la aparición y propagación del cáncer de ovario (31). Con base en esta posibilidad, el bloqueo del TNFα se está estudiando como un posible agente terapéutico para el cáncer de ovario (37, 48, 49). Además, la MNA reduce la citotoxicidad de las células CAR-T en las células tumorales ováricas, lo que proporciona evidencia adicional de la supresión inmunitaria mediada por MNA. En conjunto, estos resultados sugieren un modelo en el que los tumores y las células CAF secretan MNA al TME extracelular. Mediante (i) la estimulación del crecimiento del cáncer de ovario inducida por TNF y (ii) la inhibición de la actividad citotóxica de las células T inducida por MNA, esto podría tener un doble efecto tumoral (Figura 5D).
En conclusión, al aplicar una combinación de enriquecimiento celular rápido, secuenciación unicelular y perfil metabólico, este estudio reveló las enormes diferencias inmunometabolómicas entre tumores y células ascíticas en pacientes con HGSC. Este análisis exhaustivo mostró que existen diferencias en la captación de glucosa y la actividad mitocondrial entre las células T, e identificó a MNA como un metabolito regulador inmunitario no autónomo de las células. Estos datos tienen un impacto en cómo TME afecta el metabolismo de las células T en cánceres humanos. Aunque se ha descrito la competencia directa por nutrientes entre las células T y las células cancerosas, los metabolitos también pueden actuar como reguladores indirectos para promover la progresión tumoral y posiblemente suprimir las respuestas inmunitarias endógenas. La descripción más detallada del papel funcional de estos metabolitos reguladores puede abrir el camino a estrategias alternativas para mejorar la respuesta inmunitaria antitumoral.
Las muestras de pacientes y los datos clínicos se obtuvieron a través del repositorio de tejido tumoral de cáncer de BC certificado por la Red Canadiense de Repositorios de Tejidos. De acuerdo con el protocolo aprobado por el Comité de Ética de Investigación del Cáncer de BC y la Universidad de Columbia Británica (H07-00463), todas las muestras de pacientes y los datos clínicos obtuvieron el consentimiento informado por escrito o renunciaron formalmente a su consentimiento. Las muestras se almacenan en el Biobanco certificado (BRC-00290). Las características detalladas de los pacientes se muestran en las Tablas S1 y S5. Para la criopreservación, se utiliza un bisturí para descomponer mecánicamente la muestra de tumor del paciente y luego empujarla a través de un filtro de 100 micras para obtener una suspensión de células individuales. La ascitis del paciente se centrifugó a 1500 rpm durante 10 minutos a 4 °C para sedimentar las células y eliminar el sobrenadante. Las células obtenidas del tumor y la ascitis se criopreservaron en suero AB humano inactivado por calor al 50 % (Sigma-Aldrich), RPMI-1640 al 40 % (Thermo Fisher Scientific) y dimetilsulfóxido al 10 %. Estas suspensiones de células individuales se descongelaron y se utilizaron para la metabolómica y la determinación de metabolitos, como se describe a continuación.
El medio completo consiste en 0,22 μm filtrado 50:50 suplementado RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific) suplementado con 10% de suero AB humano inactivado por calor (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x solución de penicilina estreptomicina (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) y 50 μMB-mercaptoetanol. AimV (Invitrogen) se suplementa con 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) y 2 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific). El tampón de tinción del citómetro de flujo consistió en solución salina tamponada con fosfato (PBS; Invitrogen) filtrada a 0,22 μm, suplementada con suero humano AB inactivado por calor al 3 % (Sigma). El tampón de enriquecimiento celular está compuesto por PBS filtrada a 0,22 μm y suplementado con suero humano AB inactivado por calor al 0,5 % (Sigma-Aldrich).
En medio completo a 37 °C, las células se tiñeron con 10 nM de MT DR y 100 μM de 2-NBDG durante 30 minutos. A continuación, se tiñeron con el colorante de viabilidad eF506 a 4 °C durante 15 minutos. Resuspender las células en FC Block (eBioscience) y Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), diluir en tampón de tinción para citómetro de flujo (según las instrucciones del fabricante) e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Teñir las células con un conjunto de anticuerpos (Tabla S2) en tampón de tinción para citometría de flujo a 4 °C durante 20 minutos. Resuspender las células en tampón de tinción para citometría de flujo (Cytek Aurora; configuración 3L-16V-14B-8R) antes del análisis. Utilizar SpectroFlo y FlowJo V10 para analizar los datos de recuento celular y GraphPad Prism 8 para generar los datos. La mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) de 2-NBDG y MT DR se normalizó logarítmicamente y, posteriormente, se utilizó una prueba t pareada para el análisis estadístico a fin de considerar a los pacientes emparejados. Se eliminaron del análisis todas las poblaciones con menos de 40 eventos; se introdujo un valor de MFI de 1 para cualquier valor negativo antes de realizar el análisis estadístico y la visualización de datos.
Para complementar la estrategia de selección manual del panel de proceso mencionado, utilizamos la anotación completa mediante el árbol de restricción de forma (FAUST) (21) para asignar automáticamente las células a la población tras eliminar las células muertas en FlowJo. Gestionamos manualmente el resultado para fusionar las poblaciones con una asignación incorrecta (combinando células tumorales PD1+ con PD1-) y las poblaciones retenidas. Cada muestra contiene un promedio de más del 2 % de células, lo que suma un total de 11 poblaciones.
Se utilizó la centrifugación de densidad en gradiente Ficoll para separar las PBMC de los productos de separación de leucocitos (STEMCELL Technologies). Se aislaron células T CD8+ de las PBMC utilizando CD8 MicroBeads (Miltenyi) y se expandieron en medio completo utilizando TransAct (Miltenyi) durante 2 semanas según las instrucciones del fabricante. Las células se dejaron reposar durante 5 días en medio completo que contenía IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) y luego se reestimularon con TransAct. El día 7, según las instrucciones del fabricante, se utilizaron CD45 MicroBeads humanas (Miltenyi) para enriquecer las células en tres rondas consecutivas. Las células se dividieron en alícuotas para el análisis por citometría de flujo (como se describió anteriormente) y un millón de células se dividieron en alícuotas tres veces para el análisis por LC-MS/MS. Las muestras se procesaron por LC-MS/MS como se describe a continuación. Estimamos el valor del metabolito faltante con un número iónico de 1000. Cada muestra se normaliza según el número total de iones (TIC), se convierte logarítmicamente y se normaliza automáticamente en MetaboAnalystR antes del análisis.
La suspensión de células individuales de cada paciente se descongeló y se filtró a través de un filtro de 40 μm en medio completo (como se describió anteriormente). De acuerdo con el protocolo del fabricante, se realizaron tres rondas consecutivas de selección positiva mediante separación con microesferas magnéticas (Miltenyi) para enriquecer las muestras con células CD8+, CD4+ y CD45- (en hielo). En resumen, las células se resuspendieron en tampón de enriquecimiento celular (como se describió anteriormente) y se contaron. Las células se incubaron con microesferas CD8 humanas, CD4 humanas o CD45 humanas (Miltenyi) a 4 °C durante 15 minutos y, a continuación, se lavaron con tampón de enriquecimiento celular. La muestra se pasó por la columna LS (Miltenyi) y se recogieron las fracciones positiva y negativa. Para reducir la duración y maximizar la recuperación celular, la fracción CD8 se utilizó para la segunda ronda de enriquecimiento CD4+ y la fracción CD4 para la posterior ronda de enriquecimiento CD45. Mantenga la solución en hielo durante todo el proceso de separación.
Para preparar las muestras para el análisis de metabolitos, las células se lavaron una vez con solución salina helada y se añadió 1 ml de metanol al 80 % a cada muestra. Posteriormente, se sometieron a vórtex y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Las muestras se sometieron a tres ciclos de congelación-descongelación y se centrifugaron a 14 000 rpm durante 15 minutos a 4 °C. El sobrenadante que contiene los metabolitos se evaporó hasta sequedad. Los metabolitos se redisolvieron en 50 μl de ácido fórmico al 0,03 %, se mezclaron con vórtex y se centrifugaron para eliminar los residuos.
Extraiga los metabolitos como se describe anteriormente. Transfiera el sobrenadante a un frasco de cromatografía líquida de alta resolución para investigación metabolómica. Utilice un protocolo de tratamiento aleatorio para tratar cada muestra con un número similar de células y así evitar efectos de lote. Se realizó una evaluación cualitativa de los metabolitos globales, previamente publicada en el espectrómetro de masas de triple cuadrupolo AB SCIEX QTRAP 5500 (50). El análisis cromatográfico y la integración del área de pico se realizaron con el software MultiQuant versión 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Un conteo de iones de 1000 se utilizó para estimar el valor del metabolito faltante, y el TIC de cada muestra se utilizó para calcular el área de pico normalizada de cada metabolito detectado para corregir los cambios introducidos por el análisis instrumental del procesamiento de la muestra. Después de normalizar el TIC, se utiliza MetaboAnalystR(51) (parámetro predeterminado) para la conversión logarítmica y el escalamiento automático de la línea de norma. Utilizamos PCA con el paquete vegan R para realizar un análisis exploratorio de las diferencias del metaboloma entre los tipos de muestra y utilizamos el análisis de redundancia parcial para analizar a los pacientes. Utilice el método Ward para construir un dendrograma de mapa de calor para agrupar la distancia euclidiana entre las muestras. Utilizamos limma (52) en la abundancia estandarizada de metabolitos para identificar metabolitos diferencialmente abundantes en todo el tipo de célula y el microambiente. Para simplificar la explicación, utilizamos el parámetro de media del grupo para especificar el modelo y consideramos los tipos de células en el microambiente como cada grupo (n = 6 grupos); Para la prueba de significancia, se realizaron tres mediciones repetidas para cada metabolito. Para evitar falsas replicaciones, se incluyó al paciente como obstáculo en el diseño de Limma. Para comprobar las diferencias en los metabolitos entre los diferentes pacientes, se ajustó el modelo de Limma, incluyendo a los pacientes de forma fija. Se reporta la significancia del contraste preespecificado entre el tipo celular y el microambiente de Padj < 0,05 (corrección de Benjamin-Hochberg).
Tras el enriquecimiento de vigor con el kit de eliminación de células muertas de Miltenyi (>80 % de viabilidad), se realizó la secuenciación del transcriptoma unicelular en las muestras totales de ascitis y tumor vivas congeladas mediante un protocolo de expresión génica 10x 5'. Se analizaron cinco casos con tumores y ascitis coincidentes, aunque la baja viabilidad de una muestra tumoral impidió su inclusión. Para lograr una selección múltiple de pacientes, combinamos las muestras de cada paciente en los carriles del controlador de cromo 10x y analizamos las ascitis y los tumores por separado. Tras la secuenciación [Illumina HiSeq 4000 28×98 pb paired end (PE), genoma de Quebec; un promedio de 73 488 y 41 378 lecturas por célula para tumor y ascitis respectivamente]], usamos CellSNP y Vireo (53) (basados ​​en CellSNP como El SNP humano común (VCF) proporcionado por GRCh38 tiene asignada una identidad de donante. Usamos SNPRelate para inferir la identidad más cercana (IBS) del estado del genotipo del paciente (IBS), excluyendo células no asignadas y células identificadas como dúplex y donantes coincidentes entre muestras de ascitis y tumor (54). Sobre la base de esta tarea, conservamos tres casos con abundante representación celular en el tumor y la ascitis para el análisis posterior. Después de realizar un paso de filtración masiva en el empaquetamiento BioConductor scater (55) y scran (56), esto produjo 6975 células (2792 y 4183 células de tumor y ascitis, respectivamente) para el análisis. Usamos la agrupación de Louvain de igraph (57) de la red vecina más cercana compartida (SNN) basada en Distancia de Jaccard a las células del grupo según su expresión. Los grupos se anotaron manualmente a los supuestos tipos celulares según la expresión de genes marcadores y se visualizaron con t-SNE. Los linfocitos T citotóxicos se definen por la expresión de CD8A y GZMA, excluyendo los subgrupos con baja expresión de proteína ribosomal. Accedimos a los datos publicados de Izar et al. (16), incluida su inserción en t-SNE, que puede controlar el solapamiento de la expresión entre los marcadores de células inmunitarias y la expresión de NNMT.
Las PBMC se separaron de los productos de separación de leucocitos (STEMCELL Technologies) mediante centrifugación por gradiente de densidad Ficoll. Las células CD3+ se aislaron de las PBMC utilizando microesferas CD3 (Miltenyi). En presencia o ausencia de MNA, las células CD3+ se activaron con CD3 unido a placa (5 μg/ml), CD28 soluble (3 μg/ml) e IL-2 (300 U/ml; Proleukin). El último día de expansión, se evaluaron la viabilidad (colorante de viabilidad fijable eFluor450, eBioscience) y la proliferación (microesferas eBeads de 123 cuentas, Thermo Fisher Scientific) mediante citometría de flujo. Evaluar la función efectora estimulando las células con PMA (20 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml) con GolgiStop durante 4 horas, y monitorizar CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4, BioLegend) y TNFα-isotiocianato de fluoresceína (FITC) (MAb11, BD). Estimular las células qPCR y ChIP con PMA (20 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml) durante 4 horas. El sobrenadante de ELISA se recolectó antes y después de la estimulación con PMA (20 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml) durante 4 horas.
Siga el protocolo del fabricante para aislar el ARN con el kit RNeasy Plus Mini (QIAGEN). Utilice QIAshredder (QIAGEN) para homogeneizar la muestra. Utilice el kit de ARN a ADNc de alta capacidad (Thermo Fisher Scientific) para sintetizar ADN complementario (ADNc). Utilice la mezcla maestra TaqMan Rapid Advanced (Thermo Fisher Scientific) para cuantificar la expresión génica (según el protocolo del fabricante) con las siguientes sondas: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliceraldehído-3-fosfato de hidrógeno (GAPDH)] y Hs01010726_m1 (SLC22A2). Las muestras se analizaron en el sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems) en la placa de reacción óptica rápida MicroAmp de 96 pocillos (Applied Biosystems) con película óptica MicroAmp. Cualquier valor de Ct superior a 35 se considera superior al umbral de detección y se marca como indetectable.
Realice ChIP como se describió previamente (58). En resumen, las células se trataron con formaldehído (concentración final 1,42%) y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Use tampón de hinchamiento suplementado (Hepes 25 mM, MgCl2 1,5 mM, KCl 10 mM y NP-40 al 0,1%) en hielo durante 10 minutos, luego resuspéndalo en tampón de inmunoprecipitación como se describe (58). Luego, la muestra se sonicó con los siguientes ciclos: 10 ciclos (20 pulsos de 1 segundo) y un tiempo estático de 40 segundos. Incube los anticuerpos de inmunoglobulina G de grado ChIP (Cell Signaling Technology; 1 μl), histona H3 (Cell Signaling Technology; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) y SP1 (Cell Signaling Technology; 3 μl) con la muestra a 4 °C y agite durante la noche. Incubar las perlas de proteína A (Thermo Fisher Scientific) con la muestra a 4 °C con agitación suave durante 1 hora. A continuación, utilizar perlas Chelex (Bio-Rad) para enriquecer el ADN y la proteinasa K (Thermo Fisher) para la digestión de las proteínas. El promotor de TNFα se detectó mediante PCR: directa: GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; por el contrario: GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (producto de 207 pb). Las imágenes fueron generadas por Image Lab (Bio-Rad) y cuantificadas con el software ImageJ.
El sobrenadante del cultivo celular se recogió como se describió anteriormente. La determinación se realizó según los procedimientos del fabricante de los kits ELISA para TNFα humano (Invitrogen), IL-2 humano (Invitrogen) e IFN-γ humano (Abcam). Según el protocolo del fabricante, el sobrenadante se diluyó 1:100 para detectar TNFα e IL-2, y 1:3 para detectar IFN-γ. Utilice el lector multietiqueta EnVision 2104 (PerkinElmer) para medir la absorbancia a 450 nm.
Las PBMC se separaron de los productos de separación de leucocitos (STEMCELL Technologies) mediante centrifugación por gradiente de densidad Ficoll. Las células CD3+ se aislaron de las PBMC utilizando microesferas CD3 (Miltenyi). En presencia o ausencia de MNA, las células CD3+ se activaron con CD3 unido a placa (5 μg/ml), CD28 soluble (3 μg/ml) e IL-2 (300 U/ml; Proleukin) durante 3 días. Después de 3 días, las células se recogieron y se lavaron con solución salina al 0,9 %, y el sedimento se congeló instantáneamente. El recuento celular se realizó mediante citometría de flujo (Cytek Aurora; configuración 3L-16V-14B-8R) utilizando microesferas eBeads de 123 cuentas.
Extraiga los metabolitos como se describió anteriormente. El extracto seco se reconstituyó a una concentración de 4000 equivalentes celulares/μl. Analice la muestra mediante cromatografía de fase reversa (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) y columna CORTECS T3 (2,1 × 150 mm, tamaño de partícula 1,6 μm, tamaño de poro 120 Å; n.° 186008500, Waters). Espectrómetro de masas polar (6470, Agilent), con ionización por electrospray en modo positivo. La fase móvil A es ácido fórmico al 0,1 % (en H₂O), y la fase móvil B es acetonitrilo al 90 % y ácido fórmico al 0,1 %. El gradiente de LC es de 0 a 2 minutos para 100% A, 2 a 7,1 minutos para 99% B y 7,1 a 8 minutos para 99% B. Luego reequilibre la columna con la fase móvil A a una velocidad de flujo de 0,6 ml/min durante 3 minutos. La velocidad de flujo es de 0,4 ml/min y la cámara de la columna se calienta a 50 °C. Use el estándar químico puro de MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canadá) para establecer el tiempo de retención (RT) y la transformación (RT = 0,882 minutos, transformación 1 = 137→94,1, transformación 2 = 137→92, Conversión 3 = 137→78). Cuando las tres transiciones ocurren en el tiempo de retención correcto, se usa la transición 1 para la cuantificación para asegurar la especificidad. La curva estándar de MNA (Toronto Research Chemical Company) se generó mediante seis diluciones seriadas de la solución madre (1 mg/ml) para obtener estándares de 0,1, 1,0, 10 y 100 ng/ml y 1,0 y 10 μg/ml de líquido, respectivamente. El límite de detección es de 1 ng/ml y la respuesta lineal se encuentra entre 10 ng/ml y 10 μg/ml. Cada inyección de dos microlitros de muestra y estándar se utiliza para el análisis LC/MS, y se procesa una muestra de control de calidad mixta cada ocho inyecciones para garantizar la estabilidad de la plataforma de análisis. Las respuestas de MNA de todas las muestras celulares tratadas con MNA se mantuvieron dentro del rango lineal del ensayo. El análisis de datos se realizó con el software de análisis cuantitativo MassHunter (v9.0, Agilent).
El constructo αFR-CAR de segunda generación se obtuvo de Song et al. (59). En resumen, el constructo contiene lo siguiente: secuencia líder de CD8a, fragmento variable monocatenario específico de αFR humano, región bisagra y transmembrana de CD8a, dominio intracelular de CD27 y dominio intracelular de CD3z. La secuencia completa del CAR se sintetizó mediante GenScript y posteriormente se clonó en el vector de expresión lentiviral de segunda generación aguas arriba del casete de expresión de GFP utilizado para evaluar la eficiencia de transducción.
El lentivirus se produce mediante la transfección de células HEK293T [Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC)]; se cultiva en medio Eagle modificado de Dulbecco con 10 % de suero fetal bovino (SFB) y 1 % de PenStrep, y se utiliza el vector CAR-GFP. Los plásmidos de empaquetamiento (psPAX2 y pMD2.G, Addgene) utilizan amina de lipofección (Sigma-Aldrich). El sobrenadante con el virus se recogió 48 y 72 horas después de la transfección, se filtró y se concentró por ultracentrifugación. El sobrenadante viral concentrado se conserva a -80 °C hasta la transducción.
Las PBMC se separan de los productos de separación de leucocitos de donantes sanos (STEMCELL Technologies) mediante centrifugación por gradiente de densidad Ficoll. Se utilizan microesferas CD8 de selección positiva (Miltenyi) para aislar las células CD8+ de las PBMC. Se estimulan las células T con TransAct (Miltenyi) y en medio TexMACS [Miltenyi; suplementado con 3 % de suero humano inactivado por calor, 1 % de PenStrep e IL-2 (300 U/ml)]. Veinticuatro horas después de la estimulación, las células T se transdujeron con lentivirus (10 μl de sobrenadante de virus concentrado por 106 células). De 1 a 3 días después de la transducción en Cytek Aurora (en FSC (dispersión frontal)/SSC (dispersión lateral), Singlet, GFP+), se evalúa la expresión de GFP de las células para demostrar una eficiencia de transducción de al menos el 30 %.
Las células CAR-T se cultivaron durante 24 horas en Immunocult (STEMCELL Technologies; suplementado con 1% de PenStrep) en las siguientes condiciones: sin tratar, tratadas con 250 μM de adenosina o 10 mM de MNA. Tras el pretratamiento, las células CAR-T se lavaron con PBS y se combinaron con 20.000 células SK-OV-3 [ATCC; en medio McCoy 5A (Sigma-Aldrich) suplementado con 10% de FBS y 1% de PenStrep a 10: La relación efector-diana de 1 se amplificó por triplicado en medio Immunocult suplementado. Las células SK-OV-3 y las células SK-OV-3 lisadas con saponina digital (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) se utilizaron como controles negativo y positivo, respectivamente. Tras 24 horas de cocultivo, se recogió el sobrenadante y se midió la lactato deshidrogenasa (LDH) según las instrucciones del fabricante (kit de ensayo de citotoxicidad LDH Glo, Promega). El sobrenadante de LDH se diluyó 1:50 en tampón LDH. El porcentaje de eliminación se midió mediante la siguiente fórmula: porcentaje de eliminación = porcentaje de corrección / tasa máxima de eliminación x 100 %, donde el porcentaje de corrección = cocultivo - solo células T, y la tasa máxima de eliminación = control positivo - control negativo.
Como se describe en el texto o en los materiales y métodos, utilice GraphPad Prism 8, Microsoft Excel o R v3.6.0 para el análisis estadístico. Si se obtienen varias muestras del mismo paciente (como ascitis y tumor), utilizamos una prueba t pareada o incluimos al paciente como efecto aleatorio en un modelo lineal o generalizado, según corresponda. Para el análisis metabolómico, la prueba de importancia se realiza por triplicado.
Para obtener materiales complementarios a este artículo, consulte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
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Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
La MNA contribuye a la supresión inmunitaria de las células T y representa un objetivo potencial de inmunoterapia para el tratamiento del cáncer humano.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
La MNA contribuye a la supresión inmunitaria de las células T y representa un objetivo potencial de inmunoterapia para el tratamiento del cáncer humano.
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