Los metabolitos inmunomoduladores son una característica clave del microambiente tumoral (TME), pero, con algunas excepciones, su identidad sigue siendo en gran medida desconocida. En este estudio, analizamos tumores y células T de los tumores y el líquido ascítico de pacientes con carcinoma seroso de alto grado (HGSC) para revelar el metaboloma de estos diferentes compartimentos del TME. El líquido ascítico y las células tumorales presentan amplias diferencias metabólicas. En comparación con el líquido ascítico, las células T infiltrantes del tumor están significativamente enriquecidas en 1-metilnicotinamida (MNA). Si bien el nivel de MNA en las células T está elevado, la expresión de la nicotinamida N-metiltransferasa (una enzima que cataliza la transferencia de grupos metilo de la S-adenosilmetionina a la nicotinamida) se limita a los fibroblastos y las células tumorales. Funcionalmente, la MNA induce a las células T a secretar el factor de necrosis tumoral alfa, una citocina promotora del tumor. Por lo tanto, el MNA derivado del TME contribuye a la regulación inmunitaria de las células T y representa una diana potencial para la inmunoterapia en el tratamiento del cáncer humano.
Los metabolitos derivados de tumores pueden tener un profundo efecto inhibitorio sobre la inmunidad antitumoral, y cada vez hay más evidencia de que también pueden ser un factor clave en la progresión de la enfermedad (1). Además del efecto Warburg, trabajos recientes han comenzado a caracterizar el estado metabólico de las células tumorales y su relación con el estado inmunitario del microambiente tumoral (TME). Estudios en modelos de ratón y células T humanas han demostrado que el metabolismo de la glutamina (2), el metabolismo oxidativo (3) y el metabolismo de la glucosa (4) pueden actuar de forma independiente sobre varios subgrupos de células inmunitarias. Varios metabolitos en estas vías inhiben la función antitumoral de las células T. Se ha demostrado que el bloqueo de la coenzima tetrahidrobiopterina (BH4) puede dañar la proliferación de células T, y el aumento de BH4 en el organismo puede potenciar la respuesta inmunitaria antitumoral mediada por CD4 y CD8. Además, el efecto inmunosupresor de la quinurenina puede revertirse mediante la administración de BH4 (5). En el glioblastoma con mutación de la isocitrato deshidrogenasa (IDH), la secreción del enantiometabólico (R)-2-hidroxiglutarato (R-2-HG) inhibe la activación, proliferación y citólisis de las células T (6). Recientemente, se ha demostrado que el metilglioxal, un subproducto de la glucólisis, es producido por células supresoras de origen mieloide, y la transferencia de metilglioxal a las células T puede inhibir la función de las células T efectoras. En el tratamiento, la neutralización del metilglioxal puede superar la actividad de las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) y potenciar sinérgicamente la terapia de bloqueo de puntos de control en modelos murinos (7). Estos estudios, en conjunto, destacan el papel clave de los metabolitos derivados del TME en la regulación de la función y actividad de las células T.
Se ha informado ampliamente sobre la disfunción de las células T en el cáncer de ovario (8). Esto se debe en parte a las características metabólicas inherentes a la hipoxia y la vasculatura tumoral anormal (9), que resulta en la conversión de glucosa y triptófano en subproductos como el ácido láctico y la quinurenina. El exceso de lactato extracelular reduce la producción de interferón-γ (IFN-γ) e impulsa la diferenciación de subgrupos mielosupresores (10, 11). El consumo de triptófano inhibe directamente la proliferación de células T e inhibe la señalización del receptor de células T (12-14). A pesar de estas observaciones, gran parte del trabajo en torno al metabolismo inmunitario se ha realizado en cultivos de células T in vitro utilizando medios optimizados, o limitado a modelos de ratón homólogos in vivo, ninguno de los cuales refleja completamente la heterogeneidad de los cánceres humanos y el macro y microambiente fisiológico.
Una característica común del cáncer de ovario es la diseminación peritoneal y la aparición de ascitis. La acumulación de líquido celular en la ascitis se asocia con enfermedad avanzada y mal pronóstico (15). Según informes, este compartimento único es hipóxico, tiene altos niveles de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) e indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO), y está infiltrado por células T reguladoras y células mieloides inhibidoras (15-18). El entorno metabólico de la ascitis puede ser diferente al del propio tumor, por lo que la reprogramación de las células T en el espacio peritoneal no está clara. Además, las diferencias clave y la heterogeneidad entre la ascitis y los metabolitos presentes en el entorno tumoral pueden dificultar la infiltración de células inmunitarias y su función en los tumores, por lo que se necesita más investigación.
Para resolver estos problemas, diseñamos un método sensible de separación celular y cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para estudiar diferentes tipos de células (incluidas las células T CD4+ y CD8+) así como dentro y entre tumores. Sus metabolitos abarcan células en el mismo entorno de ascitis y tumor del paciente. Utilizamos este método junto con citometría de flujo de alta dimensión y secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) para proporcionar un retrato de alta resolución del estado metabólico de estas poblaciones clave. Este método reveló un aumento significativo en el nivel de 1-metilnicotinamida (MNA) en células T tumorales, y los experimentos in vitro mostraron que el efecto inmunomodulador de MNA sobre la función de las células T era previamente desconocido. En general, este método revela las interacciones metabólicas mutuas entre tumores y células inmunitarias, y proporciona información única sobre los metabolitos de regulación inmunitaria, que pueden ser útiles para el tratamiento de la inmunoterapia del cáncer de ovario basada en células T. Oportunidades de tratamiento.
Utilizamos citometría de flujo de alta dimensión para cuantificar simultáneamente la captación de glucosa [2-(N-(7-nitrofenil-2-oxa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-desoxiglucosa (2-NBDG) y la actividad mitocondrial [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) son marcadores típicos que distinguen las poblaciones de células inmunes y tumorales (Tabla S2 y Figura S1A). Este análisis mostró que, en comparación con las células T, la ascitis y las células tumorales tienen niveles más altos de captación de glucosa, pero tienen diferencias más pequeñas en la actividad mitocondrial. La captación promedio de glucosa de las células tumorales [CD45-EpCAM (EpCAM)+] es de tres a cuatro veces mayor que la de las células T, y la captación promedio de glucosa de las células T CD4+ es 1,2 veces mayor que la de las células T CD8+, lo que indica que los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) tienen diferentes requerimientos metabólicos incluso en el mismo TME (Figura 1A). En contraste, la actividad mitocondrial en las células tumorales es similar a la de las células T CD4+, y la actividad mitocondrial de ambos tipos celulares es mayor que la de las células T CD8+ (Figura 1B). En general, estos resultados revelan el nivel metabólico. La actividad metabólica de las células tumorales es mayor que la de las células T CD4+, y la actividad metabólica de las células T CD4+ es mayor que la de las células T CD8+. A pesar de estos efectos en los distintos tipos celulares, no hay una diferencia consistente en el estado metabólico de las células T CD4+ y CD8+ ni en sus proporciones relativas en la ascitis en comparación con los tumores (Figura 1C). Por el contrario, en la fracción de células CD45-, la proporción de células EpCAM+ en el tumor aumentó en comparación con la ascitis (Figura 1D). También observamos una clara diferencia metabólica entre los componentes celulares EpCAM+ y EpCAM-. Las células EpCAM+ (tumorales) tienen una mayor captación de glucosa y actividad mitocondrial que las células EpCAM-, que es mucho mayor que la actividad metabólica de los fibroblastos en las células tumorales en el TME (Figura 1, E y F).
(A y B) Intensidad de fluorescencia media (MFI) de la captación de glucosa (2-NBDG) (A) y actividad mitocondrial de células T CD4+ (MitoTracker rojo oscuro) (B) Gráficos representativos (izquierda) y datos tabulados (derecha), células T CD8+ y células tumorales EpCAM+ CD45- de ascitis y tumor. (C) La proporción de células CD4+ y CD8+ (de células T CD3+) en ascitis y tumor. (D) Proporción de células tumorales EpCAM+ en ascitis y tumor (CD45−). (E y F) Captación de glucosa (2-NBDG) de EpCAM+ CD45-tumor y EpCAM-CD45-matriz (E) y actividad mitocondrial (MitoTracker rojo oscuro) (F) gráficos representativos (izquierda) y datos tabulados (derecha) Ascitis y células tumorales. (G) Gráficos representativos de la expresión de CD25, CD137 y PD1 por citometría de flujo. (H e I) Expresión de CD25, CD137 y PD1 en células T CD4+ (H) y células T CD8+ (I). (J y K) Fenotipos de células T vírgenes, de memoria central (Tcm), efectoras (Teff) y de memoria efectora (Tem) basados ​​en la expresión de CCR7 y CD45RO. Imágenes representativas (izquierda) y datos tabulares (derecha) de células T CD4+ (J) y células T CD8+ (K) en ascitis y tumores. Valores de P determinados por la prueba t pareada (*P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001). La línea representa pacientes emparejados (n = 6). FMO, fluorescencia menos uno; MFI, intensidad de fluorescencia media.
Análisis posteriores revelaron otras diferencias significativas entre el estado fenotípico de células T altamente resuelto. Las células activadas (Figura 1, G a I) y de memoria efectora (Figura 1, J y K) en los tumores son mucho más frecuentes que en la ascitis (proporción de células T CD3+). De manera similar, el análisis del fenotipo por la expresión de marcadores de activación (CD25 y CD137) y marcadores de depleción [proteína de muerte celular programada 1 (PD1)] mostró que, aunque las características metabólicas de estas poblaciones son diferentes (Figura S1, B a E), no se observaron diferencias metabólicas significativas de manera consistente entre los subconjuntos vírgenes, efectores o de memoria (Figura S1, F a I). ​​Estos resultados fueron confirmados utilizando métodos de aprendizaje automático para asignar automáticamente fenotipos celulares (21), lo que reveló además la presencia de un gran número de células de médula ósea (CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+) en la ascitis del paciente (Figura S2A). Entre todos los tipos celulares identificados, esta población de células mieloides mostró la mayor captación de glucosa y actividad mitocondrial (Figura S2, B a G). Estos resultados resaltan las marcadas diferencias metabólicas entre los diversos tipos celulares presentes en la ascitis y los tumores de pacientes con carcinoma seroso de alto grado.
El principal desafío para comprender las características metabonómicas de los TIL radica en la necesidad de aislar muestras de células T con suficiente pureza, calidad y cantidad a partir de tumores. Estudios recientes han demostrado que los métodos de clasificación y enriquecimiento con microesferas basados ​​en citometría de flujo pueden provocar cambios en los perfiles de metabolitos celulares (22-24). Para superar este problema, optimizamos el método de enriquecimiento con microesferas para aislar los TIL de cáncer de ovario humano resecado quirúrgicamente antes del análisis mediante LC-MS/MS (véase Materiales y Métodos; Figura 2A). Con el fin de evaluar el impacto general de este protocolo en los cambios de metabolitos, comparamos los perfiles de metabolitos de las células T activadas por donantes sanos tras el paso de separación con microesferas con las células que no se separaron con microesferas pero que permanecieron en hielo. Este análisis de control de calidad reveló una alta correlación entre ambas condiciones (r = 0,77) y una alta repetibilidad técnica del grupo de 86 metabolitos (Figura 2B). Por lo tanto, estos métodos pueden realizar análisis precisos de metabolitos en células que se someten a enriquecimiento de tipo celular, proporcionando así la primera plataforma de alta resolución para identificar metabolitos específicos en HGSC, lo que permite a las personas obtener una comprensión más profunda de la especificidad celular del programa de metabolismo sexual.
(A) Diagrama esquemático del enriquecimiento con perlas magnéticas. Antes del análisis por LC-MS/MS, las células se someterán a tres rondas consecutivas de enriquecimiento con perlas magnéticas o permanecerán en hielo. (B) Efecto del tipo de enriquecimiento en la abundancia de metabolitos. Promedio de tres mediciones para cada tipo de enriquecimiento ± EE. La línea gris representa una relación 1:1. Correlación intraclase (ICC) de mediciones repetidas mostrada en la etiqueta del eje. NAD, nicotinamida adenina dinucleótido. (C) Diagrama esquemático del flujo de trabajo del análisis de metabolitos del paciente. Se recolectan ascitis o tumores de los pacientes y se crioconservan. Una pequeña porción de cada muestra se analizó mediante citometría de flujo, mientras que las muestras restantes se sometieron a tres rondas de enriquecimiento para células CD4+, CD8+ y CD45-. Estas fracciones celulares se analizaron utilizando LC-MS/MS. (D) Mapa de calor de la abundancia estandarizada de metabolitos. El dendrograma representa la agrupación de Ward de distancias euclidianas entre muestras. (E) Análisis de componentes principales (ACP) del mapa de metabolitos de la muestra, que muestra tres réplicas de cada muestra; las muestras del mismo paciente están conectadas por una línea. (F) ACP del perfil de metabolitos de la muestra condicionado al paciente (es decir, utilizando redundancia parcial); el tipo de muestra está limitado por la envolvente convexa. PC1, componente principal 1; PC2, componente principal 2.
A continuación, aplicamos este método de enriquecimiento para analizar 99 metabolitos en las fracciones de células CD4+, CD8+ y CD45- en la ascitis primaria y los tumores de seis pacientes con HGSC (Figura 2C, Figura S3A y Tablas S3 y S4). La población de interés representa entre el 2% y el 70% de la muestra original de células vivas, y la proporción de células varía considerablemente entre pacientes. Tras separar las microesferas, la fracción enriquecida de interés (CD4+, CD8+ o CD45-) representa, en promedio, más del 85% de todas las células vivas en la muestra. Este método de enriquecimiento nos permite analizar poblaciones celulares del metabolismo del tejido tumoral humano, algo imposible de hacer con muestras grandes. Mediante este protocolo, determinamos que la l-quinurenina y la adenosina, dos metabolitos inmunosupresores bien caracterizados, se encontraban elevadas en las células T tumorales o en las células tumorales (Figura S3, B y C). Por lo tanto, estos resultados demuestran la fiabilidad y la capacidad de nuestra tecnología de separación celular y espectrometría de masas para encontrar metabolitos biológicamente importantes en los tejidos de los pacientes.
Nuestro análisis también reveló una fuerte separación metabólica de los tipos celulares dentro y entre pacientes (Figura 2D y Figura S4A). En particular, en comparación con otros pacientes, el paciente 70 mostró características metabólicas diferentes (Figura 2E y Figura S4B), lo que indica que puede haber una heterogeneidad metabólica sustancial entre pacientes. Cabe destacar que, en comparación con otros pacientes (1,2 a 2 litros; Tabla S1), la cantidad total de ascitis recolectada en el paciente 70 (80 ml) fue menor. El control de la heterogeneidad entre pacientes durante el análisis de componentes principales (por ejemplo, utilizando el análisis de redundancia parcial) muestra cambios consistentes entre los tipos celulares, y los tipos celulares y/o el microambiente se agregan claramente según el perfil de metabolitos (Figura 2F). El análisis de metabolitos individuales enfatizó estos efectos y reveló diferencias significativas entre los tipos celulares y el microambiente. Cabe destacar que la diferencia más extrema observada es MNA, que generalmente está enriquecido en células CD45- y en células CD4+ y CD8+ que infiltran el tumor (Figura 3A). En las células CD4+, este efecto es más evidente, y el MNA en las células CD8+ también parece verse fuertemente afectado por el entorno. Sin embargo, esto no es relevante, ya que solo se pudieron evaluar los puntajes de CD8+ tumorales en tres de los seis pacientes. Además del MNA, en diferentes tipos de células en la ascitis y los tumores, otros metabolitos poco caracterizados en los TIL también presentan una alta concentración (Figuras S3 y S4). Por lo tanto, estos datos revelan un conjunto prometedor de metabolitos inmunomoduladores para futuras investigaciones.
(A) Contenido normalizado de MNA en células CD4+, CD8+ y CD45- de ascitis y tumor. El diagrama de caja muestra la mediana (línea), el rango intercuartil (marco de bisagra) y el rango de datos, hasta 1,5 veces el rango intercuartil (marco de bigotes). Como se describe en Materiales y métodos del paciente, utilice el valor limma del paciente para determinar el valor P (*P<0,05 y **P<0,01). (B) Diagrama esquemático del metabolismo de MNA (60). Metabolitos: S-adenosil-1-metionina; SAH, S-adenosina-1-homocisteína; NA, nicotinamida; MNA, 1-metilnicotinamida; 2-PY, 1-metil-2-piridona-5-carboxamida; 4-PY, 1-metil-4-piridona-5-carboxamida; NR, ribosa de nicotinamida; NMN, mononucleótido de nicotinamida. Enzimas (verde): NNMT, nicotinamida N-metiltransferasa; SIRT, sirtuinas; NAMPT, nicotinamida fosforribosil transferasa; AOX1, aldehído oxidasa 1; NRK, nicotinamida ribósido quinasa; NMNAT, nicotinamida mononucleótido adenilato transferasa; Pnp1, purina nucleósido fosforilasa. (C) t-SNE de scRNA-seq de ascitis (gris) y tumor (rojo; n = 3 pacientes). (D) Expresión de NNMT en diferentes poblaciones celulares identificadas mediante scRNA-seq. (E) Expresión de NNMT y AOX1 en SK-OV-3, riñón embrionario humano (HEK) 293T, células T y células T tratadas con MNA. La expresión plegada se muestra en relación con SK-OV-3. Se muestra el patrón de expresión con SEM (n = 6 donantes sanos). Los valores de Ct mayores de 35 se consideran indetectables (UD). (F) Expresión de SLC22A1 y SLC22A2 en SK-OV-3, HEK293T, células T y células T tratadas con 8 mM de MNA. La expresión plegada se muestra en relación con SK-OV-3. Se muestra el patrón de expresión con SEM (n = 6 donantes sanos). Los valores de Ct mayores de 35 se consideran indetectables (UD). (G) Contenido celular de MNA en células T activadas de donantes sanos después de 72 horas de incubación con MNA. Se muestra el patrón de expresión con SEM (n = 4 donantes sanos).
El MNA se produce mediante la transferencia del grupo metilo de la S-adenosil-1-metionina (SAM) a la nicotinamida (NA) por la nicotinamida N-metiltransferasa (NNMT; Figura 3B). La NNMT se sobreexpresa en una variedad de cánceres humanos y se asocia con la proliferación, la invasión y la metástasis (25-27). Para comprender mejor el origen del MNA en las células T en el TME, utilizamos scRNA-seq para caracterizar la expresión de NNMT en diferentes tipos celulares en la ascitis y los tumores de tres pacientes con HGSC (Tabla S5). El análisis de aproximadamente 6500 células mostró que, en la ascitis y los entornos tumorales, la expresión de NNMT se restringía a las poblaciones presuntamente fibroblastos y células tumorales (Figura 3, C y D). Cabe destacar que no hay una expresión evidente de NNMT en ninguna población que exprese PTPRC (CD45+) (Figura 3D y Figura S5A), lo que indica que el MNA detectado en el espectro de metabolitos se ha introducido en las células T. La expresión de la aldehído oxidasa 1 (AOX1) convierte MNA en 1-metil-2-piridona-5-carboxamida (2-PYR) o 1-metil-4-piridona-5-carboxamida (4-PYR); Figura 3B) también está restringida a la población de fibroblastos que expresan COL1A1 (Figura S5A), lo que en conjunto indica que las células T carecen de la capacidad del metabolismo convencional de MNA. El patrón de expresión de estos genes relacionados con MNA se verificó utilizando un segundo conjunto de datos celulares independientes de ascitis de pacientes con HGSC (Figura S5B; n = 6) (16). Además, el análisis de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) de células T de donantes sanos tratadas con MNA mostró que, en comparación con las células tumorales ováricas de control SK-OV-3, NNMT o AOX1 casi no se expresaban (Figura 3E). Estos resultados inesperados indican que MNA puede ser secretado por fibroblastos o tumores hacia las células T adyacentes en TME.
Aunque los candidatos incluyen la familia de transportadores de cationes orgánicos 1 a 3 (OCT1, OCT2 y OCT3) codificados por la familia de transportadores solubles 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 y SLC22A3), los transportadores potenciales de MNA aún no están definidos (28). La qPCR del ARNm de células T de donantes sanos mostró bajos niveles de expresión de SLC22A1 pero niveles indetectables de SLC22A2, lo que confirmó que se había informado previamente en la literatura (Figura 3F) (29). Por el contrario, la línea celular de tumor ovárico SK-OV-3 expresó altos niveles de ambos transportadores (Figura 3F).
Para evaluar la capacidad de las células T para absorber MNA exógeno, se cultivaron células T de donantes sanos durante 72 horas en presencia de diferentes concentraciones de MNA. En ausencia de MNA exógeno, no se detectó el contenido celular de MNA (Figura 3G). Sin embargo, las células T activadas tratadas con MNA exógeno mostraron un aumento dosis-dependiente del contenido de MNA en las células, hasta 6 mM (Figura 3G). Este resultado indica que, a pesar del bajo nivel de expresión del transportador y la ausencia de la enzima principal responsable del metabolismo intracelular del MNA, los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) aún pueden captar MNA.
El espectro de metabolitos en las células T de los pacientes y los experimentos de absorción de MNA in vitro aumentan la posibilidad de que los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) secreten MNA y que las células tumorales puedan regular el fenotipo y la función de los TIL. Para determinar el efecto del MNA en las células T, se activaron células T de donantes sanos in vitro en presencia o ausencia de MNA, y se evaluó su proliferación y producción de citocinas. Después de 7 días de añadir MNA a la dosis más alta, el número de duplicación de la población se redujo moderadamente, mientras que el vigor se mantuvo en todas las dosis (Figura 4A). Además, el tratamiento con MNA exógeno resultó en un aumento en la proporción de células T CD4+ y CD8+ que expresan factor de necrosis tumoral-α (TNFα; Figura 4B). Por el contrario, la producción intracelular de IFN-γ se redujo significativamente en las células T CD4+, pero no en las células T CD8+, y no hubo cambios significativos en la interleucina 2 (IL-2; Figura 4, C y D). Por lo tanto, el ensayo inmunoenzimático (ELISA) de los sobrenadantes de estos cultivos de células T tratadas con MNA mostró un aumento significativo de TNFα, una disminución de IFN-γ y ningún cambio de IL-2 (Figura 4, E a G). La disminución de IFN-γ indica que MNA puede desempeñar un papel en la inhibición de la actividad antitumoral de las células T. Para simular el efecto de MNA en la citotoxicidad mediada por células T, se producen células T con receptor de antígeno quimérico (FRα-CAR-T) dirigidas al receptor de folato α y células CAR-T (GFP) reguladas por proteína fluorescente verde (GFP) -CAR-T) a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes sanos. Las células CAR-T se cultivaron durante 24 horas en presencia de MNA y luego se cocultivaron con células tumorales ováricas humanas SK-OV-3 que expresan el receptor de folato α en una proporción efector a diana de 10:1. El tratamiento con MNA produjo una disminución significativa en la actividad asesina de las células FRα-CAR-T, que fue similar a la de las células FRα-CAR-T tratadas con adenosina (Figura 4H).
(A) Recuento total de células viables y duplicación de población (DP) directamente del cultivo en el día 7. El gráfico de barras representa la media + SEM de seis donantes sanos. Representa datos de al menos n = 3 experimentos independientes. (B a D) Se utilizaron CD3/CD28 e IL-2 para activar las células T en sus respectivas concentraciones de MNA durante 7 días. Antes del análisis, las células se estimularon con PMA/ionomicina con GolgiStop durante 4 horas. Expresión de TNFα (B) en células T. Imagen de ejemplo (izquierda) y datos tabulares (derecha) de la expresión de TNFα en células vivas. Expresión de IFN-γ (C) e IL-2 (D) en células T. La expresión de citocinas se midió mediante citometría de flujo. El gráfico de barras representa la media (n = 6 donantes sanos) + SEM. Utilice análisis de varianza unidireccional y medidas repetidas (*P<0,05 y **P<0,01) para determinar el valor de P. Representa datos de al menos n = 3 experimentos independientes. (E a ​​G) Se utilizaron CD3/CD28 e IL-2 para activar células T en sus respectivas concentraciones de MNA durante 7 días. El medio se recolectó antes y después de 4 horas de estimulación con PMA/ionomicina. Las concentraciones de TNFα (E), IFN-γ (F) e IL-2 (G) se midieron mediante ELISA. El gráfico de barras representa la media (n = 5 donantes sanos) + SEM. El valor de P se determinó mediante análisis de varianza unidireccional y mediciones repetidas (*P<0,05). La línea punteada indica el límite de detección de la detección. (H) Ensayo de lisis celular. Las células FRα-CAR-T o GFP-CAR-T se ajustaron con adenosina (250 μM) o MNA (10 mM) durante 24 horas, o se dejaron sin tratar (Ctrl). Se midió el porcentaje de muerte de las células SK-OV-3. Valor p determinado mediante la prueba t de Welch (*P<0,5 y **P<0,01).
Para obtener una comprensión mecanicista de la regulación de la expresión de TNFα dependiente de MNA, se evaluaron los cambios en el ARNm de TNFα de células T tratadas con MNA (Figura 5A). Las células T de donantes sanos tratadas con MNA mostraron un aumento de dos veces en los niveles de transcripción de TNFα, lo que indica que MNA es dependiente de la regulación transcripcional de TNFα. Para investigar este posible mecanismo regulador, se evaluaron dos factores de transcripción conocidos que regulan TNFα, a saber, el factor nuclear de células T activadas (NFAT) y la proteína específica 1 (Sp1), en respuesta a la unión de MNA al promotor proximal de TNFα (30). El promotor de TNFα contiene 6 sitios de unión de NFAT identificados y 2 sitios de unión de Sp1, superpuestos en un sitio [-55 pares de bases (pb) desde la caperuza 5'] (30). La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) mostró que cuando se trató con MNA, la unión de Sp1 al promotor de TNFα aumentó tres veces. La incorporación de NFAT también aumentó y alcanzó una importancia considerable (Figura 5B). Estos datos indican que MNA regula la expresión de TNFα a través de la transcripción de Sp1 y, en menor medida, la expresión de NFAT.
(A) Comparado con las células T cultivadas sin MNA, el cambio de pliegue de la expresión de TNFα en células T tratadas con MNA. Se muestra el patrón de expresión con SEM (n = 5 donantes sanos). Representa datos de al menos n = 3 experimentos independientes. (B) El promotor de TNFα de células T tratadas con o sin 8 mM de MNA después de que NFAT y Sp1 se combinaron con (Ctrl) y estimulación con PMA/ionomicina durante 4 horas. La inmunoglobulina G (IgG) y H3 se utilizaron como controles negativo y positivo para la inmunoprecipitación, respectivamente. La cuantificación de ChIP mostró que la unión de Sp1 y NFAT al promotor de TNFα en células tratadas con MNA aumentó varias veces en comparación con el control. Representa datos de al menos n = 3 experimentos independientes. Valor de P determinado por múltiples pruebas t (*** P <0,01). (C) En comparación con la ascitis de HGSC, las células T (no citotóxicas) mostraron una mayor expresión de TNF en el tumor. Los colores representan diferentes pacientes. Las células mostradas se han muestreado aleatoriamente a 300 y se han desplazado para limitar la sobreexposición (** Padj = 0,0076). (D) Modelo propuesto de MNA para el cáncer de ovario. El MNA se produce en las células tumorales y los fibroblastos en el TME y es captado por las células T. El MNA aumenta la unión de Sp1 al promotor de TNFα, lo que conduce a un aumento de la transcripción de TNFα y la producción de la citocina TNFα. El MNA también causa una disminución de IFN-γ. La inhibición de la función de las células T conduce a una capacidad de eliminación reducida y un crecimiento tumoral acelerado.
Según los informes, el TNFα tiene efectos antitumorales dependientes tanto del frente como de la parte posterior, pero tiene un papel bien conocido en la promoción del crecimiento y la metástasis del cáncer de ovario (31-33). Según los informes, la concentración de TNFα en la ascitis y los tejidos tumorales en pacientes con cáncer de ovario es mayor que en los tejidos benignos (34-36). En términos de mecanismo, el TNFα puede regular la activación, la función y la proliferación de los glóbulos blancos, y cambiar el fenotipo de las células cancerosas (37, 38). En consonancia con estos hallazgos, el análisis de expresión génica diferencial mostró que el TNF estaba significativamente regulado al alza en las células T en los tejidos tumorales en comparación con la ascitis (Figura 5C). El aumento en la expresión de TNF solo fue evidente en poblaciones de células T con un fenotipo no citotóxico (Figura S5A). En resumen, estos datos respaldan la visión de que el MNA tiene efectos duales inmunosupresores y promotores de tumores en el HGSC.
El marcaje fluorescente basado en citometría de flujo se ha convertido en el método principal para estudiar el metabolismo de los TIL. Estos estudios han demostrado que, en comparación con los linfocitos de sangre periférica o las células T de órganos linfoides secundarios, los TIL murinos y humanos tienen una mayor tendencia a captar glucosa (4, 39) y la pérdida gradual de la función mitocondrial (19, 40). Aunque hemos observado resultados similares en este estudio, el desarrollo clave es comparar el metabolismo de las células tumorales y los TIL del mismo tejido tumoral resecado. De acuerdo con algunos de estos informes previos, las células tumorales (CD45-EpCAM+) de ascitis y tumores tienen una mayor captación de glucosa que las células T CD8+ y CD4+, lo que apoya que la alta captación de glucosa de las células tumorales puede compararse con las células T. El concepto de competencia de células T. TME. Sin embargo, la actividad mitocondrial de las células tumorales es mayor que la de las células T CD8+, pero la actividad mitocondrial es similar a la de las células T CD4+. Estos resultados refuerzan el tema emergente de que el metabolismo oxidativo es importante para las células tumorales (41, 42). También sugieren que las células T CD8+ pueden ser más susceptibles a la disfunción oxidativa que las células T CD4+, o que las células T CD4+ pueden usar fuentes de carbono distintas de la glucosa para mantener la actividad mitocondrial (43, 44). Cabe señalar que no observamos diferencias en la captación de glucosa o la actividad mitocondrial entre las células T efectoras CD4+, las células T de memoria efectora y las células T de memoria central en la ascitis. De manera similar, el estado de diferenciación de las células T CD8+ en los tumores no tiene nada que ver con los cambios en la captación de glucosa, lo que resalta la diferencia significativa entre las células T cultivadas in vitro y los TIL humanos in vivo (22). Estas observaciones también fueron confirmadas por el uso de la asignación automática imparcial de poblaciones celulares, que reveló además que las células CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+ con mayor captación de glucosa y actividad mitocondrial que las células tumorales son prevalentes pero tienen una población celular metabólicamente activa. Esta población podría representar la presunta subpoblación de células supresoras mieloides o células dendríticas plasmocitoides identificadas en el análisis de scRNA-seq. Aunque ambas se han descrito en tumores ováricos humanos [45], aún se necesita más investigación para describir esta subpoblación mieloide.
Aunque los métodos basados ​​en citometría de flujo pueden aclarar las diferencias generales en el metabolismo de la glucosa y oxidativo entre los tipos de células, aún no se han determinado los metabolitos precisos producidos por la glucosa u otras fuentes de carbono para el metabolismo mitocondrial en el TME. Asignar la presencia o ausencia de metabolitos a un subconjunto de TIL determinado requiere la purificación de la población celular del tejido extirpado. Por lo tanto, nuestro método de enriquecimiento celular combinado con espectrometría de masas puede proporcionar información sobre los metabolitos que se enriquecen diferencialmente en las poblaciones de células T y células tumorales en muestras de pacientes coincidentes. Aunque este método tiene ventajas sobre la clasificación celular activada por fluorescencia, ciertas bibliotecas de metabolitos pueden verse afectadas debido a la estabilidad inherente y/o la rápida tasa de recambio (22). Sin embargo, nuestro método pudo identificar dos metabolitos inmunosupresores reconocidos, la adenosina y la quinurenina, porque varían mucho entre los tipos de muestras.
Nuestro análisis metabonómico de tumores y subtipos de TIL proporciona más información sobre el papel de los metabolitos en el TME ovárico. Primero, mediante citometría de flujo, determinamos que no había diferencia en la actividad mitocondrial entre tumores y células T CD4+. Sin embargo, el análisis LC-MS/MS reveló cambios significativos en la abundancia de metabolitos entre estas poblaciones, lo que indica que las conclusiones sobre el metabolismo de los TIL y su actividad metabólica general requieren una interpretación cuidadosa. Segundo, el MNA es el metabolito con la mayor diferencia entre las células CD45- y las células T en ascitis, no en tumores. Por lo tanto, la compartimentalización y la localización del tumor pueden tener diferentes efectos en el metabolismo de los TIL, lo que resalta la posible heterogeneidad en un microambiente determinado. Tercero, la expresión de la enzima productora de MNA, NNMT, se limita principalmente a los CAF, que son células tumorales en menor medida, pero se observan niveles detectables de MNA en células T derivadas de tumores. La sobreexpresión de NNMT en CAF ováricos tiene un conocido efecto promotor del cáncer, debido en parte a la promoción del metabolismo de CAF, la invasión tumoral y la metástasis (27). Aunque el nivel general de TIL es moderado, la expresión de NNMT en CAF está estrechamente relacionada con el subtipo mesenquimal del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA), que se asocia con un mal pronóstico (27, 46, 47). Finalmente, la expresión de la enzima AOX1 responsable de la degradación de MNA también se limita a la población de CAF, lo que indica que las células T carecen de la capacidad de metabolizar MNA. Estos resultados respaldan la idea de que, aunque se necesita más trabajo para verificar este hallazgo, los altos niveles de MNA en las células T pueden indicar la presencia de un microambiente inmunosupresor en CAF.
Dado el bajo nivel de expresión de los transportadores de MNA y los niveles indetectables de proteínas clave implicadas en el metabolismo del MNA, la presencia de MNA en las células T resulta inesperada. Ni NNMT ni AOX1 pudieron detectarse mediante análisis de scRNA-seq y qPCR dirigida en dos cohortes independientes. Estos resultados indican que el MNA no es sintetizado por las células T, sino absorbido del microambiente tumoral circundante. Los experimentos in vitro muestran que las células T tienden a acumular MNA exógeno.
Nuestros estudios in vitro han demostrado que el MNA exógeno induce la expresión de TNFα en células T y potencia la unión de Sp1 al promotor de TNFα. Aunque el TNFα tiene funciones tanto antitumorales como antitumorales, en el cáncer de ovario puede promover su crecimiento (31-33). La neutralización del TNFα en cultivos de células tumorales ováricas o la eliminación de la señal de TNFα en modelos murinos pueden mejorar la producción de citocinas inflamatorias mediada por TNFα e inhibir el crecimiento tumoral (32, 35). Por lo tanto, en este caso, el MNA derivado del TME puede actuar como un metabolito proinflamatorio a través de un mecanismo dependiente de TNFα mediante el bucle autocrino, promoviendo así la aparición y la propagación del cáncer de ovario (31). Basándonos en esta posibilidad, el bloqueo de TNFα se está estudiando como un posible agente terapéutico para el cáncer de ovario (37, 48, 49). Además, el MNA reduce la citotoxicidad de las células CAR-T contra las células tumorales ováricas, lo que aporta más evidencia de la inmunosupresión mediada por MNA. En conjunto, estos resultados sugieren un modelo en el que los tumores y las células CAF secretan MNA al microambiente tumoral extracelular. Mediante (i) la estimulación del crecimiento del cáncer de ovario inducida por TNF y (ii) la inhibición de la actividad citotóxica de las células T inducida por MNA, esto podría tener un doble efecto tumoral (Figura 5D).
En conclusión, mediante la aplicación de una combinación de enriquecimiento celular rápido, secuenciación de células individuales y perfil metabólico, este estudio reveló las enormes diferencias inmunometabolomáticas entre tumores y células ascíticas en pacientes con HGSC. Este análisis exhaustivo mostró que existen diferencias en la captación de glucosa y la actividad mitocondrial entre las células T, e identificó el MNA como un metabolito inmunorregulador no autónomo celular. Estos datos tienen un impacto en cómo el TME afecta el metabolismo de las células T en cánceres humanos. Si bien se ha informado de la competencia directa por nutrientes entre las células T y las células cancerosas, los metabolitos también pueden actuar como reguladores indirectos para promover la progresión tumoral y posiblemente suprimir las respuestas inmunitarias endógenas. Una descripción más detallada del papel funcional de estos metabolitos reguladores podría abrir nuevas estrategias para potenciar la respuesta inmunitaria antitumoral.
Las muestras de pacientes y los datos clínicos se obtuvieron a través del repositorio de tejido tumoral de cáncer de BC certificado por la Red Canadiense de Repositorios de Tejidos. De acuerdo con el protocolo aprobado por el Comité de Ética de Investigación del Cáncer de BC y la Universidad de Columbia Británica (H07-00463), todas las muestras y datos clínicos de los pacientes obtuvieron el consentimiento informado por escrito o renunciaron formalmente a su consentimiento. Las muestras se almacenan en el Biobanco certificado (BRC-00290). Las características detalladas de los pacientes se muestran en las Tablas S1 y S5. Para la criopreservación, se utiliza un bisturí para descomponer mecánicamente la muestra tumoral del paciente y luego pasarla a través de un filtro de 100 micras para obtener una suspensión de células individuales. La ascitis del paciente se centrifugó a 1500 rpm durante 10 minutos a 4 °C para sedimentar las células y eliminar el sobrenadante. Las células obtenidas del tumor y del líquido ascítico se crioconservaron en una solución de suero humano AB inactivado por calor al 50 % (Sigma-Aldrich), medio RPMI-1640 al 40 % (Thermo Fisher Scientific) y dimetilsulfóxido al 10 %. Estas suspensiones de células individuales se descongelaron y se utilizaron para los análisis metabolómicos y la determinación de metabolitos que se describen a continuación.
El medio completo consiste en RPMI 1640: AimV 50:50 filtrado a 0,22 μm suplementado. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific) suplementado con 10% de suero humano AB inactivado por calor (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific), 1 x solución de penicilina-estreptomicina (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) y 50 μMB-mercaptoetanol. AimV (Invitrogen) se suplementa con 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) y 2 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific). El tampón de tinción para citometría de flujo consistió en solución salina tamponada con fosfato (PBS; Invitrogen) filtrada a 0,22 μm y suplementada con suero humano AB inactivado por calor al 3 % (Sigma). El tampón de enriquecimiento celular se compone de PBS filtrada a 0,22 μm y suplementada con suero humano AB inactivado por calor al 0,5 % (Sigma-Aldrich).
En medio completo a 37 °C, las células se tiñeron con 10 nM de MT DR y 100 μM de 2-NBDG durante 30 minutos. A continuación, las células se tiñeron con el colorante de viabilidad eF506 a 4 °C durante 15 minutos. Resuspenda las células en FC Block (eBioscience) y Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), diluya en tampón de tinción para citometría de flujo (según las instrucciones del fabricante) e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tiña las células con un conjunto de anticuerpos (Tabla S2) en tampón de tinción para citometría de flujo a 4 °C durante 20 minutos. Resuspenda las células en tampón de tinción para citometría de flujo (Cytek Aurora; configuración 3L-16V-14B-8R) antes del análisis. Utilice SpectroFlo y FlowJo V10 para analizar los datos de recuento celular y GraphPad Prism 8 para crear los datos. La intensidad de fluorescencia media (IFM) de 2-NBDG y MT DR se normalizó mediante logaritmo, y posteriormente se utilizó una prueba t pareada para el análisis estadístico, teniendo en cuenta los pacientes emparejados. Se excluyeron del análisis todas las poblaciones con menos de 40 eventos; se asignó un valor de IFM de 1 a cualquier valor negativo antes de realizar el análisis estadístico y la visualización de datos.
Para complementar la estrategia de selección manual del panel de procesos anterior, utilizamos la anotación completa mediante el árbol de restricción de forma (FAUST) (21) para asignar automáticamente las células a la población tras eliminar las células muertas en FlowJo. Gestionamos manualmente la salida para fusionar las poblaciones que parecen estar mal asignadas (combinando células tumorales PD1+ con PD1-) y las poblaciones retenidas. Cada muestra contiene un promedio de más del 2 % de células, para un total de 11 poblaciones.
Se utilizó la centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll para separar las PBMC de los productos de separación de leucocitos (STEMCELL Technologies). Las células T CD8+ se aislaron de las PBMC utilizando microesferas CD8 (Miltenyi) y se expandieron en medio completo utilizando TransAct (Miltenyi) durante 2 semanas según las instrucciones del fabricante. Las células se dejaron reposar durante 5 días en medio completo que contenía IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), y luego se reestimularon con TransAct. El día 7, según las instrucciones del fabricante, se utilizaron microesferas CD45 humanas (Miltenyi) para enriquecer las células en tres rondas consecutivas. Las células se alicuotaron para el análisis de citometría de flujo (como se describió anteriormente), y un millón de células se alicuotaron tres veces para el análisis LC-MS/MS. Las muestras se procesaron mediante LC-MS/MS como se describe a continuación. Estimamos el valor del metabolito faltante con un número de iones de 1000. Cada muestra se normaliza mediante el número total de iones (TIC), se convierte logarítmicamente y se normaliza automáticamente en MetaboAnalystR antes del análisis.
La suspensión de células individuales de cada paciente se descongeló y filtró a través de un filtro de 40 μm en medio completo (como se describió anteriormente). Según el protocolo del fabricante, se utilizaron tres rondas consecutivas de selección positiva mediante separación con perlas magnéticas utilizando MicroBeads (Miltenyi) para enriquecer las muestras con células CD8+, CD4+ y CD45- (en hielo). En resumen, las células se resuspendieron en tampón de enriquecimiento celular (como se describió anteriormente) y se contaron. Las células se incubaron con perlas humanas CD8, perlas humanas CD4 o perlas humanas CD45 (Miltenyi) a 4 °C durante 15 minutos y luego se lavaron con tampón de enriquecimiento celular. La muestra se pasó a través de la columna LS (Miltenyi) y se recogieron las fracciones positivas y negativas. Para reducir la duración y maximizar la recuperación celular, la fracción CD8 se utilizó para la segunda ronda de enriquecimiento de CD4+ y la fracción CD4 para el posterior enriquecimiento de CD45. Mantenga la solución en hielo durante todo el proceso de separación.
Para preparar las muestras para el análisis de metabolitos, las células se lavaron una vez con solución salina helada y se añadió 1 ml de metanol al 80% a cada muestra. A continuación, se agitaron en un vórtex y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Las muestras se sometieron a tres ciclos de congelación-descongelación y se centrifugaron a 14 000 rpm durante 15 minutos a 4 °C. El sobrenadante que contenía los metabolitos se evaporó hasta sequedad. Los metabolitos se redisolvieron en 50 μl de ácido fórmico al 0,03%, se agitaron en un vórtex para mezclarlos y, a continuación, se centrifugaron para eliminar los residuos.
Extraiga los metabolitos como se describió anteriormente. Transfiera el sobrenadante a un frasco de cromatografía líquida de alto rendimiento para la investigación metabolómica. Utilice un protocolo de tratamiento aleatorio para tratar cada muestra con un número similar de células y así evitar efectos de lote. Realizamos una evaluación cualitativa de los metabolitos globales previamente publicados en el espectrómetro de masas de triple cuadrupolo AB SCIEX QTRAP 5500 (50). El análisis cromatográfico y la integración del área de los picos se realizaron utilizando el software MultiQuant versión 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Se utilizó un recuento de iones de 1000 para estimar el valor del metabolito faltante, y el TIC de cada muestra se utilizó para calcular el área de pico normalizada de cada metabolito detectado para corregir los cambios introducidos por el análisis instrumental del procesamiento de la muestra. Después de que el TIC se normaliza, se utiliza MetaboAnalystR(51) (parámetro predeterminado) para la conversión logarítmica y el escalado automático de la línea normal. Utilizamos PCA con el paquete vegan R para realizar un análisis exploratorio de las diferencias del metaboloma entre los tipos de muestras, y utilizamos el análisis de redundancia parcial para analizar a los pacientes. Utilizamos el método de Ward para construir un dendrograma de mapa de calor para agrupar la distancia euclidiana entre las muestras. Utilizamos limma (52) en la abundancia de metabolitos estandarizada para identificar metabolitos diferencialmente abundantes en todo el tipo de célula y el microambiente. Para simplificar la explicación, utilizamos el parámetro de media de grupo para especificar el modelo, y consideramos los tipos de células en el microambiente como cada grupo (n = 6 grupos); Para la prueba de significancia, realizamos tres mediciones repetidas para cada metabolito. Para evitar la replicación falsa, el paciente se incluyó como un obstáculo en el diseño limma. Para verificar las diferencias en los metabolitos entre diferentes pacientes, ajustamos el modelo limma incluyendo pacientes de forma fija. Informamos la significancia del contraste preespecificado entre el tipo de célula y el microambiente de Padj <0,05 (corrección de Benjamini-Hochberg).
Después del enriquecimiento de vigor utilizando el kit de eliminación de células muertas de Miltenyi (>80% de viabilidad), se realizó la secuenciación del transcriptoma de células individuales en las muestras totales de ascitis y tumor congeladas vivas utilizando un protocolo de expresión génica 5′ 10x. Se analizaron cinco casos con tumores y ascitis coincidentes, aunque la baja viabilidad de una muestra de tumor impidió su inclusión. Para lograr múltiples selecciones de pacientes, combinamos las muestras de cada paciente en los carriles del controlador de cromo 10x y analizamos los sitios de ascitis y tumor por separado. Después de la secuenciación [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), Quebec genome; un promedio de 73,488 y 41,378 lecturas por célula para tumor y ascitis respectivamente]], utilizamos CellSNP y Vireo (53) (basado en CellSNP como El SNP humano común (VCF) proporcionado por GRCh38 se asigna a una identidad de donante. Utilizamos SNPRelate para inferir la identidad más cercana (IBS) del estado del genotipo del paciente (IBS), excluyendo células no asignadas y células identificadas como dúplex y donantes coincidentes entre muestras de ascitis y tumor (54). Sobre la base de esta tarea, conservamos tres casos con abundante representación celular en el tumor y ascitis para el análisis posterior. Después de realizar un paso de filtrado masivo en el paquete BioConductor scater (55) y scran (56), esto produjo 6975 células (2792 y 4183 células de tumor y ascitis, respectivamente) para el análisis. Utilizamos la agrupación de Louvain de igraph (57) de la red de vecinos más cercanos compartida (SNN) basada en Distancia de Jaccard para agrupar células por expresión. Los grupos se anotaron manualmente a tipos celulares putativos basándose en la expresión de genes marcadores y se visualizaron con t-SNE. Las células T citotóxicas se definen por la expresión de CD8A y GZMA, excluyendo los subgrupos con baja expresión de proteína ribosómica. Accedimos a los datos publicados de Izar et al. (16), incluyendo su incrustación t-SNE, que puede controlar la superposición de expresión entre marcadores de células inmunes y la expresión de NNMT.
Las PBMC se separaron de los productos de separación de leucocitos (STEMCELL Technologies) mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll. Las células CD3+ se aislaron de las PBMC utilizando microesferas CD3 (Miltenyi). En presencia o ausencia de MNA, las células CD3+ se activaron con CD3 inmovilizado en placa (5 μg/ml), CD28 soluble (3 μg/ml) e IL-2 (300 U/ml; Proleukin). El último día de expansión, se evaluó la viabilidad (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) y la proliferación (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) mediante citometría de flujo. Evalúe la función efectora estimulando las células con PMA (20 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml) con GolgiStop durante 4 horas, y monitorice CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4, BioLegend) y TNFα-isotiocianato de fluoresceína (FITC) (MAb11, BD). Estimule las células de qPCR y ChIP con PMA (20 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml) durante 4 horas. El sobrenadante de ELISA se recogió antes y después de la estimulación con PMA (20 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml) durante 4 horas.
Siga el protocolo del fabricante para aislar el ARN utilizando el kit RNeasy Plus Mini (QIAGEN). Utilice QIAshredder (QIAGEN) para homogeneizar la muestra. Utilice el kit de ARN a ADNc de alta capacidad (Thermo Fisher Scientific) para sintetizar ADN complementario (ADNc). Utilice TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) para cuantificar la expresión génica (según el protocolo del fabricante) con las siguientes sondas: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliceraldehído-3-fosfato de hidrógeno (GAPDH)] y Hs01010726_m1 (SLC22A2). Las muestras se analizaron en el sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems) en la placa de reacción óptica rápida MicroAmp de 96 pocillos (Applied Biosystems) con película óptica MicroAmp. Cualquier valor de Ct superior a 35 se considera por encima del umbral de detección y se marca como indetectable.
Realice ChIP como se describió previamente (58). En resumen, las células se trataron con formaldehído (concentración final 1,42%) y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Use tampón de hinchamiento suplementado (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl y 0,1% NP-40) en hielo durante 10 minutos, luego resuspenda en tampón de inmunoprecipitación como se describe (58). Luego la muestra se sonicó con los siguientes ciclos: 10 ciclos (20 pulsos de 1 segundo) y un tiempo estático de 40 segundos. Incube los anticuerpos de grado ChIP inmunoglobulina G (Cell Signaling Technology; 1 μl), histona H3 (Cell Signaling Technology; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) y SP1 (Cell Signaling Technology; 3 μl) con la muestra a 4 °C agitando durante toda la noche. Incubar perlas de proteína A (Thermo Fisher Scientific) con la muestra a 4 °C con agitación suave durante 1 hora, luego usar perlas de Chelex (Bio-Rad) para enriquecer el ADN y usar proteinasa K (Thermo Fisher) para la digestión de proteínas. El promotor de TNFα se detectó por PCR: sentido directo, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; sentido inverso, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (producto de 207 pb). Las imágenes se produjeron con Image Lab (Bio-Rad) y se cuantificaron con el software ImageJ.
El sobrenadante del cultivo celular se recolectó como se describió anteriormente. La determinación se realizó siguiendo los procedimientos del fabricante para los kits ELISA de TNFα humano (Invitrogen), IL-2 humano (Invitrogen) e IFN-γ humano (Abcam). Según el protocolo del fabricante, el sobrenadante se diluyó 1:100 para detectar TNFα e IL-2, y 1:3 para detectar IFN-γ. Se utilizó el lector multietiqueta EnVision 2104 (PerkinElmer) para medir la absorbancia a 450 nm.
Las PBMC se separaron de los productos de separación de leucocitos (STEMCELL Technologies) mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll. Las células CD3+ se aislaron de las PBMC utilizando perlas CD3 (Miltenyi). En presencia o ausencia de MNA, las células CD3+ se activaron con CD3 unido a placa (5 μg/ml), CD28 soluble (3 μg/ml) e IL-2 (300 U/ml; Proleukin) durante 3 días. Después de 3 días, las células se recolectaron y lavaron con solución salina al 0,9%, y el sedimento se congeló rápidamente. El recuento celular se realizó mediante citometría de flujo (Cytek Aurora; configuración 3L-16V-14B-8R) utilizando perlas electrónicas 123count.
Extraer los metabolitos como se describió anteriormente. El extracto seco se reconstituyó a una concentración de 4000 equivalentes celulares/μl. Analizar la muestra mediante cromatografía de fase inversa (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) y columna CORTECS T3 (2,1 × 150 mm, tamaño de partícula 1,6 μm, tamaño de poro 120 Å; n.° 186008500, Waters). Espectrómetro de masas polar (6470, Agilent), en el que la ionización por electrospray opera en modo positivo. La fase móvil A es ácido fórmico al 0,1 % (en H2O), la fase móvil B es acetonitrilo al 90 %, ácido fórmico al 0,1 %. El gradiente de LC es de 0 a 2 minutos para 100% A, de 2 a 7,1 minutos para 99% B, y de 7,1 a 8 minutos para 99% B. Luego, reequilibre la columna con la fase móvil A a un caudal de 0,6 ml/min durante 3 minutos. El caudal es de 0,4 ml/min, y la cámara de la columna se calienta a 50 °C. Utilice el estándar químico puro de MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canadá) para establecer el tiempo de retención (TR) y la transformación (TR = 0,882 minutos, transformación 1 = 137→94,1, transformación 2 = 137→92, transformación 3 = 137→78). Cuando las tres transiciones ocurren en el tiempo de retención correcto, la transición 1 se utiliza para la cuantificación para asegurar la especificidad. La curva estándar de MNA (Toronto Research Chemical Company) se generó mediante seis diluciones seriadas de la solución madre (1 mg/ml) para obtener estándares de 0,1, 1,0, 10 y 100 ng/ml y 1,0 y 10 μg/ml respectivamente en solución líquida. El límite de detección es de 1 ng/ml, y la respuesta lineal se encuentra entre 10 ng/ml y 10 μg/ml. Cada inyección de dos microlitros de muestra y estándar se utiliza para el análisis LC/MS, y se procesa una muestra de control de calidad mixta cada ocho inyecciones para garantizar la estabilidad de la plataforma de análisis. Las respuestas de MNA de todas las muestras de células tratadas con MNA se encontraban dentro del rango lineal del ensayo. El análisis de datos se realizó utilizando el software de análisis cuantitativo MassHunter (v9.0, Agilent).
El constructo αFR-CAR de segunda generación se obtuvo de Song et al. (59). En resumen, el constructo contiene los siguientes elementos: secuencia líder de CD8a, fragmento variable de cadena simple específico de αFR humano, región bisagra y transmembrana de CD8a, dominio intracelular de CD27 y dominio intracelular de CD3z. La secuencia CAR completa fue sintetizada por GenScript y posteriormente clonada en el vector de expresión lentiviral de segunda generación, aguas arriba del casete de expresión de GFP utilizado para evaluar la eficiencia de transducción.
El lentivirus se produce mediante la transfección de células HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); cultivadas en medio Eagle modificado de Dulbecco que contiene 10 % de suero fetal bovino (FBS) y 1 % de penicilina-estreptomicina, y se utilizó el vector CAR-GFP y los plásmidos de empaquetamiento (psPAX2 y pMD2.G, Addgene) se utilizan con amina de lipofección (Sigma-Aldrich). El sobrenadante que contiene el virus se recolectó 48 y 72 horas después de la transfección, se filtró y se concentró mediante ultracentrifugación. Almacene el sobrenadante viral concentrado a -80 °C hasta la transducción.
Las PBMC se separan de los productos de separación de leucocitos de donantes sanos (STEMCELL Technologies) mediante centrifugación de densidad con gradiente de Ficoll. Se utilizan microesferas CD8 de selección positiva (Miltenyi) para aislar las células CD8+ de las PBMC. Se estimulan las células T con TransAct (Miltenyi) y en medio TexMACS [Miltenyi; suplementado con 3% de suero humano inactivado por calor, 1% de PenStrep e IL-2 (300 U/ml)]. Veinticuatro horas después de la estimulación, las células T se transducen con lentivirus (10 μl de sobrenadante viral concentrado por cada 106 células). De 1 a 3 días después de la transducción en Cytek Aurora (en FSC (dispersión frontal)/SSC (dispersión lateral), Singlet, GFP+), se evalúa la expresión de GFP de las células para demostrar una eficiencia de transducción de al menos el 30%.
Las células CAR-T se cultivaron durante 24 horas en Immunocult (STEMCELL Technologies; suplementado con 1% de PenStrep) bajo las siguientes condiciones: sin tratamiento, tratadas con 250 μM de adenosina o 10 mM de MNA. Después del pretratamiento, las células CAR-T se lavaron con PBS y se combinaron con 20 000 células SK-OV-3 [ATCC; en medio McCoy 5A (Sigma-Aldrich) suplementado con 10% de FBS y 1% de PenStrep a 10: La relación efector/diana de 1 se amplificó por triplicado en medio Immunocult suplementado. Las células SK-OV-3 y las células SK-OV-3 lisadas con saponina digital (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) se utilizaron como controles negativo y positivo, respectivamente. Tras 24 horas de cocultivo, se recogió el sobrenadante y se midió la lactato deshidrogenasa (LDH) según las instrucciones del fabricante (kit de ensayo de citotoxicidad LDH Glo, Promega). El sobrenadante de LDH se diluyó 1:50 en tampón de LDH. El porcentaje de muerte celular se calculó mediante la siguiente fórmula: porcentaje de muerte celular = porcentaje de corrección / tasa máxima de muerte celular x 100 %, donde porcentaje de corrección = cocultivo con células T únicamente, y tasa máxima de muerte celular = control positivo - control negativo.
Tal como se describe en el texto o en los materiales y métodos, utilice GraphPad Prism 8, Microsoft Excel o R v3.6.0 para el análisis estadístico. Si se recolectan varias muestras del mismo paciente (como líquido ascítico y tumor), se utiliza una prueba t pareada o se incluye al paciente como un efecto aleatorio en un modelo lineal o generalizado, según corresponda. Para el análisis metabolómico, la prueba de importancia se realiza por triplicado.
Para consultar los materiales complementarios de este artículo, visite http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
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Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
El MNA contribuye a la inmunosupresión de las células T y representa una diana potencial para la inmunoterapia en el tratamiento del cáncer humano.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
El MNA contribuye a la inmunosupresión de las células T y representa una diana potencial para la inmunoterapia en el tratamiento del cáncer humano.
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