Se ha demostrado que el ácido propiónico (PPA), un agente antifúngico y un aditivo dietético común, causa un desarrollo neurológico anormal en ratones acompañado de disfunción gastrointestinal, que puede ser causada por disbiosis intestinal. Se ha sugerido un vínculo entre la exposición a PPA en la dieta y la disbiosis de la microbiota intestinal, pero no se ha investigado directamente. Aquí, investigamos los cambios asociados a PPA en la composición de la microbiota intestinal que pueden conducir a disbiosis. Los microbiomas intestinales de ratones alimentados con una dieta sin tratamiento (n = 9) y una dieta enriquecida con PPA (n = 13) se secuenciaron mediante secuenciación metagenómica de largo alcance para evaluar las diferencias en la composición microbiana y las vías metabólicas bacterianas. El PPA en la dieta se asoció con un aumento en la abundancia de taxones significativos, incluyendo varias especies de Bacteroides, Prevotella y Ruminococcus, miembros de los cuales han sido previamente implicados en la producción de PPA. Los microbiomas de los ratones expuestos a PPA también presentaron más vías relacionadas con el metabolismo lipídico y la biosíntesis de hormonas esteroideas. Nuestros resultados indican que el PPA puede alterar la microbiota intestinal y sus vías metabólicas asociadas. Estos cambios observados ponen de relieve que los conservantes clasificados como seguros para el consumo pueden influir en la composición de la microbiota intestinal y, por consiguiente, en la salud humana. Entre ellos, se selecciona P, G o S dependiendo del nivel de clasificación que se esté analizando. Para minimizar el impacto de las clasificaciones de falsos positivos, se adoptó un umbral mínimo de abundancia relativa de 1e-4 (1/10 000 lecturas). Antes del análisis estadístico, las abundancias relativas reportadas por Bracken (fraction_total_reads) se transformaron utilizando la transformación de razón logarítmica centrada (CLR) (Aitchison, 1982). Se eligió el método CLR para la transformación de datos porque es invariante a la escala y suficiente para conjuntos de datos no dispersos (Gloor et al., 2017). La transformación CLR utiliza el logaritmo natural. Los datos de conteo reportados por Bracken se normalizaron utilizando la expresión logarítmica relativa (RLE) (Anders y Huber, 2010). Las figuras se generaron utilizando una combinación de matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 y logaritmos secuenciales (Gloor et al., 2017). 0.12.2 y statanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). La proporción Bacillus/Bacteroidetes se calculó para cada muestra utilizando recuentos bacterianos normalizados. Los valores reportados en las tablas están redondeados a 4 decimales. El índice de diversidad de Simpson se calculó utilizando el script alpha_diversity.py proporcionado en el paquete KrakenTools v. 1.2 (Lu et al., 2022). El informe de Bracken se proporciona en el script y el índice de Simpson "Si" se proporciona para el parámetro -an. Las diferencias significativas en abundancia se definieron como diferencias medias de CLR ≥ 1 o ≤ -1. Una diferencia media de CLR de ±1 indica un aumento de 2,7 veces en la abundancia de un tipo de muestra. El signo (+/-) indica si el taxón es más abundante en la muestra de PPA y la muestra de control, respectivamente. La significancia se determinó mediante la prueba U de Mann-Whitney (Virtanen et al., 2020). Se empleó Statsmodels v. 0.14 (Benjamini y Hochberg, 1995; Seabold y Perktold, 2010) y se aplicó el procedimiento de Benjamini-Hochberg para corregir las pruebas múltiples. Se utilizó un valor p ajustado ≤ 0,05 como umbral para determinar la significancia estadística.
El microbioma humano se conoce a menudo como "el último órgano del cuerpo" y desempeña un papel vital en la salud humana (Baquero y Nombela, 2012). En particular, el microbioma intestinal es reconocido por su influencia sistémica y su papel en numerosas funciones esenciales. Las bacterias comensales abundan en el intestino, ocupando múltiples nichos ecológicos, utilizando nutrientes y compitiendo con patógenos potenciales (Jandhyala et al., 2015). Diversos componentes bacterianos de la microbiota intestinal son capaces de producir nutrientes esenciales como vitaminas y promover la digestión (Rowland et al., 2018). También se ha demostrado que los metabolitos bacterianos influyen en el desarrollo tisular y mejoran las vías metabólicas e inmunitarias (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). La composición del microbioma intestinal humano es extremadamente diversa y depende de factores genéticos y ambientales como la dieta, el género, la medicación y el estado de salud (Kumbhare et al., 2019).
La dieta materna es un componente crucial del desarrollo fetal y neonatal, y una posible fuente de compuestos que pueden influir en dicho desarrollo (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Uno de estos compuestos de interés es el ácido propiónico (PPA), un subproducto de los ácidos grasos de cadena corta obtenido de la fermentación bacteriana y un aditivo alimentario (den Besten et al., 2013). El PPA posee propiedades antibacterianas y antifúngicas, por lo que se utiliza como conservante de alimentos y en aplicaciones industriales para inhibir el crecimiento de moho y bacterias (Wemmenhove et al., 2016). El PPA tiene diferentes efectos en distintos tejidos. En el hígado, el PPA posee efectos antiinflamatorios al afectar la expresión de citocinas en los macrófagos (Kawasoe et al., 2022). Este efecto regulador también se ha observado en otras células inmunitarias, lo que provoca una disminución de la inflamación (Haase et al., 2021). Sin embargo, se ha observado el efecto contrario en el cerebro. Estudios previos han demostrado que la exposición al PPA induce un comportamiento similar al autismo en ratones (El-Ansary et al., 2012). Otros estudios han demostrado que el PPA puede inducir gliosis y activar vías proinflamatorias en el cerebro (Abdelli et al., 2019). Debido a que el PPA es un ácido débil, puede difundirse a través del epitelio intestinal hacia el torrente sanguíneo y, por lo tanto, cruzar barreras restrictivas, incluyendo la barrera hematoencefálica, así como la placenta (Stinson et al., 2019), destacando la importancia del PPA como metabolito regulador producido por bacterias. Aunque el papel potencial del PPA como factor de riesgo para el autismo está actualmente bajo investigación, sus efectos en individuos con autismo pueden extenderse más allá de la inducción de la diferenciación neuronal.
Síntomas gastrointestinales como diarrea y estreñimiento son comunes en pacientes con trastornos del neurodesarrollo (Cao et al., 2021). Estudios previos han demostrado que el microbioma de pacientes con trastornos del espectro autista (TEA) difiere del de individuos sanos, lo que sugiere la presencia de disbiosis de la microbiota intestinal (Finegold et al., 2010). De igual manera, las características del microbioma de pacientes con enfermedades inflamatorias intestinales, obesidad, enfermedad de Alzheimer, etc., también difieren de las de individuos sanos (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Sin embargo, hasta la fecha, no se ha establecido una relación causal entre el microbioma intestinal y enfermedades o síntomas neurológicos (Yap et al., 2021), aunque se cree que varias especies bacterianas juegan un papel en algunas de estas enfermedades. Por ejemplo, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio y otros géneros son más abundantes en la microbiota de pacientes con autismo (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). En particular, se sabe que las especies miembro de algunos de estos géneros poseen genes asociados con la producción de PPA (Reichardt et al., 2014; Yun y Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur y Dürre, 2023). Dadas las propiedades antimicrobianas de PPA, aumentar su abundancia puede ser beneficioso para el crecimiento de bacterias productoras de PPA (Jacobson et al., 2018). Por lo tanto, un entorno rico en PFA puede conducir a cambios en la microbiota intestinal, incluidos los patógenos gastrointestinales, que pueden ser factores potenciales que conducen a síntomas gastrointestinales.
Una pregunta central en la investigación del microbioma es si las diferencias en la composición microbiana son causa o síntoma de enfermedades subyacentes. El primer paso para dilucidar la compleja relación entre la dieta, el microbioma intestinal y las enfermedades neurológicas es evaluar los efectos de la dieta en la composición microbiana. Para ello, utilizamos la secuenciación metagenómica de lectura larga para comparar los microbiomas intestinales de crías de ratones alimentados con una dieta rica en PPA o con una dieta pobre en PPA. Las crías recibieron la misma dieta que sus madres. Planteamos la hipótesis de que una dieta rica en PPA provocaría cambios en la composición microbiana intestinal y en las vías funcionales microbianas, en particular las relacionadas con el metabolismo y/o la producción de PPA.
Este estudio utilizó ratones transgénicos FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories) que sobreexpresan la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control del promotor GFAP específico de la glía siguiendo las directrices del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Florida Central (UCF-IACUC) (Número de Permiso de Uso Animal: PROTO202000002). Después del destete, los ratones se alojaron individualmente en jaulas con 1 a 5 ratones de cada sexo por jaula. Los ratones fueron alimentados ad libitum con una dieta de control purificada (dieta estándar abierta modificada, 16 kcal% de grasa) o una dieta suplementada con propionato de sodio (dieta estándar abierta modificada, 16 kcal% de grasa, que contiene 5,000 ppm de propionato de sodio). La cantidad de propionato de sodio utilizada fue equivalente a 5,000 mg de PFA/kg de peso total del alimento. Esta es la concentración más alta de PPA aprobada para su uso como conservante de alimentos. Para preparar este estudio, los ratones progenitores recibieron ambas dietas durante 4 semanas antes del apareamiento y continuaron durante la gestación de la madre. Las crías [22 ratones, 9 controles (6 machos, 3 hembras) y 13 PPA (4 machos, 9 hembras)] fueron destetadas y continuaron con la misma dieta que las madres durante 5 meses. Las crías fueron sacrificadas a los 5 meses de edad y se recogió su contenido fecal intestinal, que se almacenó inicialmente en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml a -20 °C y posteriormente se transfirió a un congelador a -80 °C hasta que se agotó el ADN del huésped y se extrajeron los ácidos nucleicos microbianos.
El ADN del huésped se eliminó según un protocolo modificado (Charalampous et al., 2019). Brevemente, el contenido fecal se transfirió a 500 µl de InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) y se almacenó congelado. Procese un máximo de 1 a 2 pellets fecales por extracción. A continuación, el contenido fecal se homogeneizó mecánicamente utilizando una mano de mortero de plástico dentro del tubo para formar una suspensión. Centrifugue las muestras a 10 000 RCF durante 5 min o hasta que las muestras se hayan sedimentado, a continuación, aspire el sobrenadante y resuspenda el pellet en 250 µl de PBS 1×. Añada 250 µl de solución de saponina al 4,4 % (TCI, número de producto S0019) a la muestra como detergente para aflojar las membranas de las células eucariotas. Las muestras se mezclaron suavemente hasta obtener una consistencia homogénea y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min. A continuación, para romper las células eucariotas, se añadieron 350 μl de agua libre de nucleasas a la muestra, se incubó durante 30 s y, a continuación, se añadieron 12 μl de NaCl 5 M. Las muestras se centrifugaron a 6000 RCF durante 5 min. Se aspiró el sobrenadante y se resuspendió el pellet en 100 μl de PBS 1X. Para eliminar el ADN del huésped, se añadieron 100 μl de tampón HL-SAN (12,8568 g de NaCl, 4 ml de MgCl₂ 1 M, 36 ml de agua libre de nucleasas) y 10 μl de la enzima HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). Las muestras se mezclaron completamente mediante pipeteo y se incubaron a 37 °C durante 30 min a 800 rpm en un mezclador Eppendorf™ ThermoMixer C. Tras la incubación, se centrifugaron a 6000 RCF durante 3 min y se lavaron dos veces con 800 µl y 1000 µl de PBS 1X. Finalmente, se resuspendió el pellet en 100 µl de PBS 1X.
El ADN bacteriano total se aisló utilizando el kit de purificación de ADN genómico Monarch de New England Biolabs (New England Biolabs, Ipswich, MA, n.° de cat. T3010L). El procedimiento operativo estándar incluido con el kit se ha modificado ligeramente. Incube y mantenga el agua libre de nucleasas a 60 °C antes de la operación para la elución final. Añada 10 µl de proteinasa K y 3 µl de ARNasa A a cada muestra. A continuación, añada 100 µl de tampón de lisis celular y mezcle suavemente. Las muestras se incubaron en un mezclador Eppendorf™ ThermoMixer C a 56 °C y 1400 rpm durante al menos 1 hora y hasta 3 horas. Las muestras incubadas se centrifugaron a 12 000 RCF durante 3 minutos y el sobrenadante de cada muestra se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL aparte con 400 µL de solución de unión. Los tubos se agitaron con vórtex de pulso durante 5-10 segundos a intervalos de 1 segundo. Transfiera todo el contenido líquido de cada muestra (aproximadamente 600-700 µL) a un cartucho de filtro colocado en un tubo de recolección de flujo continuo. Los tubos se centrifugaron a 1000 RCF durante 3 minutos para permitir la unión inicial del ADN y luego se centrifugaron a 12 000 RCF durante 1 minuto para eliminar el líquido residual. La columna de muestra se transfirió a un nuevo tubo de recolección y luego se lavó dos veces. Para el primer lavado, agregue 500 µL de tampón de lavado a cada tubo. Invierta el tubo de 3 a 5 veces y luego centrifugue a 12 000 RCF durante 1 minuto. Deseche el líquido del tubo de recolección y vuelva a colocar el cartucho de filtro en el mismo tubo de recolección. Para el segundo lavado, agregue 500 µL de tampón de lavado al filtro sin invertir. Las muestras se centrifugaron a 12 000 RCF durante 1 minuto. Transfiera el filtro a un tubo LoBind® de 1,5 mL y añada 100 µL de agua libre de nucleasas precalentada. Los filtros se incubaron a temperatura ambiente durante 1 minuto y luego se centrifugaron a 12 000 RCF durante 1 minuto. El ADN eluido se almacenó a -80 °C.
La concentración de ADN se cuantificó con un fluorómetro Qubit™ 4.0. El ADN se preparó con el kit Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity (n.º de cat. Q33231) según las instrucciones del fabricante. La distribución de la longitud de los fragmentos de ADN se midió con un TapeStation Aglient™ 4150 o 4200. El ADN se preparó con reactivos de ADN genómico Agilent™ (n.º de cat. 5067-5366) y Genomic DNA ScreenTape (n.º de cat. 5067-5365). La preparación de la biblioteca se realizó con el kit de codificación de barras para PCR rápida Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) (SQK-RPB004) según las instrucciones del fabricante. El ADN se secuenció con un secuenciador ONT GridION™ Mk1 con una celda de flujo Min106D (R 9.4.1). La configuración de secuenciación fue: llamada de bases de alta precisión, valor q mínimo de 9, configuración y recorte de código de barras. Las muestras se secuenciaron durante 72 horas, tras lo cual los datos de llamada de bases se enviaron para su posterior procesamiento y análisis.
El procesamiento bioinformático se realizó mediante métodos previamente descritos (Greenman et al., 2024). Los archivos FASTQ obtenidos de la secuenciación se dividieron en directorios para cada muestra. Antes del análisis bioinformático, los datos se procesaron mediante la siguiente secuencia: primero, se fusionaron los archivos FASTQ de las muestras en un único archivo FASTQ. A continuación, se filtraron las lecturas inferiores a 1000 pb con Filtlong v. 0.2.1, modificando únicamente el parámetro –min_length 1000 (Wick, 2024). Antes de continuar con el filtrado, se controló la calidad de las lecturas con NanoPlot v. 1.41.3 con los siguientes parámetros: –fastq –plots dot –N50 -o
Para la clasificación taxonómica, las lecturas y los contigs ensamblados se clasificaron utilizando Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019). Genere informes y archivos de salida para lecturas y ensamblajes, respectivamente. Utilice la opción –use-names para analizar lecturas y ensamblajes. Las opciones –gzip-compressed y –paired se especifican para los segmentos de lectura. La abundancia relativa de taxones en metagenomas se estimó utilizando Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017). Primero, creamos una base de datos kmer con 1000 bases utilizando bracken-build con los siguientes parámetros: -d
La anotación génica y la estimación de la abundancia relativa se realizaron utilizando una versión modificada del protocolo descrito por Maranga et al. (Maranga et al., 2023). Primero, se eliminaron los contigs menores de 500 pb de todos los ensambles utilizando SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). Los ensambles seleccionados se combinaron posteriormente en un pan-metagenoma. Los marcos de lectura abiertos (ORF) se identificaron utilizando Prodigal v. 1.0.1 (una versión paralela de Prodigal v. 2.6.3) con los siguientes parámetros: -d
Los genes se agruparon primero según los identificadores de ortólogos (KO) de la Enciclopedia de Kioto de Genes y Genomas (KEGG) asignados por eggNOG para comparar las abundancias de las vías génicas. Los genes sin knockouts o genes con múltiples knockouts se eliminaron antes del análisis. Luego se calculó la abundancia promedio de cada KO por muestra y se realizó un análisis estadístico. Los genes del metabolismo de PPA se definieron como cualquier gen al que se le asignó una fila ko00640 en la columna KEGG_Pathway, lo que indica un papel en el metabolismo del propionato según KEGG. Los genes identificados como asociados con la producción de PPA se enumeran en la Tabla complementaria 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Se realizaron pruebas de permutación para identificar los genes del metabolismo y la producción de PPA que fueron significativamente más abundantes en cada tipo de muestra. Se realizaron mil permutaciones para cada gen analizado. Se utilizó un valor p de 0,05 como punto de corte para determinar la significancia estadística. Se asignaron anotaciones funcionales a genes individuales dentro de un clúster basándose en las anotaciones de genes representativos dentro del clúster. Los taxones asociados con el metabolismo y/o la producción de PPA se identificaron mediante la comparación de los identificadores de contig en los archivos de salida de Kraken2 con los mismos identificadores de contig conservados durante la anotación funcional mediante eggNOG. Se realizó una prueba de significación estadística mediante la prueba U de Mann-Whitney descrita previamente. La corrección para pruebas múltiples se realizó mediante el procedimiento de Benjamini-Hochberg. Se utilizó un valor p ≤ 0,05 como punto de corte para determinar la significación estadística.
La diversidad del microbioma intestinal de los ratones se evaluó mediante el índice de diversidad de Simpson. No se observaron diferencias significativas entre las muestras de control y las de PPA en cuanto a diversidad de género y especie (valor p para género: 0,18, valor p para especie: 0,16) (Figura 1). La composición microbiana se comparó posteriormente mediante análisis de componentes principales (ACP). La Figura 2 muestra la agrupación de las muestras según sus filos, lo que indica que existían diferencias en la composición de especies de los microbiomas entre las muestras de PPA y las de control. Esta agrupación fue menos pronunciada a nivel de género, lo que sugiere que la PPA afecta a ciertas bacterias (Figura 1 suplementaria).
Figura 1. Diversidad alfa de la composición de géneros y especies del microbioma intestinal del ratón. Diagramas de caja que muestran los índices de diversidad de Simpson de géneros (A) y especies (B) en muestras de PPA y control. La significancia se determinó mediante la prueba U de Mann-Whitney y se realizó una corrección múltiple mediante el procedimiento de Benjamini-Hochberg. ns, el valor de p no fue significativo (p > 0,05).
Figura 2. Resultados del análisis de componentes principales de la composición del microbioma intestinal del ratón a nivel de especie. El gráfico del análisis de componentes principales muestra la distribución de las muestras según sus dos primeros componentes principales. Los colores indican el tipo de muestra: los ratones expuestos a PPA son morados y los ratones control son amarillos. Los componentes principales 1 y 2 se representan en los ejes x e y, respectivamente, y se expresan como su razón de varianza explicada.
Utilizando los datos de recuento transformados por RLE, se observó una disminución significativa en la mediana de la razón Bacteroidetes/Bacilli en los ratones control y PPA (control: 9,66, PPA: 3,02; valor p = 0,0011). Esta diferencia se debió a una mayor abundancia de Bacteroidetes en los ratones PPA en comparación con los controles, aunque la diferencia no fue significativa (CLR media del control: 5,51, CLR media de PPA: 6,62; valor p = 0,054), mientras que la abundancia de Bacteroidetes fue similar (CLR media del control: 7,76, CLR media de PPA: 7,60; valor p = 0,18).
El análisis de la abundancia de los miembros taxonómicos del microbioma intestinal reveló que un filo y 77 especies diferían significativamente entre las muestras de PPA y las de control (Tabla Suplementaria 2). La abundancia de 59 especies en las muestras de PPA fue significativamente mayor que en las muestras de control, mientras que la abundancia de solo 16 especies en las muestras de control fue mayor que en las muestras de PPA (Figura 3).
Figura 3. Abundancia diferencial de taxones en el microbioma intestinal de ratones PPA y control. Los gráficos de volcán muestran diferencias en la abundancia de géneros (A) o especies (B) entre las muestras PPA y control. Los puntos grises indican que no hay diferencias significativas en la abundancia de taxones. Los puntos de color indican diferencias significativas en la abundancia (valor p ≤ 0,05). Los 20 taxones principales con las mayores diferencias en abundancia entre los tipos de muestra se muestran en rojo y azul claro (muestras control y PPA), respectivamente. Los puntos amarillos y morados fueron al menos 2,7 veces más abundantes en las muestras control o PPA que en los controles. Los puntos negros representan taxones con abundancias significativamente diferentes, con diferencias medias de CLR entre -1 y 1. Los valores p se calcularon utilizando la prueba U de Mann-Whitney y se corrigieron para pruebas múltiples utilizando el procedimiento de Benjamini-Hochberg. Las diferencias medias de CLR en negrita indican diferencias significativas en la abundancia.
Tras analizar la composición microbiana intestinal, realizamos una anotación funcional del microbioma. Tras descartar los genes de baja calidad, se identificaron un total de 378.355 genes únicos en todas las muestras. La abundancia transformada de estos genes se utilizó para el análisis de componentes principales (ACP), y los resultados mostraron un alto grado de agrupamiento de los tipos de muestra según sus perfiles funcionales (Figura 4).
Figura 4. Resultados del análisis de componentes principales (PCA) utilizando el perfil funcional del microbioma intestinal del ratón. El gráfico de PCA muestra la distribución de las muestras según sus dos primeros componentes principales. Los colores indican el tipo de muestra: los ratones expuestos a PPA son morados y los ratones control son amarillos. Los componentes principales 1 y 2 se representan en los ejes x e y, respectivamente, y se expresan como su razón de varianza explicada.
A continuación, examinamos la abundancia de knockouts de KEGG en diferentes tipos de muestras. Se identificaron un total de 3648 knockouts únicos, de los cuales 196 fueron significativamente más abundantes en las muestras de control y 106 fueron más abundantes en las muestras de PPA (Figura 5). Se detectaron un total de 145 genes en muestras de control y 61 genes en muestras de PPA, con abundancias significativamente diferentes. Las vías relacionadas con el metabolismo de lípidos y aminoazúcares fueron significativamente más enriquecidas en las muestras de PPA (Tabla Suplementaria 3). Las vías relacionadas con el metabolismo del nitrógeno y los sistemas de relevo de azufre fueron significativamente más enriquecidas en las muestras de control (Tabla Suplementaria 3). La abundancia de genes relacionados con el metabolismo de aminoazúcares/nucleótidos (ko:K21279) y el metabolismo de inositol fosfato (ko:K07291) fue significativamente mayor en las muestras de PPA (Figura 5). Las muestras de control tenían significativamente más genes relacionados con el metabolismo del benzoato (ko:K22270), el metabolismo del nitrógeno (ko:K00368) y la glucólisis/gluconeogénesis (ko:K00131) ( Figura 5 ).
Fig. 5. Abundancia diferencial de KOs en el microbioma intestinal de ratones PPA y control. El gráfico de volcán representa las diferencias en la abundancia de grupos funcionales (KOs). Los puntos grises indican KOs cuya abundancia no fue significativamente diferente entre los tipos de muestra (valor p > 0,05). Los puntos de color indican diferencias significativas en abundancia (valor p ≤ 0,05). Los 20 KOs con las mayores diferencias en abundancia entre los tipos de muestra se muestran en rojo y azul claro, correspondientes a muestras de control y PPA, respectivamente. Los puntos amarillos y morados indican KOs que fueron al menos 2,7 veces más abundantes en muestras de control y PPA, respectivamente. Los puntos negros indican KOs con abundancias significativamente diferentes, con diferencias medias de CLR entre -1 y 1. Los valores p se calcularon utilizando la prueba U de Mann-Whitney y se ajustaron para comparaciones múltiples utilizando el procedimiento de Benjamini-Hochberg. NaN indica que el KO no pertenece a una vía en KEGG. Los valores de diferencia media de CLR en negrita indican diferencias significativas en la abundancia. Para obtener información detallada sobre las vías a las que pertenecen los KO enumerados, consulte la Tabla Suplementaria 3.
Entre los genes anotados, 1601 genes tuvieron abundancias significativamente diferentes entre los tipos de muestra (p ≤ 0,05), siendo cada gen al menos 2,7 veces más abundante. De estos genes, 4 genes fueron más abundantes en las muestras de control y 1597 genes fueron más abundantes en las muestras de PPA. Debido a que la PPA tiene propiedades antimicrobianas, examinamos las abundancias de los genes de metabolismo y producción de PPA entre los tipos de muestra. Entre los 1332 genes relacionados con el metabolismo de PPA, 27 genes fueron significativamente más abundantes en las muestras de control y 12 genes fueron más abundantes en las muestras de PPA. Entre los 223 genes relacionados con la producción de PPA, 1 gen fue significativamente más abundante en las muestras de PPA. La Figura 6A demuestra además la mayor abundancia de genes involucrados en el metabolismo de PPA, con una abundancia significativamente mayor en las muestras de control y grandes tamaños del efecto, mientras que la Figura 6B destaca genes individuales con una abundancia significativamente mayor observada en las muestras de PPA.
Fig. 6. Abundancia diferencial de genes relacionados con PPA en el microbioma intestinal del ratón. Los gráficos de volcán representan las diferencias en la abundancia de genes asociados con el metabolismo de PPA (A) y la producción de PPA (B). Los puntos grises indican genes cuya abundancia no fue significativamente diferente entre los tipos de muestra (valor p > 0,05). Los puntos de color indican diferencias significativas en la abundancia (valor p ≤ 0,05). Los 20 genes con las mayores diferencias en abundancia se muestran en rojo y azul claro (muestras de control y PPA), respectivamente. La abundancia de puntos amarillos y morados fue al menos 2,7 veces mayor en las muestras de control y PPA que en las muestras de control. Los puntos negros representan genes con abundancias significativamente diferentes, con diferencias medias de CLR entre -1 y 1. Los valores p se calcularon utilizando la prueba U de Mann-Whitney y se corrigieron para comparaciones múltiples utilizando el procedimiento de Benjamini-Hochberg. Los genes corresponden a genes representativos en el catálogo de genes no redundantes. Los nombres de los genes consisten en el símbolo KEGG que denota un gen KO. Las diferencias medias de CLR en negrita indican abundancias significativamente diferentes. Un guion (-) indica que no existe símbolo para el gen en la base de datos KEGG.
Los taxones con genes relacionados con el metabolismo y/o la producción de PPA se identificaron mediante la comparación de la identidad taxonómica de los contigs con el ID del gen. A nivel de género, se encontraron 130 géneros con genes relacionados con el metabolismo de PPA y 61 géneros con genes relacionados con la producción de PPA (Tabla Suplementaria 4). Sin embargo, ningún género mostró diferencias significativas en abundancia (p > 0,05).
A nivel de especie, se encontró que 144 especies bacterianas tenían genes asociados con el metabolismo de PPA y 68 especies bacterianas tenían genes asociados con la producción de PPA (Tabla Suplementaria 5). Entre los metabolizadores de PPA, ocho bacterias mostraron aumentos significativos en abundancia entre los tipos de muestra, y todas mostraron cambios significativos en el efecto (Tabla Suplementaria 6). Todos los metabolizadores de PPA identificados con diferencias significativas en abundancia fueron más abundantes en las muestras de PPA. La clasificación a nivel de especie reveló representantes de géneros que no difirieron significativamente entre los tipos de muestra, incluyendo varias especies de Bacteroides y Ruminococcus, así como Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus y Alcaligenes polymorpha. Entre las bacterias productoras de PPA, cuatro bacterias mostraron diferencias significativas en abundancia entre los tipos de muestra. Las especies con diferencias significativas en abundancia incluyeron Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis y Ruminococcus bovis.
En este estudio, examinamos los efectos de la exposición al PPA en la microbiota intestinal de ratones. El PPA puede provocar diferentes respuestas en las bacterias, ya que es producido por ciertas especies, utilizado como fuente de alimento por otras o posee efectos antimicrobianos. Por lo tanto, su adición al ambiente intestinal mediante suplementos dietéticos puede tener diferentes efectos según la tolerancia, la susceptibilidad y la capacidad de utilizarlo como fuente de nutrientes. Las especies bacterianas sensibles pueden ser eliminadas y reemplazadas por aquellas más resistentes al PPA o capaces de utilizarlo como fuente de alimento, lo que provoca cambios en la composición de la microbiota intestinal. Nuestros resultados revelaron diferencias significativas en la composición microbiana, pero ningún efecto en la diversidad microbiana general. Los mayores efectos se observaron a nivel de especie, con más de 70 taxones significativamente diferentes en abundancia entre las muestras de PPA y las de control (Tabla Suplementaria 2). Una evaluación más detallada de la composición de las muestras expuestas al PPA reveló una mayor heterogeneidad de especies microbianas en comparación con las muestras no expuestas, lo que sugiere que el PPA puede mejorar las características de crecimiento bacteriano y limitar las poblaciones bacterianas que pueden sobrevivir en ambientes ricos en PPA. Por lo tanto, el PPA puede inducir cambios selectivos en lugar de causar una alteración generalizada de la diversidad de la microbiota intestinal.
Se ha demostrado previamente que los conservantes alimentarios como el PPA alteran la abundancia de componentes del microbioma intestinal sin afectar la diversidad general (Nagpal et al., 2021). En este estudio, observamos las diferencias más notables entre las especies de Bacteroidetes dentro del filo Bacteroidetes (anteriormente conocido como Bacteroidetes), que se enriquecieron significativamente en ratones expuestos a PPA. Una mayor abundancia de especies de Bacteroides se asocia con una mayor degradación del moco, lo que puede aumentar el riesgo de infección y promover la inflamación (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Un estudio encontró que ratones macho neonatos tratados con Bacteroides fragilis exhibieron comportamientos sociales que recuerdan al trastorno del espectro autista (TEA) (Carmel et al., 2023), y otros estudios han demostrado que las especies de Bacteroides pueden alterar la actividad inmunitaria y provocar miocardiopatía inflamatoria autoinmune (Gil-Cruz et al., 2019). Las especies pertenecientes a los géneros Ruminococcus, Prevotella y Parabacteroides también aumentaron significativamente en ratones expuestos a PPA (Coretti et al., 2018). Ciertas especies de Ruminococcus se asocian con enfermedades como la enfermedad de Crohn a través de la producción de citocinas proinflamatorias (Henke et al., 2019), mientras que especies de Prevotella como Prevotella humani se asocian con enfermedades metabólicas como la hipertensión y la sensibilidad a la insulina (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Finalmente, encontramos que la proporción de Bacteroidetes (anteriormente conocido como Firmicutes) a Bacteroidetes fue significativamente menor en ratones expuestos a PPA que en ratones control debido a una mayor abundancia total de especies de Bacteroidetes. Esta proporción ha demostrado ser un indicador importante de la homeostasis intestinal, y sus alteraciones se han asociado con diversas enfermedades (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), incluidas las enfermedades inflamatorias intestinales (Stojanov et al., 2020). En conjunto, las especies del filo Bacteroidetes parecen ser las más afectadas por niveles elevados de PPA en la dieta. Esto puede deberse a una mayor tolerancia al PPA o a la capacidad de utilizarlo como fuente de energía, lo cual se ha demostrado en al menos una especie, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Por otro lado, la exposición materna al PPA puede mejorar el desarrollo fetal al hacer que el intestino de las crías de ratón sea más susceptible a la colonización por Bacteroidetes; sin embargo, el diseño de nuestro estudio no permitió dicha evaluación.
La evaluación del contenido metagenómico reveló diferencias significativas en la abundancia de genes asociados con el metabolismo y la producción de PPA. Los ratones expuestos a PPA mostraron una mayor abundancia de genes responsables de la producción de PPA, mientras que los ratones no expuestos a PPA mostraron una mayor abundancia de genes responsables del metabolismo de PAA (Figura 6). Estos resultados sugieren que el efecto del PPA en la composición microbiana podría no deberse únicamente a su uso; de lo contrario, la abundancia de genes asociados con el metabolismo de PPA debería haber mostrado una mayor abundancia en el microbioma intestinal de los ratones expuestos a PPA. Una explicación es que el PPA media la abundancia bacteriana principalmente a través de sus efectos antimicrobianos, en lugar de a través de su uso por las bacterias como nutriente. Estudios previos han demostrado que el PPA inhibe el crecimiento de Salmonella Typhimurium de forma dosis-dependiente (Jacobson et al., 2018). La exposición a concentraciones más altas de PPA puede seleccionar bacterias resistentes a sus propiedades antimicrobianas y que no necesariamente sean capaces de metabolizarlo o producirlo. Por ejemplo, varias especies de Parabacteroides mostraron una abundancia significativamente mayor en muestras de PPA, pero no se detectaron genes relacionados con el metabolismo o la producción de PPA (Tablas suplementarias 2, 4 y 5). Además, la producción de PPA como subproducto de la fermentación está ampliamente distribuida entre varias bacterias (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Una mayor diversidad bacteriana puede ser la razón de la mayor abundancia de genes relacionados con el metabolismo de PPA en las muestras de control (Averina et al., 2020). Además, se predijo que solo 27 (2,14%) de 1332 genes serían genes asociados exclusivamente con el metabolismo de PPA. Muchos genes asociados con el metabolismo de PPA también están involucrados en otras vías metabólicas. Esto demuestra además que la abundancia de genes involucrados en el metabolismo de PPA fue mayor en las muestras de control; estos genes pueden funcionar en vías que no resultan en la utilización o formación de PPA como subproducto. En este caso, solo un gen asociado con la generación de PPA mostró diferencias significativas en abundancia entre los tipos de muestra. A diferencia de los genes asociados con el metabolismo de PPA, se seleccionaron genes marcadores para la producción de PPA debido a su participación directa en la vía bacteriana de producción de PPA. En ratones expuestos a PPA, se observó que todas las especies presentaban una abundancia y capacidad de producción de PPA significativamente mayores. Esto respalda la predicción de que los PPA seleccionarían a los productores de PPA y, por lo tanto, predecirían un aumento en la capacidad de producción de PPA. Sin embargo, la abundancia génica no se correlaciona necesariamente con la expresión génica; por lo tanto, aunque la abundancia de genes asociados con el metabolismo de PPA es mayor en las muestras de control, la tasa de expresión puede ser diferente (Shi et al., 2014). Para confirmar la relación entre la prevalencia de genes productores de PPA y la producción de PPA, se requieren estudios de la expresión de genes involucrados en la producción de PPA.
La anotación funcional de los metagenomas de PPA y control reveló algunas diferencias. El análisis de PCA del contenido génico reveló agrupaciones discretas entre las muestras de PPA y control (Figura 5). La agrupación intramuestra reveló que el contenido génico de control fue más diverso, mientras que las muestras de PPA se agruparon juntas. La agrupación por contenido génico fue comparable a la agrupación por composición de especies. Por lo tanto, las diferencias en la abundancia de vías son consistentes con los cambios en la abundancia de especies y cepas específicas dentro de ellas. En las muestras de PPA, dos vías con una abundancia significativamente mayor se relacionaron con el metabolismo de azúcares aminoazúcares/nucleótidos (ko:K21279) y múltiples vías de metabolismo lipídico (ko:K00647, ko:K03801; Tabla Suplementaria 3). Se sabe que los genes asociados con ko:K21279 están asociados con el género Bacteroides, uno de los géneros con un número significativamente mayor de especies en las muestras de PPA. Esta enzima puede evadir la respuesta inmunitaria mediante la expresión de polisacáridos capsulares (Wang et al., 2008). Esto puede explicar el aumento de Bacteroidetes observado en ratones expuestos a PPA. Esto complementa el aumento de la síntesis de ácidos grasos observado en el microbioma de PPA. Las bacterias utilizan la vía FASIIko:K00647 (fabB) para producir ácidos grasos, lo que puede influir en las vías metabólicas del huésped (Yao y Rock, 2015; Johnson et al., 2020), y los cambios en el metabolismo lipídico pueden desempeñar un papel en el neurodesarrollo (Yu et al., 2020). Otra vía que mostró una mayor abundancia en muestras de PPA fue la biosíntesis de hormonas esteroides (ko:K12343). Existe una creciente evidencia de que existe una relación inversa entre la capacidad de la microbiota intestinal para influir en los niveles hormonales y para ser influenciada por las hormonas, de modo que los niveles elevados de esteroides pueden tener consecuencias posteriores para la salud (Tetel et al., 2018).
Este estudio presenta limitaciones y consideraciones. Una distinción importante es que no realizamos evaluaciones fisiológicas de los animales. Por lo tanto, no es posible concluir directamente si los cambios en el microbioma están asociados con alguna enfermedad. Otra consideración es que los ratones de este estudio recibieron la misma dieta que sus madres. Estudios futuros podrían determinar si el cambio de una dieta rica en PPA a una dieta sin PPA mejora sus efectos sobre el microbioma. Una limitación de nuestro estudio, como la de muchos otros, es el tamaño limitado de la muestra. Si bien se pueden extraer conclusiones válidas, un tamaño de muestra mayor proporcionaría mayor potencia estadística al analizar los resultados. También somos cautelosos al extraer conclusiones sobre una asociación entre los cambios en el microbioma intestinal y cualquier enfermedad (Yap et al., 2021). Factores de confusión como la edad, el sexo y la dieta pueden influir significativamente en la composición de los microorganismos. Estos factores podrían explicar las inconsistencias observadas en la literatura sobre la asociación del microbioma intestinal con enfermedades complejas (Johnson et al., 2019; Lagod y Naser, 2023). Por ejemplo, se ha demostrado que los miembros del género Bacteroidetes aumentan o disminuyen en animales y humanos con TEA (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). De manera similar, los estudios de la composición intestinal en pacientes con enfermedades inflamatorias intestinales han encontrado tanto aumentos como disminuciones en los mismos taxones (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Para limitar el impacto del sesgo de género, intentamos asegurar una representación equitativa de los sexos para que las diferencias probablemente se debieran a la dieta. Un desafío de la anotación funcional es la eliminación de secuencias genéticas redundantes. Nuestro método de agrupamiento de genes requiere una identidad de secuencia del 95% y una similitud de longitud del 85%, así como una cobertura de alineamiento del 90% para eliminar el agrupamiento falso. Sin embargo, en algunos casos, observamos COG con las mismas anotaciones (p. ej., MUT) (Fig. 6). Se necesitan más estudios para determinar si estos ortólogos son distintos, están asociados a géneros específicos o si esto constituye una limitación del enfoque de agrupamiento de genes. Otra limitación de la anotación funcional es la posible clasificación errónea; el gen bacteriano mmdA es una enzima conocida que participa en la síntesis de propionato, pero KEGG no la asocia con la vía metabólica del propionato. Por el contrario, los ortólogos scpB y mmcD sí están relacionados. La gran cantidad de genes sin knockouts designados puede impedir la identificación de genes relacionados con la PPA al evaluar la abundancia génica. Los estudios futuros se beneficiarán del análisis del metatranscriptoma, que puede proporcionar una comprensión más profunda de las características funcionales de la microbiota intestinal y vincular la expresión génica con posibles efectos posteriores. Para estudios que involucran trastornos específicos del neurodesarrollo o enfermedades inflamatorias intestinales, se necesitan evaluaciones fisiológicas y conductuales de los animales para vincular los cambios en la composición del microbioma con estos trastornos. Estudios adicionales que trasplantan el microbioma intestinal a ratones libres de gérmenes también serían útiles para determinar si el microbioma es un factor desencadenante o característico de la enfermedad.
En resumen, demostramos que el PPA dietético actúa como un factor que altera la composición de la microbiota intestinal. El PPA es un conservante aprobado por la FDA, ampliamente presente en diversos alimentos, que, tras una exposición prolongada, puede alterar la flora intestinal normal. Encontramos cambios en la abundancia de varias bacterias, lo que sugiere que el PPA puede influir en la composición de la microbiota intestinal. Los cambios en la microbiota pueden provocar cambios en los niveles de ciertas vías metabólicas, lo que a su vez puede generar cambios fisiológicos relevantes para la salud del huésped. Se necesitan más estudios para determinar si los efectos del PPA dietético en la composición microbiana pueden provocar disbiosis u otras enfermedades. Este estudio sienta las bases para futuros estudios sobre cómo los efectos del PPA en la composición intestinal pueden afectar la salud humana.
Los conjuntos de datos presentados en este estudio están disponibles en repositorios en línea. El nombre y el número de acceso del repositorio son: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Este estudio con animales fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Florida Central (UCF-IACUC) (Número de Permiso de Uso de Animales: PROTO202000002). Este estudio cumple con las leyes, regulaciones y requisitos institucionales locales.
NG: Conceptualización, Curación de datos, Análisis formal, Investigación, Metodología, Software, Visualización, Redacción (borrador original), Redacción (revisión y edición). LA: Conceptualización, Curación de datos, Metodología, Recursos, Redacción (revisión y edición). SH: Análisis formal, Software, Redacción (revisión y edición). SA: Investigación, Redacción (revisión y edición). Juez principal: Investigación, Redacción (revisión y edición). SN: Conceptualización, Administración del proyecto, Recursos, Supervisión, Redacción (revisión y edición). TA: Conceptualización, Administración del proyecto, Supervisión, Redacción (revisión y edición).
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Hora de publicación: 18 de abril de 2025