Se ha demostrado que el ácido propiónico (PPA), un agente antifúngico y aditivo dietético común, causa un neurodesarrollo anormal en ratones acompañado de disfunción gastrointestinal, que podría deberse a disbiosis intestinal. Se ha sugerido una relación entre la exposición dietética al PPA y la disbiosis de la microbiota intestinal, pero no se ha investigado directamente. En este estudio, investigamos los cambios en la composición de la microbiota intestinal asociados al PPA que podrían conducir a la disbiosis. Se secuenciaron los microbiomas intestinales de ratones alimentados con una dieta no tratada (n=9) y una dieta enriquecida con PPA (n=13) mediante secuenciación metagenómica de largo alcance para evaluar las diferencias en la composición microbiana y las vías metabólicas bacterianas. El PPA dietético se asoció con un aumento en la abundancia de taxones significativos, incluyendo varias especies de Bacteroides, Prevotella y Ruminococcus, cuyos miembros se han relacionado previamente con la producción de PPA. Los microbiomas de los ratones expuestos al PPA también presentaron más vías relacionadas con el metabolismo lipídico y la biosíntesis de hormonas esteroides. Nuestros resultados indican que el PPA puede alterar la microbiota intestinal y sus vías metabólicas asociadas. Estos cambios observados ponen de manifiesto que los conservantes clasificados como seguros para el consumo pueden influir en la composición de la microbiota intestinal y, por consiguiente, en la salud humana. Entre ellos, se selecciona P, G o S dependiendo del nivel de clasificación que se esté analizando. Para minimizar el impacto de las clasificaciones falsas positivas, se adoptó un umbral mínimo de abundancia relativa de 1e-4 (1/10 000 lecturas). Antes del análisis estadístico, las abundancias relativas reportadas por Bracken (fraction_total_reads) se transformaron utilizando la transformación de razón logarítmica centrada (CLR) (Aitchison, 1982). El método CLR se eligió para la transformación de datos porque es invariante a la escala y suficiente para conjuntos de datos no dispersos (Gloor et al., 2017). La transformación CLR utiliza el logaritmo natural. Los datos de recuento reportados por Bracken se normalizaron utilizando la expresión logarítmica relativa (RLE) (Anders y Huber, 2010). Las figuras se generaron utilizando una combinación de matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 y logaritmos secuenciales (Gloor et al., 2017). 0.12.2 y stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). La relación Bacillus/Bacteroidetes se calculó para cada muestra utilizando recuentos bacterianos normalizados. Los valores reportados en las tablas están redondeados a 4 decimales. El índice de diversidad de Simpson se calculó utilizando el script alpha_diversity.py proporcionado en el paquete KrakenTools v. 1.2 (Lu et al., 2022). El informe de Bracken se proporciona en el script y el índice de Simpson “Si” se proporciona para el parámetro -an. Las diferencias significativas en abundancia se definieron como diferencias medias de CLR ≥ 1 o ≤ -1. Una diferencia media de CLR de ±1 indica un aumento de 2.7 veces en la abundancia de un tipo de muestra. El signo (+/-) indica si el taxón es más abundante en la muestra PPA y la muestra de control, respectivamente. La significación estadística se determinó mediante la prueba U de Mann-Whitney (Virtanen et al., 2020). Se utilizó Statsmodels v. 0.14 (Benjamini y Hochberg, 1995; Seabold y Perktold, 2010) y se aplicó el procedimiento de Benjamini-Hochberg para corregir las comparaciones múltiples. Se utilizó un valor p ajustado ≤ 0,05 como umbral para determinar la significación estadística.
El microbioma humano se suele denominar "el último órgano del cuerpo" y desempeña un papel vital en la salud humana (Baquero y Nombela, 2012). En particular, el microbioma intestinal es reconocido por su influencia sistémica y su papel en numerosas funciones esenciales. Las bacterias comensales son abundantes en el intestino, ocupando múltiples nichos ecológicos, utilizando nutrientes y compitiendo con patógenos potenciales (Jandhyala et al., 2015). Los diversos componentes bacterianos de la microbiota intestinal son capaces de producir nutrientes esenciales como vitaminas y favorecer la digestión (Rowland et al., 2018). También se ha demostrado que los metabolitos bacterianos influyen en el desarrollo tisular y potencian las vías metabólicas e inmunitarias (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). La composición del microbioma intestinal humano es extremadamente diversa y depende de factores genéticos y ambientales como la dieta, el sexo, la medicación y el estado de salud (Kumbhare et al., 2019).
La dieta materna es un componente crítico del desarrollo fetal y neonatal y una fuente potencial de compuestos que pueden influir en el desarrollo (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Uno de estos compuestos de interés es el ácido propiónico (PPA), un ácido graso de cadena corta, subproducto de la fermentación bacteriana y aditivo alimentario (den Besten et al., 2013). El PPA tiene propiedades antibacterianas y antifúngicas y, por lo tanto, se utiliza como conservante alimentario y en aplicaciones industriales para inhibir el crecimiento de moho y bacterias (Wemmenhove et al., 2016). El PPA tiene diferentes efectos en diferentes tejidos. En el hígado, el PPA tiene efectos antiinflamatorios al afectar la expresión de citoquinas en los macrófagos (Kawasoe et al., 2022). Este efecto regulador también se ha observado en otras células inmunitarias, lo que lleva a la regulación negativa de la inflamación (Haase et al., 2021). Sin embargo, se ha observado el efecto opuesto en el cerebro. Estudios previos han demostrado que la exposición a PPA induce un comportamiento similar al autismo en ratones (El-Ansary et al., 2012). Otros estudios han demostrado que el PPA puede inducir gliosis y activar vías proinflamatorias en el cerebro (Abdelli et al., 2019). Debido a que el PPA es un ácido débil, puede difundirse a través del epitelio intestinal hacia el torrente sanguíneo y, por lo tanto, atravesar barreras restrictivas, incluyendo la barrera hematoencefálica y la placenta (Stinson et al., 2019), lo que resalta la importancia del PPA como metabolito regulador producido por bacterias. Si bien el posible papel del PPA como factor de riesgo para el autismo se encuentra actualmente en investigación, sus efectos en personas con autismo podrían ir más allá de la inducción de la diferenciación neuronal.
Los síntomas gastrointestinales como la diarrea y el estreñimiento son comunes en pacientes con trastornos del neurodesarrollo (Cao et al., 2021). Estudios previos han demostrado que el microbioma de pacientes con trastornos del espectro autista (TEA) difiere del de individuos sanos, lo que sugiere la presencia de disbiosis de la microbiota intestinal (Finegold et al., 2010). De manera similar, las características del microbioma de pacientes con enfermedades inflamatorias intestinales, obesidad, enfermedad de Alzheimer, etc., también difieren de las de individuos sanos (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Sin embargo, hasta la fecha, no se ha establecido una relación causal entre el microbioma intestinal y las enfermedades o síntomas neurológicos (Yap et al., 2021), aunque se cree que varias especies bacterianas desempeñan un papel en algunos de estos estados patológicos. Por ejemplo, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio y otros géneros son más abundantes en la microbiota de pacientes con autismo (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Cabe destacar que se sabe que algunas especies de estos géneros poseen genes asociados con la producción de PPA (Reichardt et al., 2014; Yun y Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur y Dürre, 2023). Dadas las propiedades antimicrobianas del PPA, aumentar su abundancia puede ser beneficioso para el crecimiento de bacterias productoras de PPA (Jacobson et al., 2018). Por lo tanto, un entorno rico en PFA puede provocar cambios en la microbiota intestinal, incluidos los patógenos gastrointestinales, que pueden ser factores potenciales que contribuyen a los síntomas gastrointestinales.
Una cuestión central en la investigación del microbioma es si las diferencias en la composición microbiana son causa o síntoma de enfermedades subyacentes. El primer paso para dilucidar la compleja relación entre la dieta, el microbioma intestinal y las enfermedades neurológicas es evaluar los efectos de la dieta en la composición microbiana. Con este fin, utilizamos la secuenciación metagenómica de lectura larga para comparar los microbiomas intestinales de crías de ratones alimentados con una dieta rica en PPA o con una dieta deficiente en PPA. Las crías recibieron la misma dieta que sus madres. Nuestra hipótesis era que una dieta rica en PPA daría lugar a cambios en la composición microbiana intestinal y en las vías funcionales microbianas, en particular aquellas relacionadas con el metabolismo y/o la producción de PPA.
Este estudio utilizó ratones transgénicos FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories) que sobreexpresan la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control del promotor GFAP específico de la glía, siguiendo las directrices del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Florida Central (UCF-IACUC) (Número de Permiso de Uso de Animales: PROTO202000002). Después del destete, los ratones se alojaron individualmente en jaulas con 1 a 5 ratones de cada sexo por jaula. Los ratones fueron alimentados ad libitum con una dieta de control purificada (dieta estándar de etiqueta abierta modificada, 16 kcal % de grasa) o una dieta suplementada con propionato de sodio (dieta estándar de etiqueta abierta modificada, 16 kcal % de grasa, que contenía 5000 ppm de propionato de sodio). La cantidad de propionato de sodio utilizada fue equivalente a 5000 mg de PFA/kg de peso total de alimento. Esta es la concentración más alta de PPA aprobada para su uso como conservante de alimentos. Para preparar este estudio, los ratones progenitores fueron alimentados con ambas dietas durante 4 semanas antes del apareamiento y continuaron con ellas durante todo el embarazo de la madre. Las crías [22 ratones, 9 controles (6 machos, 3 hembras) y 13 PPA (4 machos, 9 hembras)] fueron destetadas y luego continuaron con la misma dieta que las madres durante 5 meses. Las crías fueron sacrificadas a los 5 meses de edad y se recolectó su contenido fecal intestinal, que inicialmente se almacenó en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml a -20 °C y luego se transfirió a un congelador a -80 °C hasta que se agotó el ADN del huésped y se extrajeron los ácidos nucleicos microbianos.
El ADN del huésped se eliminó según un protocolo modificado (Charalampous et al., 2019). Brevemente, el contenido fecal se transfirió a 500 µl de InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) y se almacenó congelado. Procese un máximo de 1-2 pellets fecales por extracción. El contenido fecal se homogeneizó mecánicamente utilizando un mortero de plástico dentro del tubo para formar una suspensión. Centrifugue las muestras a 10,000 RCF durante 5 min o hasta que las muestras se hayan sedimentado, luego aspire el sobrenadante y resuspenda el sedimento en 250 µl de PBS 1×. Agregue 250 µl de solución de saponina al 4.4% (TCI, número de producto S0019) a la muestra como detergente para aflojar las membranas de las células eucariotas. Las muestras se mezclaron suavemente hasta que quedaron homogéneas y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min. A continuación, para romper las células eucariotas, se añadieron 350 μl de agua libre de nucleasas a la muestra, se incubó durante 30 s y luego se añadieron 12 μl de NaCl 5 M. Las muestras se centrifugaron a 6000 RCF durante 5 min. Aspire el sobrenadante y resuspenda el precipitado en 100 μl de PBS 1X. Para eliminar el ADN del huésped, añada 100 μl de tampón HL-SAN (12,8568 g de NaCl, 4 ml de MgCl2 1M, 36 ml de agua libre de nucleasas) y 10 μl de enzima HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). Las muestras se mezclaron minuciosamente mediante pipeteo y se incubaron a 37 °C durante 30 minutos a 800 rpm en un Eppendorf™ ThermoMixer C. Tras la incubación, se centrifugaron a 6000 RCF durante 3 minutos y se lavaron dos veces con 800 µl y 1000 µl de PBS 1X. Finalmente, el precipitado se resuspendió en 100 µl de PBS 1X.
El ADN bacteriano total se aisló utilizando el kit de purificación de ADN genómico Monarch de New England Biolabs (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L). El procedimiento operativo estándar proporcionado con el kit se modificó ligeramente. Incubar y mantener agua libre de nucleasas a 60 °C antes de la operación para la elución final. Agregar 10 µl de proteinasa K y 3 µl de ARNasa A a cada muestra. Luego agregar 100 µl de tampón de lisis celular y mezclar suavemente. Las muestras se incubaron en un Eppendorf™ ThermoMixer C a 56 °C y 1400 rpm durante al menos 1 hora y hasta 3 horas. Las muestras incubadas se centrifugaron a 12 000 RCF durante 3 minutos y el sobrenadante de cada muestra se transfirió a un tubo de microcentrífuga separado de 1,5 ml que contenía 400 µl de solución de unión. Los tubos se agitaron en un vórtex pulsado durante 5-10 segundos a intervalos de 1 segundo. Transfiera todo el contenido líquido de cada muestra (aproximadamente 600-700 µL) a un cartucho de filtro colocado en un tubo de recolección de flujo continuo. Los tubos se centrifugaron a 1000 RCF durante 3 minutos para permitir la unión inicial del ADN y luego se centrifugaron a 12 000 RCF durante 1 minuto para eliminar el líquido residual. La columna de muestra se transfirió a un nuevo tubo de recolección y luego se lavó dos veces. Para el primer lavado, agregue 500 µL de tampón de lavado a cada tubo. Invierta el tubo 3-5 veces y luego centrifugue a 12 000 RCF durante 1 minuto. Deseche el líquido del tubo de recolección y coloque el cartucho de filtro de nuevo en el mismo tubo de recolección. Para el segundo lavado, agregue 500 µL de tampón de lavado al filtro sin invertir. Las muestras se centrifugaron a 12 000 RCF durante 1 minuto. Transfiera el filtro a un tubo LoBind® de 1,5 mL y añada 100 µL de agua libre de nucleasas precalentada. Los filtros se incubaron a temperatura ambiente durante 1 minuto y luego se centrifugaron a 12 000 RCF durante 1 minuto. El ADN eluido se almacenó a -80 °C.
La concentración de ADN se cuantificó utilizando un fluorómetro Qubit™ 4.0. El ADN se preparó utilizando el kit Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity (n.º de cat. Q33231) según las instrucciones del fabricante. La distribución de la longitud de los fragmentos de ADN se midió utilizando un TapeStation Agilent™ 4150 o 4200. El ADN se preparó utilizando los reactivos Agilent™ Genomic DNA (n.º de cat. 5067-5366) y Genomic DNA ScreenTape (n.º de cat. 5067-5365). La preparación de la biblioteca se realizó utilizando el kit Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding (SQK-RPB004) según las instrucciones del fabricante. El ADN se secuenció utilizando un secuenciador ONT GridION™ Mk1 con una celda de flujo Min106D (R 9.4.1). Los parámetros de secuenciación fueron: identificación de bases de alta precisión, valor q mínimo de 9, configuración del código de barras y recorte del código de barras. Las muestras se secuenciaron durante 72 horas, tras lo cual los datos de identificación de bases se enviaron para su posterior procesamiento y análisis.
El procesamiento bioinformático se realizó utilizando métodos descritos previamente (Greenman et al., 2024). Los archivos FASTQ obtenidos de la secuenciación se dividieron en directorios para cada muestra. Antes del análisis bioinformático, los datos se procesaron utilizando el siguiente flujo de trabajo: primero, los archivos FASTQ de las muestras se fusionaron en un único archivo FASTQ. Luego, las lecturas más cortas de 1000 pb se filtraron utilizando Filtlong v. 0.2.1, con el único parámetro modificado siendo –min_length 1000 (Wick, 2024). Antes de un filtrado adicional, la calidad de lectura se controló utilizando NanoPlot v. 1.41.3 con los siguientes parámetros: –fastq –plots dot –N50 -o
Para la clasificación taxonómica, las lecturas y los contigs ensamblados se clasificaron utilizando Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019). Genere informes y archivos de salida para lecturas y ensamblajes, respectivamente. Utilice la opción –use-names para analizar lecturas y ensamblajes. Las opciones –gzip-compressed y –paired se especifican para segmentos de lectura. La abundancia relativa de taxones en metagenomas se estimó utilizando Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017). Primero creamos una base de datos de kmer que contenía 1000 bases utilizando bracken-build con los siguientes parámetros: -d
La anotación genética y la estimación de la abundancia relativa se realizaron utilizando una versión modificada del protocolo descrito por Maranga et al. (Maranga et al., 2023). Primero, se eliminaron los contigs de menos de 500 pb de todos los ensamblajes utilizando SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). Los ensamblajes seleccionados se combinaron en un pan-metagenoma. Los marcos de lectura abiertos (ORF) se identificaron utilizando Prodigal v. 1.0.1 (una versión paralela de Prodigal v. 2.6.3) con los siguientes parámetros: -d
Los genes se agruparon primero según los identificadores de ortólogos (KO) de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) asignados por eggNOG para comparar la abundancia de las vías génicas. Los genes sin knockouts o con múltiples knockouts se eliminaron antes del análisis. Luego se calculó la abundancia promedio de cada KO por muestra y se realizó un análisis estadístico. Los genes del metabolismo de PPA se definieron como cualquier gen al que se le asignó una fila ko00640 en la columna KEGG_Pathway, lo que indica una función en el metabolismo del propionato según KEGG. Los genes identificados como asociados con la producción de PPA se enumeran en la Tabla Suplementaria 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Se realizaron pruebas de permutación para identificar los genes del metabolismo y la producción de PPA que eran significativamente más abundantes en cada tipo de muestra. Se realizaron mil permutaciones para cada gen analizado. Se utilizó un valor p de 0,05 como umbral para determinar la significación estadística. Se asignaron anotaciones funcionales a genes individuales dentro de un clúster basándose en las anotaciones de genes representativos dentro del clúster. Los taxones asociados con el metabolismo y/o la producción de PPA se pudieron identificar comparando los ID de contig en los archivos de salida de Kraken2 con los mismos ID de contig retenidos durante la anotación funcional con eggNOG. Las pruebas de significancia se realizaron utilizando la prueba U de Mann-Whitney descrita previamente. La corrección para comparaciones múltiples se realizó utilizando el procedimiento de Benjamini-Hochberg. Se utilizó un valor p ≤ 0,05 como umbral para determinar la significancia estadística.
La diversidad del microbioma intestinal de los ratones se evaluó mediante el índice de diversidad de Simpson. No se observaron diferencias significativas entre las muestras de control y PPA en cuanto a la diversidad de géneros y especies (valor p para género: 0,18; valor p para especie: 0,16) (Figura 1). Posteriormente, se comparó la composición microbiana mediante análisis de componentes principales (ACP). La Figura 2 muestra la agrupación de las muestras por filos, lo que indica diferencias en la composición de especies de los microbiomas entre las muestras de PPA y control. Esta agrupación fue menos pronunciada a nivel de género, lo que sugiere que el PPA afecta a ciertas bacterias (Figura suplementaria 1).
Figura 1. Diversidad alfa de géneros y composición de especies del microbioma intestinal del ratón. Diagramas de caja que muestran los índices de diversidad de Simpson de géneros (A) y especies (B) en muestras PPA y de control. La significación se determinó mediante la prueba U de Mann-Whitney y se realizó una corrección para comparaciones múltiples mediante el procedimiento de Benjamini-Hochberg. ns: el valor p no fue significativo (p > 0,05).
Figura 2. Resultados del análisis de componentes principales de la composición del microbioma intestinal del ratón a nivel de especie. El gráfico del análisis de componentes principales muestra la distribución de las muestras en sus dos primeros componentes principales. Los colores indican el tipo de muestra: los ratones expuestos a PPA son morados y los ratones control son amarillos. Los componentes principales 1 y 2 se representan en los ejes x e y, respectivamente, y se expresan como su proporción de varianza explicada.
Utilizando datos de recuento transformados mediante RLE, se observó una disminución significativa en la mediana de la relación Bacteroidetes/Bacilli en ratones control y PPA (control: 9,66, PPA: 3,02; valor p = 0,0011). Esta diferencia se debió a una mayor abundancia de Bacteroidetes en los ratones PPA en comparación con los controles, aunque la diferencia no fue significativa (media de CLR en control: 5,51, media de CLR en PPA: 6,62; valor p = 0,054), mientras que la abundancia de Bacteroidetes fue similar (media de CLR en control: 7,76, media de CLR en PPA: 7,60; valor p = 0,18).
El análisis de la abundancia de miembros taxonómicos del microbioma intestinal reveló que 1 filo y 77 especies diferían significativamente entre las muestras de PPA y las de control (Tabla suplementaria 2). La abundancia de 59 especies en las muestras de PPA fue significativamente mayor que en las muestras de control, mientras que la abundancia de solo 16 especies en las muestras de control fue mayor que en las muestras de PPA (Figura 3).
Figura 3. Abundancia diferencial de taxones en el microbioma intestinal de ratones PPA y control. Los gráficos de volcán muestran las diferencias en la abundancia de géneros (A) o especies (B) entre las muestras PPA y control. Los puntos grises indican que no hay diferencia significativa en la abundancia de taxones. Los puntos de color indican diferencias significativas en la abundancia (valor p ≤ 0,05). Los 20 taxones con las mayores diferencias en abundancia entre los tipos de muestra se muestran en rojo y azul claro (muestras control y PPA), respectivamente. Los puntos amarillos y morados fueron al menos 2,7 veces más abundantes en las muestras control o PPA que en los controles. Los puntos negros representan taxones con abundancias significativamente diferentes, con diferencias medias de CLR entre -1 y 1. Los valores p se calcularon utilizando la prueba U de Mann-Whitney y se corrigieron para pruebas múltiples utilizando el procedimiento de Benjamini-Hochberg. Las diferencias medias de CLR en negrita indican diferencias significativas en la abundancia.
Tras analizar la composición microbiana intestinal, realizamos una anotación funcional del microbioma. Después de filtrar los genes de baja calidad, se identificaron un total de 378.355 genes únicos en todas las muestras. La abundancia transformada de estos genes se utilizó para el análisis de componentes principales (ACP), y los resultados mostraron un alto grado de agrupamiento de los tipos de muestras en función de sus perfiles funcionales (Figura 4).
Figura 4. Resultados del análisis de componentes principales (ACP) utilizando el perfil funcional del microbioma intestinal del ratón. El gráfico del ACP muestra la distribución de las muestras en sus dos primeros componentes principales. Los colores indican el tipo de muestra: los ratones expuestos a PPA son morados y los ratones control son amarillos. Los componentes principales 1 y 2 se representan en los ejes x e y, respectivamente, y se expresan como su proporción de varianza explicada.
A continuación, examinamos la abundancia de knockouts de KEGG en diferentes tipos de muestras. Se identificaron un total de 3648 knockouts únicos, de los cuales 196 fueron significativamente más abundantes en muestras de control y 106 fueron más abundantes en muestras de PPA (Figura 5). Se detectaron un total de 145 genes en muestras de control y 61 genes en muestras de PPA, con abundancias significativamente diferentes. Las vías relacionadas con el metabolismo de lípidos y aminoazúcares fueron significativamente más enriquecidas en muestras de PPA (Tabla suplementaria 3). Las vías relacionadas con el metabolismo del nitrógeno y los sistemas de relevo de azufre fueron significativamente más enriquecidas en muestras de control (Tabla suplementaria 3). La abundancia de genes relacionados con el metabolismo de aminoazúcares/nucleótidos (ko:K21279) y el metabolismo del fosfato de inositol (ko:K07291) fue significativamente mayor en muestras de PPA (Figura 5). Las muestras de control tenían significativamente más genes relacionados con el metabolismo del benzoato (ko:K22270), el metabolismo del nitrógeno (ko:K00368) y la glucólisis/gluconeogénesis (ko:K00131) ( Figura 5 ).
Fig. 5. Abundancia diferencial de KOs en el microbioma intestinal de ratones PPA y control. El gráfico de volcán muestra las diferencias en la abundancia de grupos funcionales (KOs). Los puntos grises indican KOs cuya abundancia no fue significativamente diferente entre los tipos de muestra (valor p > 0,05). Los puntos de color indican diferencias significativas en la abundancia (valor p ≤ 0,05). Los 20 KOs con las mayores diferencias en abundancia entre los tipos de muestra se muestran en rojo y azul claro, correspondientes a las muestras de control y PPA, respectivamente. Los puntos amarillos y morados indican KOs que fueron al menos 2,7 veces más abundantes en las muestras de control y PPA, respectivamente. Los puntos negros indican KOs con abundancias significativamente diferentes, con diferencias medias de CLR entre -1 y 1. Los valores p se calcularon utilizando la prueba U de Mann-Whitney y se ajustaron para comparaciones múltiples utilizando el procedimiento de Benjamini-Hochberg. NaN indica que el KO no pertenece a una vía en KEGG. Los valores de diferencia media de CLR en negrita indican diferencias significativas en la abundancia. Para obtener información detallada sobre las vías metabólicas a las que pertenecen los KO enumerados, consulte la Tabla complementaria 3.
Entre los genes anotados, 1601 genes presentaron abundancias significativamente diferentes entre los tipos de muestra (p ≤ 0,05), siendo cada gen al menos 2,7 veces más abundante. De estos genes, 4 genes fueron más abundantes en las muestras de control y 1597 genes fueron más abundantes en las muestras de PPA. Debido a que el PPA tiene propiedades antimicrobianas, examinamos las abundancias de los genes de metabolismo y producción de PPA entre los tipos de muestra. Entre los 1332 genes relacionados con el metabolismo del PPA, 27 genes fueron significativamente más abundantes en las muestras de control y 12 genes fueron más abundantes en las muestras de PPA. Entre los 223 genes relacionados con la producción de PPA, 1 gen fue significativamente más abundante en las muestras de PPA. La Figura 6A demuestra además la mayor abundancia de genes involucrados en el metabolismo del PPA, con una abundancia significativamente mayor en las muestras de control y grandes tamaños del efecto, mientras que la Figura 6B destaca genes individuales con una abundancia significativamente mayor observada en las muestras de PPA.
Fig. 6. Abundancia diferencial de genes relacionados con PPA en el microbioma intestinal del ratón. Los gráficos de volcán muestran las diferencias en la abundancia de genes asociados con el metabolismo de PPA (A) y la producción de PPA (B). Los puntos grises indican genes cuya abundancia no fue significativamente diferente entre los tipos de muestra (valor p > 0,05). Los puntos de color indican diferencias significativas en la abundancia (valor p ≤ 0,05). Los 20 genes con las mayores diferencias en abundancia se muestran en rojo y azul claro (muestras de control y PPA), respectivamente. La abundancia de puntos amarillos y morados fue al menos 2,7 veces mayor en las muestras de control y PPA que en las muestras de control. Los puntos negros representan genes con abundancias significativamente diferentes, con diferencias medias de CLR entre -1 y 1. Los valores p se calcularon utilizando la prueba U de Mann-Whitney y se corrigieron para comparaciones múltiples utilizando el procedimiento de Benjamini-Hochberg. Los genes corresponden a genes representativos en el catálogo de genes no redundantes. Los nombres de los genes consisten en el símbolo KEGG que denota un gen KO. Las diferencias medias de CLR en negrita indican abundancias significativamente diferentes. Un guion (-) indica que no existe un símbolo para el gen en la base de datos KEGG.
Se identificaron taxones con genes relacionados con el metabolismo y/o la producción de PPA mediante la comparación de la identidad taxonómica de los contigs con el ID del contig del gen. A nivel de género, se encontraron 130 géneros con genes relacionados con el metabolismo de PPA y 61 géneros con genes relacionados con la producción de PPA (Tabla suplementaria 4). Sin embargo, ningún género mostró diferencias significativas en abundancia (p > 0,05).
A nivel de especie, se encontraron 144 especies bacterianas con genes asociados al metabolismo de PPA y 68 especies bacterianas con genes asociados a la producción de PPA (Tabla suplementaria 5). Entre los metabolizadores de PPA, ocho bacterias mostraron aumentos significativos en abundancia entre los tipos de muestra, y todas mostraron cambios significativos en el efecto (Tabla suplementaria 6). Todos los metabolizadores de PPA identificados con diferencias significativas en abundancia fueron más abundantes en las muestras de PPA. La clasificación a nivel de especie reveló representantes de géneros que no difirieron significativamente entre los tipos de muestra, incluyendo varias especies de Bacteroides y Ruminococcus, así como Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus y Alcaligenes polymorpha. Entre las bacterias productoras de PPA, cuatro bacterias mostraron diferencias significativas en abundancia entre los tipos de muestra. Las especies con diferencias significativas en abundancia incluyeron Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis y Ruminococcus bovis.
En este estudio, examinamos los efectos de la exposición a PPA en la microbiota intestinal de ratones. El PPA puede provocar diferentes respuestas en las bacterias debido a que es producido por ciertas especies, utilizado como fuente de alimento por otras o posee efectos antimicrobianos. Por lo tanto, su adición al entorno intestinal mediante suplementación dietética puede tener diferentes efectos dependiendo de la tolerancia, la susceptibilidad y la capacidad de utilizarlo como fuente de nutrientes. Las especies bacterianas sensibles pueden ser eliminadas y reemplazadas por aquellas más resistentes al PPA o capaces de utilizarlo como fuente de alimento, lo que conlleva cambios en la composición de la microbiota intestinal. Nuestros resultados revelaron diferencias significativas en la composición microbiana, pero ningún efecto en la diversidad microbiana general. Los mayores efectos se observaron a nivel de especie, con más de 70 taxones significativamente diferentes en abundancia entre las muestras con PPA y las muestras control (Tabla suplementaria 2). Una evaluación adicional de la composición de las muestras expuestas a PPA reveló una mayor heterogeneidad de especies microbianas en comparación con las muestras no expuestas, lo que sugiere que el PPA puede potenciar las características de crecimiento bacteriano y limitar las poblaciones bacterianas que pueden sobrevivir en entornos ricos en PPA. Por lo tanto, el PPA puede inducir cambios de forma selectiva en lugar de causar una alteración generalizada de la diversidad de la microbiota intestinal.
Se ha demostrado previamente que los conservantes alimentarios como el PPA alteran la abundancia de componentes del microbioma intestinal sin afectar la diversidad general (Nagpal et al., 2021). Aquí, observamos las diferencias más notables entre las especies de Bacteroidetes dentro del filo Bacteroidetes (anteriormente conocido como Bacteroidetes), que se enriquecieron significativamente en ratones expuestos a PPA. El aumento de la abundancia de especies de Bacteroides se asocia con una mayor degradación del moco, lo que puede aumentar el riesgo de infección y promover la inflamación (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Un estudio encontró que los ratones macho neonatos tratados con Bacteroides fragilis exhibieron comportamientos sociales que recuerdan al trastorno del espectro autista (TEA) (Carmel et al., 2023), y otros estudios han demostrado que las especies de Bacteroides pueden alterar la actividad inmunitaria y conducir a una cardiomiopatía inflamatoria autoinmune (Gil-Cruz et al., 2019). Las especies pertenecientes a los géneros Ruminococcus, Prevotella y Parabacteroides también aumentaron significativamente en ratones expuestos a PPA (Coretti et al., 2018). Ciertas especies de Ruminococcus están asociadas con enfermedades como la enfermedad de Crohn a través de la producción de citocinas proinflamatorias (Henke et al., 2019), mientras que las especies de Prevotella, como Prevotella humani, están asociadas con enfermedades metabólicas como la hipertensión y la resistencia a la insulina (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Finalmente, encontramos que la proporción de Bacteroidetes (anteriormente conocidos como Firmicutes) a Bacteroidetes fue significativamente menor en ratones expuestos a PPA que en ratones control debido a una mayor abundancia total de especies de Bacteroidetes. Se ha demostrado previamente que esta proporción es un indicador importante de la homeostasis intestinal, y las alteraciones en esta proporción se han asociado con varios estados patológicos (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), incluidas las enfermedades inflamatorias intestinales (Stojanov et al., 2020). En conjunto, las especies del filo Bacteroidetes parecen ser las más afectadas por un aumento de PPA en la dieta. Esto puede deberse a una mayor tolerancia al PPA o a la capacidad de utilizarlo como fuente de energía, lo cual se ha demostrado que es cierto para al menos una especie, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Alternativamente, la exposición materna al PPA podría mejorar el desarrollo fetal al hacer que el intestino de las crías de ratón sea más susceptible a la colonización por Bacteroidetes; sin embargo, el diseño de nuestro estudio no permitió dicha evaluación.
La evaluación del contenido metagenómico reveló diferencias significativas en la abundancia de genes asociados con el metabolismo y la producción de PPA, con ratones expuestos a PPA que exhibieron una mayor abundancia de genes responsables de la producción de PPA, mientras que los ratones no expuestos a PPA exhibieron una mayor abundancia de genes responsables del metabolismo de PAA (Figura 6). Estos resultados sugieren que el efecto de PPA en la composición microbiana puede no deberse únicamente a su uso, de lo contrario, la abundancia de genes asociados con el metabolismo de PPA debería haber mostrado una mayor abundancia en el microbioma intestinal de los ratones expuestos a PPA. Una explicación es que PPA media la abundancia bacteriana principalmente a través de sus efectos antimicrobianos más que a través de su uso por las bacterias como nutriente. Estudios previos han demostrado que PPA inhibe el crecimiento de Salmonella Typhimurium de manera dosis-dependiente (Jacobson et al., 2018). La exposición a concentraciones más altas de PPA puede seleccionar bacterias que son resistentes a sus propiedades antimicrobianas y que no necesariamente pueden metabolizarlo o producirlo. Por ejemplo, varias especies de Parabacteroides mostraron una abundancia significativamente mayor en las muestras de PPA, pero no se detectaron genes relacionados con el metabolismo o la producción de PPA (Tablas suplementarias 2, 4 y 5). Además, la producción de PPA como subproducto de la fermentación está ampliamente distribuida entre varias bacterias (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Una mayor diversidad bacteriana puede ser la razón de la mayor abundancia de genes relacionados con el metabolismo de PPA en las muestras de control (Averina et al., 2020). Además, solo 27 (2,14%) de 1332 genes se predijeron como genes asociados exclusivamente con el metabolismo de PPA. Muchos genes asociados con el metabolismo de PPA también están involucrados en otras vías metabólicas. Esto demuestra aún más que la abundancia de genes involucrados en el metabolismo de PPA fue mayor en las muestras de control; estos genes pueden funcionar en vías que no resultan en la utilización o formación de PPA como subproducto. En este caso, solo un gen asociado con la generación de PPA mostró diferencias significativas en abundancia entre los tipos de muestra. A diferencia de los genes asociados con el metabolismo de PPA, se seleccionaron genes marcadores para la producción de PPA porque participan directamente en la vía bacteriana para su producción. En ratones expuestos a PPA, se observó un aumento significativo en la abundancia y la capacidad de producción de PPA en todas las especies. Esto respalda la predicción de que los PPA seleccionarían a los productores de PPA y, por lo tanto, predecirían un aumento en la capacidad de producción de PPA. Sin embargo, la abundancia de genes no necesariamente se correlaciona con la expresión génica; por lo tanto, aunque la abundancia de genes asociados con el metabolismo de PPA sea mayor en las muestras de control, la tasa de expresión puede ser diferente (Shi et al., 2014). Para confirmar la relación entre la prevalencia de genes productores de PPA y la producción de PPA, se necesitan estudios de la expresión de genes involucrados en la producción de PPA.
La anotación funcional de los metagenomas de PPA y control reveló algunas diferencias. El análisis PCA del contenido genético reveló grupos discretos entre las muestras de PPA y control (Figura 5). El agrupamiento dentro de la muestra reveló que el contenido genético de control era más diverso, mientras que las muestras de PPA se agruparon juntas. El agrupamiento por contenido genético fue comparable al agrupamiento por composición de especies. Por lo tanto, las diferencias en la abundancia de vías son consistentes con cambios en la abundancia de especies y cepas específicas dentro de ellas. En las muestras de PPA, dos vías con una abundancia significativamente mayor estaban relacionadas con el metabolismo de aminoazúcares/nucleótidos de azúcar (ko:K21279) y múltiples vías de metabolismo lipídico (ko:K00647, ko:K03801; Tabla suplementaria 3). Se sabe que los genes asociados con ko:K21279 están asociados con el género Bacteroides, uno de los géneros con un número significativamente mayor de especies en las muestras de PPA. Esta enzima puede evadir la respuesta inmune mediante la expresión de polisacáridos capsulares (Wang et al., 2008). Esto podría explicar el aumento de Bacteroidetes observado en ratones expuestos a PPA. Esto complementa el aumento de la síntesis de ácidos grasos observado en el microbioma de PPA. Las bacterias utilizan la vía FASIIko:K00647 (fabB) para producir ácidos grasos, que pueden influir en las vías metabólicas del huésped (Yao y Rock, 2015; Johnson et al., 2020), y los cambios en el metabolismo lipídico pueden desempeñar un papel en el neurodesarrollo (Yu et al., 2020). Otra vía que mostró una mayor abundancia en muestras de PPA fue la biosíntesis de hormonas esteroides (ko:K12343). Existe evidencia creciente de que hay una relación inversa entre la capacidad de la microbiota intestinal para influir en los niveles hormonales y ser influenciada por las hormonas, de modo que los niveles elevados de esteroides pueden tener consecuencias para la salud a largo plazo (Tetel et al., 2018).
Este estudio presenta limitaciones y consideraciones. Una distinción importante es que no realizamos evaluaciones fisiológicas de los animales. Por lo tanto, no es posible concluir directamente si los cambios en el microbioma están asociados con alguna enfermedad. Otra consideración es que los ratones de este estudio recibieron la misma dieta que sus madres. Futuros estudios podrían determinar si el cambio de una dieta rica en PPA a una libre de PPA mejora sus efectos sobre el microbioma. Una limitación de nuestro estudio, como en muchos otros, es el tamaño limitado de la muestra. Si bien se pueden extraer conclusiones válidas, un tamaño de muestra mayor proporcionaría mayor potencia estadística al analizar los resultados. También somos cautelosos al extraer conclusiones sobre una asociación entre los cambios en el microbioma intestinal y cualquier enfermedad (Yap et al., 2021). Factores de confusión como la edad, el sexo y la dieta pueden influir significativamente en la composición de los microorganismos. Estos factores podrían explicar las inconsistencias observadas en la literatura con respecto a la asociación del microbioma intestinal con enfermedades complejas (Johnson et al., 2019; Lagod y Naser, 2023). Por ejemplo, se ha demostrado que los miembros del género Bacteroidetes aumentan o disminuyen en animales y humanos con TEA (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). De manera similar, estudios de la composición intestinal en pacientes con enfermedades inflamatorias intestinales han encontrado aumentos y disminuciones en los mismos taxones (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Para limitar el impacto del sesgo de género, intentamos asegurar una representación equitativa de los sexos para que las diferencias fueran probablemente impulsadas por la dieta. Un desafío de la anotación funcional es la eliminación de secuencias genéticas redundantes. Nuestro método de agrupamiento de genes requiere 95 % de identidad de secuencia y 85 % de similitud de longitud, así como 90 % de cobertura de alineación para eliminar agrupamientos falsos. Sin embargo, en algunos casos, observamos COG con las mismas anotaciones (por ejemplo, MUT) (Fig. 6). Se necesitan más estudios para determinar si estos ortólogos son distintos, si están asociados a géneros específicos o si se trata de una limitación del método de agrupamiento de genes. Otra limitación de la anotación funcional es la posible clasificación errónea; el gen bacteriano mmdA es una enzima conocida implicada en la síntesis de propionato, pero KEGG no lo asocia con la vía metabólica del propionato. En cambio, los ortólogos scpB y mmcD están relacionados. El gran número de genes sin knockouts designados puede resultar en la incapacidad de identificar genes relacionados con PPA al evaluar la abundancia génica. Los estudios futuros se beneficiarán del análisis del metatranscriptoma, que puede proporcionar una comprensión más profunda de las características funcionales de la microbiota intestinal y vincular la expresión génica con posibles efectos posteriores. Para los estudios que involucran trastornos del neurodesarrollo específicos o enfermedades inflamatorias intestinales, se necesitan evaluaciones fisiológicas y conductuales de los animales para vincular los cambios en la composición del microbioma con estos trastornos. Los estudios adicionales que trasplanten el microbioma intestinal a ratones libres de gérmenes también serían útiles para determinar si el microbioma es un factor desencadenante o una característica de la enfermedad.
En resumen, demostramos que el PPA dietético actúa como un factor que altera la composición de la microbiota intestinal. El PPA es un conservante aprobado por la FDA, ampliamente presente en diversos alimentos, que, tras una exposición prolongada, puede provocar la alteración de la flora intestinal normal. Observamos cambios en la abundancia de varias bacterias, lo que sugiere que el PPA puede influir en la composición de la microbiota intestinal. Estos cambios en la microbiota pueden provocar alteraciones en los niveles de ciertas vías metabólicas, lo que a su vez puede generar cambios fisiológicos relevantes para la salud del huésped. Se necesitan más estudios para determinar si los efectos del PPA dietético sobre la composición microbiana pueden provocar disbiosis u otras enfermedades. Este estudio sienta las bases para futuras investigaciones sobre cómo los efectos del PPA en la composición intestinal pueden repercutir en la salud humana.
Los conjuntos de datos presentados en este estudio están disponibles en repositorios en línea. El nombre del repositorio y el número de acceso son: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Este estudio con animales fue aprobado por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Florida Central (UCF-IACUC) (Número de Permiso de Uso de Animales: PROTO202000002). Este estudio cumple con las leyes, regulaciones y requisitos institucionales locales.
NG: Conceptualización, Curación de datos, Análisis formal, Investigación, Metodología, Software, Visualización, Redacción (borrador original), Redacción (revisión y edición). LA: Conceptualización, Curación de datos, Metodología, Recursos, Redacción (revisión y edición). SH: Análisis formal, Software, Redacción (revisión y edición). SA: Investigación, Redacción (revisión y edición). Juez principal: Investigación, Redacción (revisión y edición). SN: Conceptualización, Administración del proyecto, Recursos, Supervisión, Redacción (revisión y edición). TA: Conceptualización, Administración del proyecto, Supervisión, Redacción (revisión y edición).
Los autores declaran no haber recibido ningún tipo de apoyo financiero para la investigación, la redacción y/o la publicación de este artículo.
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Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). El ácido propiónico induce gliosis y neuroinflamación mediante la regulación de la vía PTEN/AKT en los trastornos del espectro autista. Scientific Reports 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Análisis estadístico de datos composicionales. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). La relación Firmicutes/Bacteroidetes como factor de riesgo para el cáncer de mama. Journal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Análisis de expresión diferencial de datos de recuento de secuencias. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI, et al. (2013). Microbiota fecal y metaboloma en niños con autismo y trastorno generalizado del desarrollo no especificado. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Características neurometabólicas bacterianas de la microbiota intestinal en niños pequeños con trastornos del espectro autista. Journal of Medical Microbiology 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). El microbioma como órgano humano. Clinical Microbiology and Infection 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Nuevos conocimientos sobre la fisiología de las bacterias productoras de ácido propiónico: Anaerotignum propionicum y Anaerotignum neopropionicum (anteriormente Clostridium propionicum y Clostridium neopropionicum). Microorganisms 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Nutrición materna y desarrollo fetal. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., y Hochberg, J. (1995). Control del índice de falsos positivos: Un enfoque práctico y eficiente para las pruebas múltiples. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Fecha de publicación: 18 de abril de 2025