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A diferencia de los vertebrados, se cree ampliamente que los insectos carecen de hormonas esteroides sexuales con sesgo masculino. En Anopheles gambiae, el esteroide ecdisona 20-hidroxiecdisona (20E) parece haber evolucionado para controlar el desarrollo de los huevos cuando es sintetizado por las hembras2 y para inducir un período refractario al apareamiento cuando es transferido sexualmente por los machos3. Dado que el desarrollo de los huevos y el apareamiento son rasgos reproductivos esenciales, comprender cómo las hembras de mosquitos Anopheles integran estas señales hormonales podría facilitar el diseño de nuevos programas de control de la malaria. Aquí, revelamos que estas funciones reproductivas están reguladas por distintos esteroides sexuales a través de una red compleja de enzimas activadoras/inactivadoras de ecdisteroides. Identificamos una ecdisona oxidada específica de los machos, la 3-dehidro-20E (3D20E), que protege la paternidad al suprimir la receptividad sexual femenina después de la transferencia sexual y la activación por desfosforilación. Cabe destacar que la transferencia de 3D20E también indujo la expresión de genes reproductivos que mantienen el desarrollo de los huevos durante la infección por Plasmodium, asegurando la salud de los infectados. Las hembras no producen una respuesta sexual a partir del 20E, pero permiten que los individuos en proceso de apareamiento pongan huevos una vez inhibidas las quinasas inhibidoras del 20E. La identificación de esta hormona esteroide específica de los insectos machos y su función en la regulación de la receptividad sexual femenina, la fertilidad y la interacción con el Plasmodium sugiere el potencial de reducir el éxito reproductivo de los mosquitos transmisores de la malaria.
Los casos y muertes por malaria están aumentando nuevamente4 debido a la resistencia generalizada a los insecticidas en los mosquitos Anopheles, el único vector de los parásitos de la malaria humana. La biología de apareamiento de estos mosquitos es un objetivo particularmente atractivo para nuevas intervenciones de control de la malaria porque las hembras solo se aparean una vez5; hacer que este único evento de apareamiento sea estéril tendría un gran potencial para reducir las poblaciones de mosquitos en el campo.
Las mujeres quedan sexualmente incapacitadas tras recibir hormonas esteroides en altas concentraciones de los hombres. Estudios han demostrado que el desencadenante de la dificultad para aparearse es la 20-hidroxiecdisona (20E), una hormona esteroide conocida por regular el ciclo de muda en la etapa larvaria. La capacidad de los machos para sintetizar y transferir 20E ha evolucionado específicamente en las especies de Anopheles que forman parte del subgénero Cellia7, distribuido en África e incluye los vectores más peligrosos de la malaria, como Anopheles gambiae. Esto es especialmente destacable porque en estas especies las hembras también producen 20E después de cada ingesta de sangre, y la 20E impulsa el ciclo de ovogénesis (véase ref. 8). Sin embargo, se sabe poco sobre cómo las hembras integran las señales de dos fuentes diferentes de ecdisona (transferencia masculina e inducción de la alimentación con sangre) sin comprometer su propia capacidad de aparearse. De hecho, si la 20E producida por las hembras desencadena intolerancia sexual, esto provocará infertilidad en individuos que se alimentan de sangre virgen. un comportamiento muy común en estos mosquitos5.
Una posible explicación es que los machos de A. gambiae transfieren una ecdisona modificada específica para machos, que activa una cascada de señalización en el tracto reproductivo femenino, lo que produce inestabilidad en el apareamiento. Sin embargo, aunque los vertebrados tienen múltiples hormonas esteroides, como el estrógeno y el andrógeno (revisado en la referencia 9), hasta donde sabemos, no se han identificado esteroides con sesgo androgénico en los insectos.
Nos propusimos determinar el repertorio de hormonas esteroides en la glándula accesoria masculina (GMA) de A. gambiae sexualmente madura en busca de posibles esteroides modificadores. Utilizando cromatografía líquida de alta resolución acoplada con espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS) en lugar del método menos específico utilizado anteriormente, detectamos ecdisona (E) y 20E en este tejido, lo que confirma el resultado anterior. Sin embargo, la muestra estaba dominada por esteroides fosforilados oxidados, consistentes con la fórmula 3-deshidro-20E-22-fosfato (3D20E22P)12 (Figura 1). Otras formas incluyen 3-deshidro-20E (3D20E) y 20E-22-fosfato (20E22P). La intensidad de la señal HPLC-MS/MS de 3D20E22P fue dos órdenes de magnitud mayor que su forma desfosforilada, 3D20E, y tres órdenes de magnitud mayor que la de E y 20E (Figura 1). Aunque en otras partes del cuerpo y el tracto reproductivo inferior (LRT; Datos extendidos Fig. 1a). También analizamos ecdisteroides en machos y hembras recién cerrados (<1 día de edad) y detectamos 3D20E y 3D20E22P solo en MAG; E, 20E y 20E22P estaban presentes en ambos sexos (Datos extendidos Fig. 1b). Estos datos sugieren que los machos adultos de A. gambiae producen altos títulos de hormonas modificadoras en sus MAG que no son sintetizadas por las hembras.
Se diseccionaron MAG y LRT hembra (incluidas aurículas, vesículas seminales y parovario) de machos vírgenes de 4 días de edad (4 días de edad) y hembras vírgenes y apareadas (0,5, 3 y 12 hpm). La ecdisona en estos tejidos se analizó mediante HPLC-MS/MS (media ± sem; prueba t no pareada, bilateral, tasa de falsos descubrimientos (FDR) corregida; NS, no significativo; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 horas frente a 0,5 horas, P = 0,035; 12 horas frente a 3 horas, P = 0,0015; 12 horas frente a 0,5 horas, P = 0,030. 3D20E22P: 3 horas frente a 0,5 horas, P = 0,25; 12 horas frente a 3 horas, P = 0,0032; 12 horas frente a 0,5 horas, P = 0,015). Los datos proceden de tres réplicas biológicas. Se calculó el área del pico de cada ecdisona de interés y se normalizó según el número de mosquitos. La ecdisona se representa por color de la siguiente manera: E, verde; 20E, naranja; 20E22P, violeta; 3D20E, azul; 3D20E22P, rosa. El recuadro aumenta la escala en el eje y para mostrar niveles de ecdisona más bajos.
Para investigar si 3D20E22P y 3D20E se transfieren durante el apareamiento, diseccionamos LRT hembras en varios puntos temporales después del apareamiento. Aunque no se encontró ecdisona en vírgenes, observamos cantidades sustanciales de 3D20E22P en el LRT inmediatamente después del apareamiento (0,5 h después del apareamiento, hpm), disminuyendo con el tiempo, mientras que los niveles de 3D20E aumentaron significativamente (Fig. 1). Utilizando 3D20E sintetizado químicamente como estándar, determinamos que los niveles de esta hormona esteroide en LRT de apareamiento eran al menos 100 veces más altos que 20E (Tabla de datos extendidos 1). Por lo tanto, 3D20E22P es la principal ecdisona masculina que se transfiere al LRT hembra durante el apareamiento, y su forma desfosforilada, 3D20E, se vuelve muy abundante poco después del apareamiento. Esto sugiere un papel importante para esta última ecdisona en la biología femenina posterior al apareamiento.
Después de generar un nuevo conjunto de datos de secuenciación de ARN (RNA-seq) (Fig. 2a), utilizando una tubería bioinformática personalizada, buscamos la ecdisona quinasa (EcK), la ecdisona oxidasa (EO) y el gen de la fosfatasa modificada por 20E que codifica la ecdisona. EPP) se expresa en tejidos reproductivos. Identificamos un gen candidato para EPP y dos posibles genes EcK (EcK1 y EcK2), pero no pudimos encontrar un buen gen candidato para EO. Cabe destacar que los genes EPP individuales se expresaron en niveles altos (percentil 98,9) en MAG de Gambia, pero no en LRT hembras (Fig. 2b), contrariamente a nuestras expectativas, ya que la desfosforilación de 3D20E22P ocurrió en este tejido femenino. Por lo tanto, creemos que la EPP masculina puede transferirse durante el apareamiento. De hecho, utilizamos el marcaje de isótopos estables in vivo para enmascarar la proteína femenina después del apareamiento, una enzima identificada por MS en la hembra atrio (Fig. 2c y Tabla suplementaria 1). La presencia de EPP en MAG y LRT hembras apareadas (pero no vírgenes) también se confirmó utilizando anticuerpos específicos (Fig. 2d).
a, Una tubería bioinformática hecha a medida para buscar en los tejidos reproductivos de cada sexo genes que codifican EcKs, EOs y EPPs.Los números junto a las flechas indican el número de candidatos masculinos y femeninos en cada paso.Este análisis identificó un gen EPP (EPP) y un gen EcK (EcK1) que se expresan en machos, y un gen EcK (EcK2) que se expresa en ambos sexos pero que no produce un gen EO candidato.b, Mapa de calor que compara la expresión de genes candidatos en tejidos vírgenes (V) y de apareamiento (M) de Anopheles gambiae y Anopheles albicans.Spca, fertilización; MAGs, glándulas accesorias en machos; Otras partes del cuerpo, incluyendo pechos, alas, patas, cuerpos grasos y órganos internos en ambos sexos, y ovarios en las hembras. EcK2 se expresa en gran medida tanto en MAG como en aurículas de Gambia, mientras que EPP se encuentra solo en MAG. c, Análisis proteómico de la translocación del grupo de eyaculado masculino en las aurículas femeninas a 3, 12 y 24 hpm, que muestra las 67 proteínas más abundantes. Las hembras se criaron con una dieta que contenía 15N para marcar (y enmascarar) todas las proteínas. Los machos no marcados se aparearon con hembras marcadas, y los LRT femeninos se diseccionaron a 3, 12 y 24 hpm para el análisis proteómico (consulte la Tabla complementaria 1 para obtener una lista completa de las proteínas eyaculadoras). Recuadro: EPP, Eck1 y EcK2 se detectaron en el MAG de machos vírgenes mediante análisis proteómico de estos tejidos. d, EPP se detectó mediante transferencia Western en MAG y LRT de hembras apareadas, pero no en hembras vírgenes o machos o el resto del cuerpo femenino. Las membranas se sondearon simultáneamente con anticuerpos anti-actina (control de carga) y anti-EPP. Todos los machos son vírgenes. Consulte la Figura 1 complementaria para obtener datos de la fuente del gel. Los Western blots se realizaron dos veces con resultados similares.
La actividad fosfofosfatasa ecdiesteroide de EPP se verificó después de la incubación por HPLC-MS/MS con 3D20E22P aislado de MAG (Fig. 2a de Datos Extendidos). Además, cuando silenciamos EPP por interferencia mediada por ARN (ARNi), detectamos una fuerte reducción en la actividad de la fosfatasa en los tejidos reproductivos de estos machos (Fig. 3a), y las hembras apareadas con machos silenciados con EPP mostraron una proporción significativamente menor de 3D20E desfosforilada (Fig. 3b) a pesar del silenciamiento parcial del gen (Fig. 2b,c de Datos Extendidos). Por el contrario, no detectamos cambios significativos en la relación 20E22P/20E en los mismos mosquitos, lo que podría sugerir que la enzima es específica para 3D20E22P (Fig. 3b).
a, Disminución de la actividad de la fosfatasa en MAG causada por el silenciamiento de EPP utilizando controles de ARN EPP bicatenario (dsEPP) o ARN GFP bicatenario (dsGFP). Se utilizaron veinte grupos de MAG en cada réplica (P = 0,0046, prueba t pareada, bilateral), representados por puntos separados.b, Las hembras apareadas con machos silenciados con EPP tuvieron una proporción significativamente menor de 3D20E desfosforilada a 3 hpm (P = 0,0043, prueba t no pareada, bilateral), mientras que los niveles de 20E no se vieron afectados (P = 0,063, no pareada). Prueba t, bilateral). Los datos se presentan como media ± sem de tres grupos de 13, 16 y 19 hembras cada uno. c, Las hembras apareadas con machos silenciados de EPP tuvieron tasas significativamente más altas de nuevo apareamiento (P = 0,0002, prueba exacta de Fisher, bilateral). Las hembras fueron obligadas primero a aparearse para asegurar su estado de apareamiento; Dos días después, se los contactó con otros machos que portaban esperma transgénico para evaluar las tasas de re-apareamiento mediante detección cuantitativa por PCR del transgén.d, Las hembras alimentadas con sangre apareadas con machos silenciados con EPP tuvieron una fertilidad significativamente reducida (P < 0,0001; prueba de Mann-Whitney, bilateral) y un número de huevos ligeramente reducido (P = 0,088, prueba de Mann-Whitney, bilateral), mientras que la tasa de desove no se vio afectada (P = 0,94, prueba exacta de Fisher, bilateral). En todos los paneles, n representa el número de muestras de mosquitos biológicamente independientes. NS, no significativo. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
A continuación, evaluamos si la desfosforilación de la ecdisona es importante para inducir resistencia al apareamiento en las hembras. En particular, las hembras apareadas con machos sin EPP se volvieron a aparear con una frecuencia mucho mayor (44,9 %) que las hembras de control (10,4 %) cuando se expusieron a machos adicionales (transgénicos) (Fig. 3c). También observamos una disminución significativa de la fertilidad (Fig. 3d, izquierda) y una ligera disminución del número de huevos puestos por estas hembras (Fig. 3d, centro), mientras que el porcentaje de huevos puestos por las hembras (otra respuesta provocada en las hembras por el apareamiento) no se vio afectado (Fig. 3d, derecha). Dada la especificidad observada de EPP para 3D20E22P, estos resultados sugieren que la activación de 3D20E por EPP transferido durante el apareamiento puede tener un papel importante en la desactivación de la receptividad de las hembras a más apareamientos, un comportamiento previamente atribuido a la transferencia sexual de 20E. Por lo tanto, esta hormona específica de los machos también influye fuertemente Afecta la fertilidad femenina.
A continuación, comparamos las actividades de 20E y 3D20E en experimentos de inyección en vírgenes sexualmente maduros utilizando 3D20E sintetizado químicamente (Fig. 4a–c) y 20E disponible comercialmente. Observamos que 3D20E fue significativamente más eficaz que 20E en apagar la sensibilidad femenina al apareamiento en ambas concentraciones (Fig. 4d). En particular, la mitad del nivel fisiológico de 3D20E en el LRT (1066 pg después de la inyección frente a 2022 pg después del apareamiento) indujo una proporción de hembras refractarias que fue 20 veces mayor que el nivel fisiológico de 20E (361 pg después de la inyección) 24 horas después de la inyección a la concentración más alta 18 pg después del apareamiento; Tabla de datos ampliados 1). Este resultado es consistente con la noción de que la transferencia sexual de 20E no causa períodos refractarios al apareamiento y señala además a 3D20E como un factor importante para asegurar la relación padre-hijo. 3D20E también fue significativamente más activo que 20E en ensayos de puesta de huevos en hembras vírgenes (Fig. 4e), lo que sugiere que la tasa normal de puesta de huevos que observamos después del silenciamiento parcial de EPP se debió a la presencia de actividad residual de 3D20E aún producida por factores femeninos inducidos por el apareamiento.
(a,b) 3D20E sintetizado químicamente a partir de 20E (a) con una conversión/eficiencia muy alta (datos presentados como media ± sem de tres reacciones de síntesis independientes) (b).c, el espectro de masas (mitad inferior) coincide exactamente con la ecdisona encontrada en LRT hembra apareada (mitad superior).d, en comparación con 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; prueba exacta de Fisher, bilateral) y etanol al 10% (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; prueba exacta de Fisher, bilateral), mientras que 20E fue significativamente más alto que el control solo en dosis más altas (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; Prueba exacta de Fisher, bilateral).e, la inyección de 3D20E indujo tasas de desove significativamente mayores en hembras vírgenes que los controles con etanol al 10% (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; prueba exacta de Fisher, bilateral), mientras que 20E en comparación con los controles solo a dosis más altas (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; prueba exacta de Fisher, bilateral).3D20E indujo tasas de desove significativamente mayores que 20E a dosis más altas (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; prueba exacta de Fisher, bilateral).En todos los paneles, n representa el número de muestras de mosquitos biológicamente independientes.NS, no significativo.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Los datos provienen de tres réplicas.
En estudios previos, determinamos que la transferencia sexual de hormonas esteroides induce la expresión de MISO (estimulador inducido por apareamiento de la ovogénesis 11), un gen reproductivo femenino que protege a las hembras de A. gambiae de la infección por P. falciparum. Costos de salud causados por 13, el parásito de la malaria humana más mortal. Dada la importancia de MISO para la aptitud reproductiva de Anopheles en áreas endémicas de malaria, decidimos determinar qué hormona 3D20E o 20E desencadena la expresión de este gen. Descubrimos que, si bien la inyección de 20E indujo de manera específica o más potente algunos receptores hormonales nucleares (HR), como HR3 y HR4, y objetivos esteroides típicos posteriores, como los genes yolkogenic Vg14, 15, 16, MISO fue inducido con mayor fuerza por 3D20E (Fig. 3 de datos extendidos). Por lo tanto, la transferencia sexual de esta hormona esteroide androgénica parece inducir mecanismos que protegen a las hembras de los costos que plantean los parásitos. infección. Además, 3D20E afecta de manera diferencial a ambas isoformas del receptor E EcR, induciendo EcR-A y reprimiendo EcR-B, y desencadenando con mayor fuerza otros genes inductores del apareamiento, incluido HPX15, que afecta la fertilidad femenina. Esto podría explicar la infertilidad significativa observada en hembras apareadas con machos silenciados de EPP (Fig. 3 de Datos Extendidos). Estos datos sugieren la existencia de vías descendentes activadas preferentemente por dos hormonas ecdisona que pueden subyacer a la función específica del sexo.
A continuación, probamos la función de los dos genes EcK identificados en nuestra tubería bioinformática. El silenciamiento de EcK1 o EcK2 resultó en una mortalidad significativa en los machos (Datos extendidos Fig. 4a), lo que sugiere que la fosforilación de ecdisona, y por lo tanto la inactivación, es importante para la supervivencia. Debido a que EcK2 se expresó en niveles más altos que EcK1 y se detectó en MAG por proteómica (Fig. 2b,c y Tabla suplementaria 2), validamos su actividad de quinasa ecdiesteroide incubándola con 20E, lo que resultó en la fosforilación 20E22P (Datos extendidos Figura 2).4b). Cuando usamos 3D20E como sustrato, no pudimos detectar el producto fosforilado 3D20E22P (Datos extendidos Fig. 4c), lo que sugiere que 20E en lugar de 3D20E puede ser el objetivo preferido de EcK2.
Según nuestro análisis de RNA-seq, EcK2 también se expresó en gran medida en el LRT de hembras vírgenes, donde se desactivó después del apareamiento (Fig. 2b). Confirmamos estos datos y determinamos que la expresión de EcK2 no se vio afectada por la alimentación con sangre (Fig. 5a de Datos Extendidos). Al ampliar nuestros experimentos iniciales de MS, determinamos que el pico de 20E22P estaba estrechamente relacionado con el pico de 20E (22-26 horas después de la ingestión de sangre; Fig. 5b de Datos Extendidos). El silenciamiento de EcK2 en hembras vírgenes resultó en un aumento de 3 veces en la relación relativa de 20E a 20E22P a las 26 h después de la ingestión de sangre (Figuras 2c y 5c de Datos Extendidos), lo que confirma que EcK2 también fosforila 20E en las hembras. Cabe destacar que las vírgenes con EcK2 depletado mantuvieron una receptividad sexual completa (Fig. 5d,e de Datos Extendidos), lo que sugiere además que la producción femenina de 20E no no inducen períodos refractarios de apareamiento. Sin embargo, estas hembras aumentaron significativamente las tasas de puesta de huevos en comparación con los controles, con más del 30% de las vírgenes poniendo huevos (Fig. 5f de Datos Extendidos). Si se realizaron inyecciones de ARN Eck2 de doble cadena (dsEcK2) después de la alimentación con sangre, no se produjo el desove, momento en el que el pico de 20E debido a la ingestión de sangre había disminuido. En general, estos resultados respaldan un modelo de que el 20E producido después de la succión de sangre puede inducir el desove, pero solo cuando el bloqueo del desove (EcK2 y posiblemente otros factores) se desactiva por el apareamiento. Ni las inyecciones de 20E ni las de 3D20E inhibieron la expresión de EcK2 en vírgenes (Fig. 5g de Datos Extendidos), lo que sugiere que otros factores median la inhibición de esta quinasa. Sin embargo, los niveles de 20E después de la alimentación con sangre no fueron suficientes para inducir la incomodidad del apareamiento, pero fueron desencadenados de manera efectiva por altos títulos de 3D20E transferido sexualmente.
Nuestros resultados proporcionan información importante sobre los mecanismos que regulan el éxito reproductivo de A. gambiae. Ha surgido un modelo en el que los machos han evolucionado para sintetizar altos títulos de 3D20E, una ecdisona modificada específica para machos que asegura la paternidad al desensibilizar a las hembras para apareamientos posteriores. Al mismo tiempo, estos vectores de la malaria también han desarrollado un sistema eficiente para activar 3D20E en las hembras en respuesta a la transferencia sexual de EPP específica para machos. Hasta donde sabemos, este es el primer ejemplo de un sistema de hormonas esteroides dominado por machos y hembras que desempeña una función única y crítica en insectos. La función de la ecdisona específica para machos se ha postulado, pero no se ha demostrado definitivamente. Por ejemplo, una hipótesis ampliamente refutada18 es que estas funciones podrían ser realizadas por el precursor de 20E, E1. Es bien sabido que en Drosophila, la monandria se desencadena por la transferencia sexual de pequeños péptidos sexuales19,20 que interactúan con las neuronas que inervan el tracto reproductivo femenino a través de receptores específicos de péptidos sexuales21,22. Además Se requiere trabajo para determinar las cascadas de señalización descendentes controladas por 3D20E en hembras de A. gambiae y para determinar si estas cascadas pueden conservarse entre mosquitos y Drosophila.
Dado el importante papel de 3D20E en la fertilidad y el comportamiento de las hembras identificado en nuestro estudio, las vías que conducen a la síntesis y activación de 3D20E ofrecen nuevas oportunidades para futuras estrategias de control de mosquitos, como la generación de machos estériles competitivos en estrategias de tecnología de insectos estériles. Utilizar para la liberación silvestre o para imitar el 3D20E en el juego virgen. La función específica de los machos de 3D20E puede haber evolucionado cuando A. gambiae y otras especies de Cellia adquirieron la capacidad de coagular su semen en tapones de apareamiento, ya que esto permite la transferencia eficiente de grandes cantidades de hormonas y enzimas activadoras de hormonas. A su vez, la evolución de 3D20E que implementa la monandria proporciona un mecanismo para que las hembras (a través de una alta expresión de MISO) favorezcan su aptitud reproductiva en áreas de alta prevalencia de malaria, lo que contribuye indirectamente a la transmisión de Plasmodium. Dado que se ha demostrado que la 20E femenina tiene profundos efectos en la supervivencia y el crecimiento de P. falciparum en mosquitos Anopheles hembra,24 las vías de las hormonas esteroides masculinas y femeninas son ahora aspectos clave. de interacciones mosquito-parásito.
Las cepas G3 de A. gambiae se criaron en condiciones estándar para insectos (26-28 °C, 65-80 % de humedad relativa, fotoperíodo de luz/oscuridad de 12:12 h). Las larvas se alimentaron con alimento en polvo para peces (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets y Tetra Pond Sticks en una proporción de 7:7:2). Los mosquitos adultos se alimentaron ad libitum con solución de dextrosa al 10 % y sangre humana semanal (componentes sanguíneos del estudio). Los mosquitos vírgenes se obtuvieron segregando los sexos en la etapa de pupa después de examinar los extremos mediante microscopía. Los machos portadores del transgén DsRed se han descrito previamente.
Los experimentos de apareamiento forzado se realizaron de acuerdo con protocolos descritos previamente. Para el apareamiento natural, las hembras vírgenes de 4 días se mantuvieron en una proporción de 1:3 con machos vírgenes sexualmente maduros durante dos noches. Para los experimentos en los que se inyectó a los machos dsEPP, el co-enjaulado coincidió con los días 3-4 posteriores a la inyección, cuando la actividad de la fosfatasa se silenció al máximo (Figura 2b de Datos Extendidos).
Los tejidos de mosquitos, los cadáveres restantes (resto del cuerpo) o el cuerpo entero se diseccionaron en metanol al 100% y se homogeneizaron con un beader (perlas de vidrio de 2 mm, 2400 rpm, 90 s). Las cantidades de tejido y los volúmenes de metanol fueron los siguientes: resto del cuerpo, 50 en 1000 µl; MAG, 50–100 80 µl; LRT hembra, 25–50 80 µl. El precipitado se sometió a una segunda extracción con metanol con el mismo volumen de metanol. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación. El metanol de ambas extracciones se combinó y se secó bajo flujo de nitrógeno, luego se resuspendió en los siguientes volúmenes de metanol al 80% en agua: resto del cuerpo, 50 µl; MAG y LRT hembra, 30 µl.
Las muestras se analizaron en un espectrómetro de masas (ID-X, Thermo Fisher) acoplado a un instrumento LC (Vanquish, Thermo Fisher). Se inyectaron 5 µl de muestra en una columna de 3 µm, 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) mantenida a 25 °C. Las fases móviles para la LC fueron A (agua, ácido fórmico al 0,1%) y B (acetonitrilo, ácido fórmico al 0,1%). El gradiente de LC fue el siguiente: 5% B durante 1 minuto, luego aumentó a 100% B durante 11 minutos. Después de 8 minutos al 100%, vuelva a equilibrar la columna a 5% B durante 4 minutos. El caudal fue de 0,3 ml min-1. La ionización en la fuente MS se logra mediante ionización por electrospray calentado en modos positivo y negativo.
El espectrómetro de masas mide datos en el rango m/z de 350 a 680 con una resolución de 60 000 en modo MS completo. Los datos MS/MS se adquirieron en [M + H]+ (todos los objetivos), [M - H2O + H]+ (todos los objetivos) y [M - H]- (objetivos fosforilados). Los datos MS/MS se utilizaron para confirmar las propiedades de la ecdisona de los objetivos para los que no había un estándar disponible. Para identificar ecdisteroides no objetivo, se analizaron los datos MS/MS para todos los picos de HPLC con una abundancia relativa >15 %. Cuantifique utilizando curvas estándar creadas a partir de estándares puros (20E, 3D20E) para calcular cantidades absolutas o diluciones de una muestra específica (todos los demás objetivos) para calcular su equivalencia con las cantidades encontradas en un macho. Para 3D20E, la cuantificación se realizó utilizando la suma de los siguientes aductos: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Los datos se extrajeron y cuantificaron utilizando Tracefinder (versión 4.1). Los datos MS/MS se analizaron utilizando Xcalibur (versión 4.4). Los espectros MS de E, 20E y 3D20E se compararon con los respectivos estándares. 3D20E22P se analizó por derivatización con el reactivo de Girard. 20E22P se analizó por relación m/z.
3D20E22P se purificó a partir de MAG. La purificación se realizó a escala analítica utilizando un cromatógrafo líquido de ultra rendimiento (Acquity, Waters) con un detector basado en masas cuadrupolo (QDa, Acquity, Waters) en las mismas condiciones de LC que el análisis HPLC-MS/MS. La recolección de fracciones se activó cuando se detectó el m/z correspondiente a 3D20E22P en el mismo tiempo de retención que el determinado previamente. Luego, la pureza de los compuestos extraídos se verificó mediante HPLC-MS/MS como se describió anteriormente.
El ARN total se extrajo de 10 a 12 tejidos reproductivos u otras partes del cuerpo (sin cabeza) utilizando el reactivo TRI (Thermo Fisher) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN se trató con TURBO DNasa (Thermo Fisher). El ADNc se sintetizó utilizando la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los cebadores para la PCR cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR; Tabla de datos extendidos 2) se publicaron previamente24 o se diseñaron utilizando Primer-BLAST26, dando preferencia a los productos de 70-150 pb de tamaño y que abarcan uniones exón-exón o los cebadores de pares de cebadores separan exones. Las muestras de ADNc de tres a cuatro réplicas biológicas se diluyeron cuatro veces en agua para la RT-qPCR. La cuantificación se realizó en reacciones de réplica de 15 µl que contenían 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), cebadores y 5 µl de diluido ADNc. Las reacciones se ejecutaron en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 6 Pro (Thermo Fisher) y los datos se recopilaron y analizaron utilizando Diseño y análisis (versión 2.4.3). Como se demostró en este estudio, las cantidades relativas se normalizaron al gen ribosomal RpL19 (AGAP004422), cuya expresión no cambió significativamente con la alimentación con sangre 27 o el apareamiento 3 .
La calidad del ARN se verificó utilizando un Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer de Agilent (Agilent). Las bibliotecas de extremos emparejados de Illumina se prepararon y ejecutaron en el Broad Institute of MIT y Harvard. Las lecturas de secuenciación se alinearon con el genoma de A. gambiae (cepa PEST, versión 4.12) utilizando HISAT2 (versión 2.0.5) con parámetros predeterminados. Las lecturas con puntuaciones de calidad de mapeo (MAPQ) <30 se eliminaron utilizando Samtools (versión 1.3.1). El número de lecturas mapeadas a genes se contó utilizando htseq-count (versión 0.9.1) con parámetros predeterminados. Se calcularon los recuentos de lecturas normalizadas y se analizó la expresión genética diferencial utilizando el paquete DESeq2 (versión 1.28.1) en R (versión 4.0.3).
Los candidatos a genes modificadores de ecdisona se identificaron buscando primero en el genoma de A. gambiae utilizando el algoritmo PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), utilizando valores predeterminados Parámetros con las siguientes secuencias de proteínas de consulta: de Bombyx mori (N.º de acceso NP_001038956.1), Musca domestica (N.º de acceso XP_005182020.1, XP_005175332.1 y XP_011294434.1) y Microplitis demolitor (N.º de acceso XP_008552646.1 y XP_008552645.1) EcK de B. mori (N.º de acceso NP_001036900), Drosophila melanogaster (N.º de acceso NP_651202), Apis mellifera (N.º de acceso XP_394838) y Acyrthosiphon pisum (N.º de acceso XP_001947166); y EPP de B. mori (N.º de acceso XP_001947166) NP_001177919.1 y NP_001243996.1) y EO de D. melanogaster (N.º de acceso NP_572986.1) (paso 1). A continuación, filtre los aciertos en función de la alta expresión de ARNm (>100 fragmentos/kilobase de exones por millón de lecturas mapeadas (FPKM) o >85%) en el tejido reproductivo (LRT o MAG femenino) en Gambia (paso 2). Para mejorar la especificidad, seleccionamos enzimas candidatas que también se expresan en el tejido reproductivo de A. albimanus, una especie de anopheles que no sintetiza ni transfiere ecdisona durante el apareamiento. Los genes candidatos se filtraron en función de la baja expresión (<100 FPKM o
Hembras vírgenes de 4 a 6 días de edad, marcadas con 15N, fueron forzadas a aparearse con machos vírgenes de la misma edad, sin marcar. El apareamiento exitoso se verificó mediante la detección de tapones de apareamiento con microscopía de epifluorescencia. A 3, 12 y 24 hpm, las aurículas de 45 a 55 hembras apareadas se diseccionaron en 50 µl de tampón de bicarbonato de amonio (pH 7,8) y se homogeneizaron con un mortero. El homogeneizado se centrifugó y el sobrenadante se mezcló con 50 µl de RapiGest al 0,1 % (186001860, Waters) en bicarbonato de amonio 50 mM. El sobrenadante y el sedimento de cada muestra se congelaron instantáneamente en hielo seco y se enviaron durante la noche al laboratorio MacCoss de la Universidad de Washington, donde se completó la preparación de la muestra para LC-MS/MS. Resuspender el sedimento en 50 µl de 0,1 % RapiGest en bicarbonato de amonio 50 mM y sonicado en un baño de agua. La concentración de proteínas del pellet y el sobrenadante se midió mediante el ensayo BCA, las muestras se redujeron con ditiotreitol 5 mM (DTT; Sigma), se alquilaron con yodoacetamida 15 mM (Sigma) y se incubaron a 37 °C (1:0 50) durante 1 hora con tripsinización: relación tripsina:sustrato). RapiGest se lisó mediante la adición de HCl 200 mM, seguido de una incubación a 37 °C durante 45 minutos y una centrifugación a 14.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C para eliminar los residuos. Las muestras se lavaron mediante extracción en fase sólida de modo dual (cartuchos Oasis MCX, Waters) y se resuspendieron en ácido fórmico al 0,1 % para una concentración final de proteínas de 0,33 µg. Los proteomas MAG no marcados se analizaron de manera similar a partir de machos vírgenes. Se analizaron dos réplicas analíticas para cada muestra. A continuación, se analizó 1 µg de cada uno utilizando una columna de sílice fundida de 75 μm de 25 cm con una trampa de frita de sílice fundida Kasil1 (PQ) de 4 cm rellena con resina de fase reversa Jupiter C12 (Phenomenex) y cromatografía líquida de 180 minutos. Resúmenes de muestra: MS/MS se ejecutó en un espectrómetro de masas Q-Exactive HF (Thermo Fisher) con un sistema nanoACQUITY UPLC (Waters). Los datos de adquisición relacionados con los datos generados para cada ejecución se convirtieron al formato mzML utilizando Proteowizard (versión 3.0.20287) y utilizando Comet31 (versión 3.2) contra la base de datos FASTA que contiene secuencias de proteínas de Anopheles gambiae (VectorBase versión 54), Anopheles coluzzi. Se realizó una búsqueda en Mali-NIH (VectorBase versión 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, marzo de 2021), ARN-seq de A. gambiae y traducciones de tres marcos de contaminantes humanos conocidos. Los FDR coincidentes con el mapa de péptidos se determinaron utilizando Percolator32 (versión 3.05) con un umbral de 0,01, y los péptidos se ensamblaron en identificaciones de proteínas utilizando parsimonia de proteínas en Limelight33 (versión 2.2.0). La abundancia relativa de proteínas se estimó utilizando el factor de abundancia espectral normalizado (NSAF) calculado para cada proteína en cada ejecución como se describió anteriormente. El NSAF relativo a cada proteína se promedió en muestras de dos réplicas biológicas diferentes. El marcaje con 15N enmascaró con éxito el proteoma femenino, aunque se pudo detectar una pequeña cantidad de proteína no marcada en los vírgenes marcados. Registramos la detección de la reducción de proteína masculina (1-5 espectros) en muestras crudas femeninas solo en ejecuciones técnicas, donde las muestras crudas se ejecutaron después de las muestras masculinas/de apareamiento, como resultado del "arrastre" de HPLC. Las proteínas ocasionales encontradas como "contaminantes" de los vírgenes marcados se enumeran en la Tabla complementaria 1.
Dos péptidos antigénicos, QTTDRVAPAPDQQQ (dentro del isotipo PA) y MESDGTTPSGDSEQ (dentro del isotipo PA y PB) en Genscript. Los dos péptidos se combinaron, luego se conjugaron con la proteína transportadora KLH y se inyectaron en conejos de Nueva Zelanda. Los conejos se sacrificaron después de la cuarta inyección y se aisló la IgG total por purificación por afinidad. La IgG del conejo más específico de EPP se utilizó para realizar un Western blotting adicional.
Para los análisis Western blot, se añadió por separado MAG (n = 10, donde n representa el número de muestras de mosquitos biológicamente independientes) y LRT hembra (n = 30) de machos vírgenes de 4 días y hembras vírgenes o de apareamiento forzado (<10 después del apareamiento). Se añadió tampón de extracción de proteínas (50 mM Tris, pH 8,0; 1 % NP-40; 0,25 % desoxicolato de sodio; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1 × cóctel de inhibidores de proteasa (Roche)). Las muestras se homogeneizaron inmediatamente después de la disección con un beader (perlas de vidrio de 2 mm, 2400 rpm, 90 s). Los restos insolubles se eliminaron por centrifugación a 20 000 g a 4 °C. Las proteínas se cuantificaron mediante el ensayo de Bradford (Bio-Rad). A continuación, se añadieron 20 µg de proteína MAG, 40 µg de proteína LRT, Se desnaturalizaron 20 µg de proteína residual a granel y se separaron mediante Bis-Tris NuPAGE al 10% utilizando tampón MOPS. Las proteínas se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno utilizando el sistema de transferencia iBlot2 (Thermo Fisher). Las membranas se lavaron dos veces en 1× PBS-T (0,1% Tween-20 en PBS) y luego se bloquearon en tampón de bloqueo Odyssey (Li-Cor) durante 1 hora a 22 °C. Las membranas se agitaron durante la noche a 4 °C con anticuerpo primario policlonal de conejo anti-EPP personalizado (1:700 en tampón de bloqueo) y anticuerpo primario monoclonal de rata anti-actina MAC237 (Abeam; 1:4000). Las membranas se lavaron con PBS-T y luego se incubaron con anticuerpos secundarios (anti-conejo de burro 800CW y anti-rata de cabra 680LT (Li-Cor), ambos 1:20 000) en tampón de bloqueo. que contiene 0,01% de SDS y 0,2% de Tween -20 durante 1 hora a 22 °C. Las membranas se lavaron con PBS-T y se tomaron imágenes con un escáner Odyssey CLx. Las imágenes se recopilaron y procesaron en Image Studio (versión 5.2). No se detectó una banda específica correspondiente a la isoforma EPP-RA (82 kDa).
Las regiones codificantes de EPP (como isoforma AGAP002463-RB que contiene el dominio de histidina fosfatasa, búsqueda de dominio conservado NCBI 34) y EcK2 (AGAP002181) se clonaron en el plásmido pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); Los cebadores se enumeran en la Tabla de datos ampliados 2. Se insertaron ocho enlaces GS4 (en tándem) antes de la etiqueta 6xHis C-terminal del constructo pET-21a(+)-EcK2. Las proteínas recombinantes se produjeron utilizando la reacción de síntesis de proteínas de E. coli libre de células NEBExpress (New England BioLabs). Las proteínas recombinantes se purificaron utilizando columnas de centrifugación Ni NEBExpress (New England BioLabs). La proteína de control de dihidrofolato reductasa (DHFR) se produjo utilizando una plantilla de ADN del kit de síntesis de proteínas de E. coli libre de células NEBExpress. Las proteínas se almacenaron en glicerol al 50 % en PBS a -20 °C durante hasta 3 meses.
La actividad de la fosfatasa de EPP y extractos de tejido se midió utilizando fosfato de 4-nitrofenilo (pNPP; Sigma-Aldrich). El tampón de reacción contenía Tris 25 mM, ácido acético 50 mM, Bis-Tris 25 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,1 mM y DTT 1 mM. El tejido se homogeneizó en el tampón de reacción y los restos celulares se eliminaron por centrifugación. Inicie la reacción agregando enzima o extracto de tejido al tampón de reacción que contiene 2,5 mg ml-1 de pNPP. La mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente en la oscuridad y la cantidad de pNP convertido a partir de pNPP se cuantificó midiendo la absorbancia a 405 nm en varios momentos.
Para la actividad de EcK in vitro, la proteína se incubó con 0,2 mg de 20E o 3D20E en 200 µl de tampón (pH 7,5) que contenía 10 mM de HEPES-NaOH, 0,1% de BSA, 2 mM de ATP y 10 mM de MgCl2 durante 2 h a 27 °C. La reacción se detuvo añadiendo 800 µl de metanol, luego se enfrió a -20 °C durante 1 hora y luego se centrifugó a 20 000 g durante 10 minutos a 4 °C. Luego, el sobrenadante se analizó por HPLC-MS/MS. Para inactivar por calor las proteínas utilizadas en el grupo de control, las proteínas se incubaron en glicerol al 50% en PBS durante 20 min a 95 °C.
Para la actividad de EPP in vitro, la proteína se incubó con 3D20E22P (equivalente a la cantidad encontrada en 18 pares de MAG, purificada por HPLC-MS/MS) en 100 µl de tampón (pH 7,5) que contenía 25 mM Tris, 50 mM ácido acético, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA y 1 mM DTT durante 3 horas a 27 °C. La reacción se detuvo añadiendo 400 µl de metanol y se enfrió a -20 °C durante 1 hora, luego se centrifugó a 20.000 g durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante se analizó por HPLC-MS/MS.
Los fragmentos de PCR para EPP (362 pb), EcK1 (AGAP004574, 365 pb) y EcK2 (556 pb) se amplificaron a partir de ADNc preparado a partir de cadáveres de mosquitos sin cabeza de sexo mixto. El fragmento de PCR del control eGFP (495 pb) se amplificó a partir del pCR2.1-eGFP descrito previamente; Los cebadores de PCR se enumeran en la Tabla 2 de datos extendidos. El fragmento de PCR se insertó entre los promotores T7 invertidos en el plásmido pL4440. Los constructos de plásmido se recuperaron de E. coli competente para NEB 5-α (New England Biolabs) y se verificaron mediante secuenciación de ADN antes de su uso (consulte los Datos complementarios 1 para la secuencia del inserto). Los cebadores coincidentes con el promotor T7 (Tabla 2 de datos extendidos) se utilizaron para amplificar el inserto del plásmido basado en pL4440. El tamaño del producto de PCR se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa. El ARNdc se transcribió a partir de plantillas de PCR utilizando el kit de transcripción Megascript T7 (Thermo Fisher) y se purificó de acuerdo con las instrucciones del fabricante con las modificaciones descritas anteriormente.
Para la inyección de dsRNA, se inyectaron 1380 ng de dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) a una concentración de 10 ng nl-1 en el tórax de machos o hembras adultos (Nanoject III, Drummond) dentro de 1 día después de la eclosión. Los niveles de silenciamiento genético se determinaron en al menos tres réplicas biológicas mediante extracción de ARN, síntesis de ADNc y RT-qPCR. Para la inyección de ecdisona, se inyectó a hembras vírgenes de 4 o 6 días de edad alimentadas con sangre 0,13, 0,21 o 0,63 µg de 20E o 3D20E (Nanoject III, Drummond) a concentraciones de 1,3, 2,1, respectivamente, dependiendo del diseño experimental o 6,3 ng nl-1. Inyectar 100 nl de 10% (vol/vol) etanol en agua; 100 nl de 3D20E22P en etanol al 10% (equivalente al 75% de la cantidad encontrada en un par de MAG). Los mosquitos fueron asignados aleatoriamente al grupo de inyección.
Para los ensayos de desove, hembras de 3 días fueron alimentadas ad libitum con sangre humana.Retire los mosquitos parcialmente alimentados o sin alimentar.Dependiendo del tratamiento, las hembras fueron colocadas en recipientes de desove separados durante cuatro noches al menos 48 horas después de la ingestión de sangre.Los huevos fueron contados bajo un estereoscopio (Stemi 508, Zeiss); en el caso de las hembras apareadas, los huevos que eclosionaron en larvas fueron considerados fértiles.
Para los ensayos de apareamiento, a las hembras se les permitió al menos 2 días dependiendo del tratamiento para desarrollar resistencia al apareamiento, y posteriormente se introdujeron machos de tipo salvaje de la misma edad en la misma jaula. Dos noches después, se diseccionaron las vesículas fertilizadas de las hembras y se liberó el ADN genómico mediante congelación-descongelación y sonicación en un tampón que contenía 10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA y 25 mM de NaCl (pH 8,2). Las muestras se incubaron con proteinasa K (0,86 µg µl-1) durante 15 minutos a 55 °C, seguido de 10 minutos a 95 °C. Las preparaciones de ADN genómico crudo se diluyeron 10 veces y se sometieron a detección por qPCR de secuencias del cromosoma Y; los cebadores se enumeran en la Tabla de datos extendidos 2. La ausencia de la secuencia del cromosoma Y indica que no hay apareamiento.
Para los ensayos de re-apareamiento, las hembras forzadas fueron examinadas para detectar la presencia de tapones de apareamiento para confirmar el estado de apareamiento y se dejaron 2 días para desarrollar refractariedad al apareamiento en ausencia de machos, como se describió previamente 36 . Luego, los machos que portaban esperma transgénico DsRed fueron introducidos en jaulas para hembras. Dos noches después, las vesículas fertilizantes fueron diseccionadas de las hembras, y el ADN genómico fue preparado como se describió anteriormente y sometido a detección por qPCR del transgén DsRed; los cebadores están listados en la Tabla 2 de Datos Extendidos. La ausencia del transgén DsRed indicó que no ocurrió re-apareamiento.
3D20E se sintetizó como se describió previamente 37 . Brevemente, 10 mg de 20E (Sigma-Aldrich) se disolvieron en 10 ml de agua, seguido de la adición de 30 mg de negro de platino (en forma de polvo, Sigma-Aldrich). Una corriente suave de O2 se burbujeó continuamente en la mezcla de reacción, que se agitó a temperatura ambiente. Después de 6 horas, se añadieron 30 ml de metanol para detener la reacción. La mezcla se centrifugó para eliminar las partículas del catalizador. El sobrenadante se evaporó a sequedad al vacío a temperatura ambiente. El producto de reacción seco se disolvió en etanol al 10% y metanol para inyección para análisis HPLC-MS/MS. La tasa de conversión (de 20E a 3D20E) fue de aproximadamente 97% (Fig. 4b), y el espectro MS del 3D20E sintetizado coincidió con el encontrado en hembras apareadas (Fig. 4c).
La leyenda contiene detalles específicos de las pruebas estadísticas realizadas. GraphPad (versión 9.0) se utilizó para realizar la prueba exacta de Fisher, la prueba de Mantel-Cox y la prueba t de Student. Las pruebas de Cochran-Mantel-Haenszel se realizaron utilizando un script R personalizado (disponible en https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). La distribución de datos se probó para normalidad utilizando la prueba de Shapiro-Wilk con un umbral de significancia de 0,05. Cuando los datos no pasaron la prueba de normalidad, se realizó la prueba de Mann-Whitney. Los datos de supervivencia se analizaron utilizando la prueba de Mantel-Cox. El paquete DESeq2 (versión 1.28.1) se utilizó para realizar el análisis de expresión diferencial a nivel de gen RNA-seq. La barra horizontal en el gráfico representa la mediana. Se utilizó un valor de significancia de P = 0,05 como umbral para todas las pruebas.
Para obtener más información sobre el diseño del estudio, consulte el resumen del informe de investigación de Nature vinculado a este artículo.
Los datos proteómicos de EM se depositaron en el Consorcio ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) a través del Repositorio de socios PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride/) con el identificador de conjunto de datos PXD032157.
El conjunto de datos RNA-seq está depositado en la Biblioteca Integral de Expresión Genética (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) bajo el registro de serie GSE198665.
Se pueden obtener conjuntos de datos adicionales generados y/o analizados durante el estudio actual de los autores correspondientes mediante solicitud razonable. Este artículo proporciona los datos fuente.
De Loof, A. Ecdisteroides: ¿Esteroides sexuales de insectos desatendidos?Masculino: Caja Negra. Insect Science.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hidroxiecdisona y desarrollo ovárico en Anopheles stephens.J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).
Hora de publicación: 08-jul-2022