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A diferencia de los vertebrados, se cree que los insectos carecen de hormonas esteroides sexuales con sesgo masculino. En Anopheles gambiae, el esteroide ecdisona 20-hidroxiecdisona (20E) parece haber evolucionado para controlar el desarrollo de los huevos cuando es sintetizado por las hembras² y para inducir un período refractario al apareamiento cuando es transferido sexualmente por los machos³. Dado que el desarrollo de los huevos y el apareamiento son características reproductivas esenciales, comprender cómo las hembras de mosquito Anopheles integran estas señales hormonales podría facilitar el diseño de nuevos programas de control de la malaria. Aquí, revelamos que estas funciones reproductivas están reguladas por esteroides sexuales distintos a través de una compleja red de enzimas activadoras/inactivadoras de ecdisteroides. Identificamos una ecdisona oxidada específica de machos, la 3-dehidro-20E (3D20E), que protege la paternidad al suprimir la receptividad sexual femenina tras la transferencia sexual y la activación por desfosforilación. Cabe destacar que la transferencia de 3D20E también indujo la expresión de genes reproductivos que mantienen el desarrollo de los huevos durante la infección por Plasmodium, asegurando la salud de los infectados. hembras. La 20E derivada de las hembras no provoca una respuesta sexual, pero permite que los individuos que se aparean pongan huevos después de que se inhiban las quinasas inhibidoras de la 20E. La identificación de esta hormona esteroide de insectos específica de los machos y su papel en la regulación de la receptividad sexual femenina, la fertilidad y la interacción con Plasmodium sugiere el potencial para reducir el éxito reproductivo de los mosquitos transmisores de la malaria.
Los casos y las muertes por malaria están aumentando de nuevo4 debido a la resistencia generalizada a los insecticidas en los mosquitos Anopheles, el único vector de los parásitos de la malaria humana. La biología de apareamiento de estos mosquitos es un objetivo particularmente atractivo para nuevas intervenciones de control de la malaria porque las hembras solo se aparean una vez5; hacer que este único evento de apareamiento sea estéril tendría un gran potencial para reducir las poblaciones de mosquitos en el campo.
Las mujeres se vuelven sexualmente incapacitadas después de recibir hormonas esteroides de alto título de los hombres. Los estudios han demostrado que el desencadenante de la dificultad para aparearse posteriormente es la 20-hidroxiecdisona (20E), una hormona esteroide más conocida como reguladora del ciclo de muda en la etapa larvaria. La capacidad de los machos para sintetizar y transferir 20E ha evolucionado específicamente en las especies de Anopheles que forman parte del subgénero Cellia7, que se distribuye en África e incluye a los vectores más peligrosos de la malaria, incluido Anopheles gambiae. Esto es especialmente notable porque en estas especies las hembras también producen 20E después de cada ingesta de sangre, y la 20E impulsa el ciclo de ovogénesis (véase la referencia 8). Sin embargo, se sabe poco sobre la forma en que las hembras integran las señales de dos fuentes diferentes de ecdisona (transferencia masculina e inducción de la alimentación sanguínea) sin comprometer su propia capacidad de aparearse. De hecho, si la 20E producida por las hembras desencadena intolerancia sexual, esto conducirá a la infertilidad en los individuos vírgenes que se alimentan de sangre. un comportamiento muy común en estos mosquitos5.
Una posible explicación es que los machos de A. gambiae transfieren una ecdisona modificada específica para machos, que activa una cascada de señalización en el tracto reproductivo femenino, lo que resulta en inestabilidad de apareamiento. Sin embargo, aunque los vertebrados tienen múltiples hormonas esteroides, como estrógeno y andrógeno (revisado en la referencia 9), hasta donde sabemos, no se han identificado esteroides con sesgo androgénico en insectos.
Nos propusimos determinar el repertorio de hormonas esteroides en la glándula accesoria masculina (GAM) de A. gambiae sexualmente maduro en busca de posibles esteroides modificadores. Utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS) en lugar del método menos específico utilizado anteriormente, detectamos ecdisona (E) y 20E en este tejido, confirmando el resultado anterior. Sin embargo, la muestra estaba dominada por esteroides fosforilados oxidados, consistentes con la fórmula 3-dehidro-20E-22-fosfato (3D20E22P)12 (Figura 1). Otras formas incluyen 3-dehidro-20E (3D20E) y 20E-22-fosfato (20E22P). La intensidad de la señal HPLC-MS/MS de 3D20E22P fue dos órdenes de magnitud mayor que su forma desfosforilada, 3D20E, y tres órdenes de magnitud mayor que la de E y 20E (Figura 1).Aunque en otras partes del cuerpo y el tracto reproductivo inferior (TRI; Figura de datos extendidos 1a).También analizamos ecdisteroides en machos y hembras recién cerrados (<1 día de edad) y detectamos 3D20E y 3D20E22P solo en MAG; E, 20E y 20E22P estaban presentes en ambos sexos (Figura de datos extendidos 1b).Estos datos sugieren que los machos adultos de A. gambiae producen altos títulos de hormonas modificadoras en sus MAG que no son sintetizadas por las hembras.
Se disecaron el MAG y el LRT femenino (incluyendo aurículas, vesículas seminales y parovario) de machos vírgenes de 4 días de edad (4 días de edad) y hembras vírgenes y apareadas (0,5, 3 y 12 hpm). La ecdisona en estos tejidos se analizó mediante HPLC-MS/MS (media ± error estándar; prueba t no pareada, bilateral, tasa de falsos descubrimientos (FDR) corregida; NS, no significativo; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 horas vs. 0,5 horas, P = 0,035; 12 horas vs. 3 horas, P = 0,0015; 12 horas vs. 0,5 horas, P = 0,030. 3D20E22P: 3 horas vs. 0,5 horas, P = 0,25; 12 horas vs. 3 horas, P = 0,0032; 12 horas frente a 0,5 horas, P = 0,015). Los datos provienen de tres réplicas biológicas. El área del pico para cada ecdisona de interés se calculó y normalizó por el número de mosquitos. La ecdisona se representa por color de la siguiente manera: E, verde; 20E, naranja; 20E22P, púrpura; 3D20E, azul; 3D20E22P, rosa. El recuadro aumenta la escala en el eje y para mostrar niveles más bajos de ecdisona.
Para investigar si 3D20E22P y 3D20E se transfieren durante el apareamiento, diseccionamos los LRT femeninos en varios momentos después del apareamiento. Aunque no se encontró ecdisona en las vírgenes, observamos cantidades sustanciales de 3D20E22P en el LRT inmediatamente después del apareamiento (0,5 h post-apareamiento, hpm), disminuyendo con el tiempo, mientras que los niveles de 3D20E aumentaron significativamente (Fig. 1). Usando 3D20E sintetizado químicamente como estándar, determinamos que los niveles de esta hormona esteroide en los LRT de apareamiento eran al menos 100 veces más altos que 20E (Tabla de datos extendida 1). Por lo tanto, 3D20E22P es la principal ecdisona masculina que se transfiere al LRT femenino durante el apareamiento, y su forma desfosforilada, 3D20E, se vuelve muy abundante poco después del apareamiento. Esto sugiere un papel importante para esta última ecdisona en la biología femenina posterior al apareamiento.
Después de generar un nuevo conjunto de datos de secuenciación de ARN (RNA-seq) (Fig. 2a), utilizando una canalización bioinformática personalizada, buscamos el gen de la ecdisona quinasa (EcK), la ecdisona oxidasa (EO) y el gen de la fosfatasa 20E-modificada que codifica la ecdisona. La EPP se expresa en los tejidos reproductivos. Identificamos un gen candidato para la EPP y dos genes potenciales para la EcK (EcK1 y EcK2), pero no pudimos encontrar un buen gen candidato para la EO. Cabe destacar que los genes individuales de la EPP se expresaron en niveles altos (percentil 98,9) en los MAG de Gambia, pero no en los LRT femeninos (Fig. 2b), contrariamente a nuestras expectativas, ya que la desfosforilación de 3D20E22P ocurrió en este tejido femenino. Por lo tanto, creemos que la EPP masculina puede transferirse durante el apareamiento. De hecho, utilizamos el marcaje isotópico estable in vivo para enmascarar la proteína femenina después del apareamiento, una enzima identificada por espectrometría de masas en la hembra. atrio (Fig. 2c y Tabla suplementaria 1). La presencia de EPP en MAG y LRT hembra apareada (pero no virgen) también se confirmó utilizando anticuerpos específicos (Fig. 2d).
a, Una canalización bioinformática personalizada para buscar en los tejidos reproductivos de cada sexo genes que codifican EcKs, EOs y EPPs. Los números junto a las flechas indican el número de candidatos masculinos y femeninos en cada paso. Este análisis identificó un gen EPP (EPP) y un gen EcK (EcK1) que se expresan en los machos, y un gen EcK (EcK2) que se expresa en ambos sexos pero no produce un gen EO candidato. b, Mapa de calor que compara la expresión de genes candidatos en tejidos de Anopheles gambiae y Anopheles albicans vírgenes (V) y en apareamiento (M). Spca, fertilización; MAGs, glándulas accesorias en los machos; otras partes del cuerpo, incluyendo senos, alas, patas, cuerpos grasos y órganos internos en ambos sexos, y ovarios en hembras. EcK2 se expresa en gran medida tanto en MAG como en atrios de Gambia, mientras que EPP se encuentra solo en MAG.c, Análisis proteómico de la translocación del grupo de eyaculado masculino en atrios femeninos a las 3, 12 y 24 hpm, mostrando las 67 proteínas más abundantes. Las hembras se criaron con una dieta que contenía 15N para marcar (y enmascarar) todas las proteínas. Los machos sin marcar se aparearon con hembras marcadas, y los LRT femeninos se disecaron a las 3, 12 y 24 hpm para el análisis proteómico (ver Tabla suplementaria 1 para una lista completa de proteínas eyaculatorias). Recuadro, EPP, Eck1 y EcK2 se detectaron en el MAG de machos vírgenes mediante análisis proteómico de estos tejidos.d, EPP se detectó mediante Western blot en MAG y LRT de hembras apareadas, pero no en hembras vírgenes o machos o el resto del cuerpo femenino. Las membranas se sondearon simultáneamente con anticuerpos anti-actina (control de carga) y anti-EPP. Todos los machos son vírgenes. Consulte la Figura suplementaria 1 para obtener los datos de origen del gel. Los Western blots se realizaron dos veces con resultados similares.
La actividad de la fosfofosfatasa de ecdisteroides de EPP se verificó después de la incubación por HPLC-MS/MS con 3D20E22P aislado de MAG (Figura 2a de datos extendidos). Además, cuando silenciamos EPP por interferencia mediada por ARN (ARNi), detectamos una fuerte reducción en la actividad de la fosfatasa en los tejidos reproductivos de estos machos (Figura 3a), y las hembras apareadas con machos con EPP silenciado mostraron una proporción significativamente menor de 3D20E desfosforilada (Figura 3b) a pesar del silenciamiento parcial del gen (Figura 2b,c de datos extendidos). Por el contrario, no detectamos cambios significativos en la relación 20E22P/20E en los mismos mosquitos, lo que podría sugerir que la enzima es específica para 3D20E22P (Figura 3b).
a, Disminución de la actividad de la fosfatasa en MAG causada por el silenciamiento de EPP utilizando ARN EPP de doble cadena (dsEPP) o ARN GFP de doble cadena (dsGFP) como controles. Se utilizaron veinte grupos de MAG en cada réplica (P = 0,0046, prueba t pareada, bilateral), representados por puntos separados. b, Las hembras apareadas con machos con silenciamiento de EPP tuvieron una proporción significativamente menor de 3D20E desfosforilada a las 3 hpm (P = 0,0043, prueba t no pareada, bilateral), mientras que los niveles de 20E no se vieron afectados (P = 0,063, no pareada). prueba t, bilateral). Los datos se presentan como media ± error estándar de la media de tres grupos de 13, 16 y 19 hembras cada uno. c, Las hembras apareadas con machos con EPP silenciado tuvieron tasas significativamente más altas de reapareamiento (P = 0,0002, prueba exacta de Fisher, bilateral). Las hembras fueron obligadas a aparearse primero para asegurar su estado de apareamiento; Dos días después, se les contactó con otros machos portadores de esperma transgénico para evaluar las tasas de reapareamiento mediante la detección cuantitativa por PCR del transgén. Las hembras alimentadas con sangre que se aparearon con machos con silenciamiento de EPP tuvieron una fertilidad significativamente reducida (P < 0,0001; prueba de Mann-Whitney, bilateral) y un número de huevos ligeramente reducido (P = 0,088, prueba de Mann-Whitney, bilateral), mientras que la tasa de desove no se vio afectada (P = 0,94, prueba exacta de Fisher, bilateral). En todos los paneles, n representa el número de muestras de mosquitos biológicamente independientes. NS, no significativo. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
A continuación, evaluamos si la desfosforilación de la ecdisona es importante para inducir resistencia al apareamiento en las hembras. Cabe destacar que las hembras apareadas con machos con deficiencia de EPP se aparearon nuevamente con una frecuencia mucho mayor (44,9 %) que las hembras control (10,4 %) cuando se expusieron a machos adicionales (transgénicos) (Fig. 3c). También observamos una disminución significativa en la fertilidad (Fig. 3d, izquierda) y una ligera disminución en el número de huevos puestos por estas hembras (Fig. 3d, centro), mientras que el porcentaje de huevos puestos por las hembras (otra respuesta provocada en las hembras por el apareamiento) no se vio afectado (Fig. 3d, derecha). Dada la especificidad observada de la EPP para 3D20E22P, estos resultados sugieren que la activación de 3D20E por la EPP transferida durante el apareamiento puede tener un papel importante en la desactivación de la receptividad de las hembras a apareamientos posteriores, un comportamiento previamente atribuido a la transferencia sexual de 20E. Por lo tanto, esta hormona específica de los machos también se ve fuertemente afectada. afecta la fertilidad femenina.
A continuación, comparamos las actividades de 20E y 3D20E en experimentos de inyección en vírgenes sexualmente maduras utilizando 3D20E sintetizado químicamente (Fig. 4a–c) y 20E disponible comercialmente. Observamos que 3D20E fue significativamente más efectivo que 20E para suprimir la sensibilidad de las hembras al apareamiento en ambas concentraciones (Fig. 4d). Cabe destacar que la mitad del nivel fisiológico de 3D20E en el LRT (1066 pg después de la inyección frente a 2022 pg después del apareamiento) indujo una proporción de hembras refractarias que fue 20 veces mayor que el nivel fisiológico de 20E (361 pg después de la inyección) 24 horas después de la inyección a la concentración más alta de 18 pg después del apareamiento; Tabla de datos ampliada 1). Este resultado es consistente con la noción de que la transferencia sexual de 20E no causa períodos refractarios de apareamiento, y apunta además a 3D20E como un factor importante para asegurar la relación padre-hijo. 3D20E también fue significativamente más activo que 20E en ensayos de puesta de huevos en hembras vírgenes (Fig. 4e), lo que sugiere que la tasa normal de puesta de huevos que observamos después del silenciamiento parcial de EPP se debió a la presencia de actividad residual de 3D20E todavía producida por factores femeninos inducidos por el apareamiento.
(a,b) 3D20E sintetizado químicamente a partir de 20E (a) con una conversión/eficiencia muy alta (datos presentados como media ± error estándar de la media de tres reacciones de síntesis independientes) (b).c, El espectro de masas (mitad inferior) coincide exactamente con la ecdisona encontrada en LRT hembra apareada (mitad superior).d, Comparado con 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; prueba exacta de Fisher, bilateral) y etanol al 10% (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; prueba exacta de Fisher, bilateral), mientras que 20E fue significativamente más alto que el control solo en dosis más altas (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; Prueba exacta de Fisher, bilateral).e, la inyección de 3D20E indujo tasas de desove significativamente más altas en hembras vírgenes que los controles de etanol al 10% (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; prueba exacta de Fisher, bilateral), mientras que 20E en comparación con los controles solo en dosis más altas (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; prueba exacta de Fisher, bilateral).3D20E indujo tasas de desove significativamente más altas que 20E en dosis más altas (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; prueba exacta de Fisher, bilateral).En todos los paneles, n representa el número de muestras de mosquitos biológicamente independientes.NS, no significativo.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Los datos provienen de tres réplicas.
En estudios previos, determinamos que la transferencia sexual de hormonas esteroides induce la expresión de MISO (Estimulador de la Oogénesis Inducido por Apareamiento 11), un gen reproductivo femenino que protege a las hembras de Anopheles gambiae de la infección por P. falciparum 13, el parásito de la malaria humana más letal. Dada la importancia de MISO para la aptitud reproductiva de Anopheles en áreas endémicas de malaria, decidimos determinar qué hormona, 3D20E o 20E, desencadena la expresión de este gen. Descubrimos que, si bien la inyección de 20E indujo de forma específica o más potente algunos receptores hormonales nucleares (HR), como HR3 y HR4, y objetivos esteroideos típicos posteriores, como los genes vitelogénicos Vg14, 15 y 16, MISO fue inducido con mayor fuerza por 3D20E (Figura 3 de Datos Extendidos). Por lo tanto, la transferencia sexual de esta hormona esteroide androgénica parece inducir mecanismos que protegen a las hembras de los costos que plantea la infección parasitaria. infección.Además, 3D20E afecta diferencialmente a ambas isoformas del receptor EcR, induciendo EcR-A y reprimiendo EcR-B, y activando más fuertemente otros genes inductores del apareamiento, incluido HPX15, que afecta la fertilidad femenina. Esto podría explicar la infertilidad significativa observada en hembras apareadas con machos con silenciamiento de EPP (Figura 3 de datos extendidos). Estos datos sugieren la existencia de vías posteriores activadas preferentemente por dos hormonas de ecdisona que pueden subyacer a la función específica del sexo.
A continuación, probamos la función de los dos genes EcK identificados en nuestra canalización bioinformática. El silenciamiento de EcK1 o EcK2 resultó en una mortalidad significativa en los machos (Figura 4a de datos extendidos), lo que sugiere que la fosforilación de la ecdisona, y por lo tanto la inactivación, es importante para la supervivencia. Debido a que EcK2 se expresó en niveles más altos que EcK1 y se detectó en MAGs por proteómica (Figura 2b,c y Tabla suplementaria 2), validamos su actividad de quinasa de ecdisteroides incubándola con 20E, lo que resultó en la fosforilación 20E22P (Figura 2b de datos extendidos). Cuando usamos 3D20E como sustrato, no pudimos detectar el producto fosforilado 3D20E22P (Figura 4c de datos extendidos), lo que sugiere que 20E en lugar de 3D20E puede ser el objetivo preferido de EcK2.
Según nuestro análisis de RNA-seq, EcK2 también se expresó en gran medida en el LRT de hembras vírgenes, donde se desactivó después del apareamiento (Fig. 2b). Confirmamos estos datos y determinamos que la expresión de EcK2 no se vio afectada por la alimentación con sangre (Figura 5a de Datos Extendidos). Ampliando nuestros experimentos iniciales de MS, determinamos que el pico de 20E22P estaba estrechamente relacionado con el pico de 20E (22-26 horas después de la ingesta de sangre; Figura 5b de Datos Extendidos). El silenciamiento de EcK2 en hembras vírgenes resultó en un aumento de 3 veces en la proporción relativa de 20E a 20E22P a las 26 h después de la ingesta de sangre (Figuras 2c y 5c de Datos Extendidos), lo que confirma que EcK2 también fosforila 20E en hembras. Cabe destacar que las vírgenes con deficiencia de EcK2 mantuvieron una receptividad sexual completa (Figuras 5d,e de Datos Extendidos), lo que sugiere además que la producción femenina de 20E no inducen períodos refractarios de apareamiento. Sin embargo, estas hembras tuvieron tasas de puesta de huevos significativamente aumentadas en comparación con los controles, con más del 30% de las vírgenes poniendo huevos (Figura 5f de datos extendidos). Si se realizaron inyecciones de ARN Eck2 de doble cadena (dsEcK2) después de la alimentación con sangre, no se produjo el desove, momento en el que el pico de 20E debido a la ingestión de sangre había disminuido. En general, estos resultados respaldan un modelo en el que el 20E producido después de la succión de sangre puede inducir el desove, pero solo cuando el bloqueo del desove (EcK2 y posiblemente otros factores) se desactiva mediante el apareamiento. Ni las inyecciones de 20E ni las de 3D20E inhibieron la expresión de EcK2 en las vírgenes (Figura 5g de datos extendidos), lo que sugiere que otros factores median la inhibición de esta quinasa. Sin embargo, los niveles de 20E después de la alimentación con sangre no fueron suficientes para inducir molestias de apareamiento, pero fueron desencadenados eficazmente por altos títulos de 3D20E transferido sexualmente.
Nuestros resultados proporcionan información importante sobre los mecanismos que regulan el éxito reproductivo de A. gambiae. Ha surgido un modelo en el que los machos han evolucionado para sintetizar altos títulos de 3D20E, una ecdisona modificada específica de los machos que asegura la paternidad al desensibilizar a las hembras a un apareamiento posterior. Al mismo tiempo, estos vectores de la malaria también han desarrollado un sistema eficiente para activar 3D20E en las hembras en respuesta a la transferencia sexual de EPP específica de los machos. Hasta donde sabemos, este es el primer ejemplo de un sistema de hormonas esteroides dominado por machos y hembras que realiza una función única y crítica en insectos. Se ha postulado la función de la ecdisona específica de los machos, pero no se ha demostrado de forma definitiva. Por ejemplo, una hipótesis ampliamente refutada¹⁸ es que estas funciones pueden ser realizadas por el precursor E1 de 20E. Es bien sabido que en Drosophila, la monandria se desencadena por la transferencia sexual de pequeños péptidos sexuales¹⁹,²⁰ que interactúan con las neuronas que inervan el tracto reproductivo femenino a través de receptores específicos de péptidos sexuales²¹,²². Además Es necesario realizar estudios para determinar las cascadas de señalización posteriores controladas por 3D20E en las hembras de A. gambiae y para determinar si estas cascadas se conservan entre los mosquitos y la Drosophila.
Dado el importante papel de 3D20E en la fertilidad y el comportamiento femenino identificado en nuestro estudio, las vías que conducen a la síntesis y activación de 3D20E ofrecen nuevas oportunidades para futuras estrategias de control de mosquitos, como la generación de machos estériles competitivos en estrategias de tecnología de insectos estériles para su liberación en la naturaleza o para imitar a 3D20E en el juego de vírgenes. La función específica de 3D20E en machos puede haber evolucionado cuando A. gambiae y otras especies de Cellia adquirieron la capacidad de coagular su semen en tapones de apareamiento, ya que esto permite la transferencia eficiente de grandes cantidades de hormonas y enzimas activadoras de hormonas. A su vez, la evolución de 3D20E que implementa la monogamia proporciona un mecanismo para que las hembras (a través de la alta expresión de MISO) favorezcan su aptitud reproductiva en áreas de alta prevalencia de malaria, lo que contribuye indirectamente a la transmisión de Plasmodium. Dado que se ha demostrado que la 20E femenina tiene profundos efectos en la supervivencia y el crecimiento de P. falciparum en mosquitos Anopheles hembra,24 tanto las vías de hormonas esteroides masculinas como femeninas son ahora aspectos clave. de las interacciones mosquito-parásito.
Las cepas G3 de A. gambiae se criaron en condiciones estándar para insectos (26-28 °C, 65-80 % de humedad relativa, fotoperiodo de 12:12 h luz/oscuridad). Las larvas se alimentaron con alimento en polvo para peces (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets y Tetra Pond Sticks en una proporción de 7:7:2). Los mosquitos adultos se alimentaron ad libitum con una solución de dextrosa al 10 % y semanalmente con sangre humana (componentes sanguíneos del estudio). Los mosquitos vírgenes se obtuvieron separando los sexos en la etapa de pupa después de examinar los extremos mediante microscopía. Los machos portadores del transgén DsRed se han descrito previamente.
Los experimentos de apareamiento forzado se realizaron de acuerdo con protocolos descritos previamente. Para el apareamiento natural, las hembras vírgenes de 4 días de edad se mantuvieron en una proporción de 1:3 con machos vírgenes sexualmente maduros durante dos noches. Para los experimentos en los que se inyectó dsEPP a los machos, el alojamiento conjunto coincidió con los días 3-4 posteriores a la inyección, cuando la actividad de la fosfatasa estaba silenciada al máximo (Figura 2b de los datos extendidos).
Los tejidos de mosquito, los cadáveres restantes (resto del cuerpo) o el cuerpo entero se diseccionaron en metanol al 100 % y se homogeneizaron con un homogeneizador de perlas (perlas de vidrio de 2 mm, 2400 rpm, 90 s). Las cantidades de tejido y los volúmenes de metanol fueron los siguientes: resto del cuerpo, 50 en 1000 µl; MAG, 50–100 80 µl; LRT hembra, 25–50 80 µl. El precipitado se sometió a una segunda extracción con metanol con el mismo volumen de metanol. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación. El metanol de ambas extracciones se combinó y se secó bajo flujo de nitrógeno, luego se resuspendió en los siguientes volúmenes de metanol al 80 % en agua: resto del cuerpo, 50 µl; MAG y LRT hembra, 30 µl.
Las muestras se analizaron en un espectrómetro de masas (ID-X, Thermo Fisher) acoplado a un instrumento de LC (Vanquish, Thermo Fisher). Se inyectaron 5 µl de muestra en una columna de 3 µm, 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) mantenida a 25 °C. Las fases móviles para la LC fueron A (agua, 0,1 % de ácido fórmico) y B (acetonitrilo, 0,1 % de ácido fórmico). El gradiente de LC fue el siguiente: 5 % de B durante 1 minuto, luego aumentó a 100 % de B durante 11 minutos. Después de 8 minutos al 100 %, reequilibró la columna al 5 % de B durante 4 minutos. El caudal fue de 0,3 ml min-1. La ionización en la fuente de MS se realiza mediante ionización por electrospray calentada en modos positivo y negativo.
El espectrómetro de masas mide datos en el rango m/z de 350 a 680 con una resolución de 60 000 en modo MS completo. Los datos MS/MS se adquirieron en [M + H]+ (todos los objetivos), [M - H2O + H]+ (todos los objetivos) y [M - H]- (objetivos fosforilados). Los datos MS/MS se utilizaron para confirmar las propiedades de ecdisona de los objetivos para los que no había un estándar disponible. Para identificar ecdisteroides no dirigidos, se analizaron los datos MS/MS de todos los picos de HPLC con >15 % de abundancia relativa. Cuantifique utilizando curvas estándar creadas a partir de estándares puros (20E, 3D20E) para calcular cantidades absolutas o diluciones de una muestra específica (todos los demás objetivos) para calcular su equivalencia a las cantidades encontradas en un macho. Para 3D20E, la cuantificación se realizó utilizando la suma de los siguientes aductos: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Los datos se extrajeron y cuantificaron utilizando Tracefinder (versión 4.1). Los datos de MS/MS se analizaron utilizando Xcalibur (versión 4.4). Los espectros de MS de E, 20E y 3D20E se compararon con los estándares respectivos. 3D20E22P se analizó mediante derivatización con el reactivo de Girard. 20E22P se analizó mediante la relación m/z.
El compuesto 3D20E22P se purificó a partir de MAG. La purificación se realizó a escala analítica utilizando un cromatógrafo líquido de ultra alto rendimiento (Acquity, Waters) con un detector de masas cuadrupolar (QDa, Acquity, Waters) bajo las mismas condiciones de LC que el análisis HPLC-MS/MS. La recolección de fracciones se activó cuando se detectó el m/z correspondiente a 3D20E22P en el mismo tiempo de retención que se determinó previamente. La pureza de los compuestos extraídos se verificó mediante HPLC-MS/MS como se describió anteriormente.
Se extrajo ARN total de 10-12 tejidos reproductivos u otras partes del cuerpo (sin cabeza) utilizando el reactivo TRI (Thermo Fisher) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN se trató con TURBO DNase (Thermo Fisher). Se sintetizó ADNc utilizando la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los cebadores para la PCR cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR; Tabla de datos extendida 2) se publicaron previamente24 o se diseñaron utilizando Primer-BLAST26, dando preferencia a productos de 70-150 pb de tamaño que abarcan uniones exón-exón o pares de cebadores que separan exones. Las muestras de ADNc de tres a cuatro réplicas biológicas se diluyeron cuatro veces en agua para la RT-qPCR. La cuantificación se realizó en reacciones replicadas de 15 µl que contenían 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), cebadores y 5 µl de ADNc diluido. ADNc. Las reacciones se realizaron en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 6 Pro (Thermo Fisher) y los datos se recopilaron y analizaron utilizando Design and Analysis (versión 2.4.3). Como se demostró en este estudio, las cantidades relativas se normalizaron con respecto al gen ribosomal RpL19 (AGAP004422), cuya expresión no cambió significativamente con la alimentación sanguínea 27 o el apareamiento 3.
La calidad del ARN se verificó utilizando un Bioanalyzer 2100 de Agilent. Las bibliotecas de extremos emparejados de Illumina se prepararon y ejecutaron en el Broad Institute del MIT y Harvard. Las lecturas de secuenciación se alinearon con el genoma de A. gambiae (cepa PEST, versión 4.12) utilizando HISAT2 (versión 2.0.5) con parámetros predeterminados. Las lecturas con puntuaciones de calidad de mapeo (MAPQ) <30 se eliminaron utilizando Samtools (versión 1.3.1). El número de lecturas mapeadas a genes se contó utilizando htseq-count (versión 0.9.1) con parámetros predeterminados. Los recuentos de lecturas normalizados se calcularon y la expresión génica diferencial se analizó utilizando el paquete DESeq2 (versión 1.28.1) en R (versión 4.0.3).
Los genes candidatos modificadores de ecdisona se identificaron buscando primero en el genoma de A. gambiae usando el algoritmo PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), usando valores predeterminados Parámetros con las siguientes secuencias de proteínas de consulta: de Bombyx mori (Número de acceso NP_001038956.1), Musca domestica (Número de acceso XP_005182020.1, XP_005175332.1 y XP_011294434.1) y Microplitis demolitor (Número de acceso XP_008552646.1 y XP_008552645.1) EcK de B. mori (Número de acceso NP_001036900), Drosophila melanogaster (Número de acceso NP_651202), Apis mellifera (Número de acceso XP_394838) y Acyrthosiphon pisum (Número de acceso XP_001947166); y EPP de B. mori (Número de acceso XP_001947166) NP_001177919.1 y NP_001243996.1) y EO de D. melanogaster (Número de acceso NP_572986.1) (paso 1). A continuación, filtre los resultados en función de la alta expresión de ARNm (>100 fragmentos/kilobase exones por millón de lecturas mapeadas (FPKM) o >85%) en tejido reproductivo (LRT o MAG hembra) en Gambia (paso 2). Para mejorar la especificidad, seleccionamos enzimas candidatas que también se expresan en el tejido reproductivo de A. albimanus, una especie de Anopheles que no sintetiza ni transfiere ecdisona durante el apareamiento. Los genes candidatos se filtraron en función de una baja expresión (<100 FPKM o <85.º percentil) en el tejido reproductivo de A. albimanus (paso 3). Como filtro final (paso 4), los genes candidatos deben cumplir al menos uno de los siguientes: (1) estar significativamente regulados positivamente después del apareamiento (P < 0,05) según el análisis de genes expresados ​​diferencialmente y (2) en tejidos no reproductivos (<85 % o <100 FPKM).
Modificamos los métodos descritos previamente 28,29,30 para lograr el marcaje isotópico de organismos completos. Brevemente, se probó Saccharomyces cerevisiae tipo II de tipo salvaje (YSC2, Sigma) en una base de nitrógeno para levaduras (BD Difco, DF0335) que contenía (p/v) 2% de glucosa (G7528, Sigma), 1,7% de medio de cultivo libre de aminoácidos y sulfato de amonio) y 5% de sulfato de amonio 15N (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) como única fuente de nitrógeno. La levadura se recuperó por centrifugación y las larvas de mosquito se alimentaron ad libitum hasta la pupación. Se suplementó con harina de pescado (0,5 mg por 300 larvas) para prevenir la mortalidad del cuarto estadio. Solo se utilizaron hembras en experimentos de apareamiento con machos no marcados para analizar el proteoma masculino transferido durante el apareamiento.
Se forzó el apareamiento de hembras vírgenes marcadas con 15N de 4 a 6 días de edad con machos vírgenes no marcados de la misma edad. El apareamiento exitoso se verificó mediante la detección de tapones de apareamiento bajo microscopía de epifluorescencia. A las 3, 12 y 24 hpm, los atrios de 45 a 55 hembras apareadas se disecaron en 50 µl de tampón de bicarbonato de amonio (pH 7,8) y se homogeneizaron con un mortero. El homogeneizado se centrifugó y el sobrenadante se mezcló con 50 µl de RapiGest al 0,1 % (186001860, Waters) en bicarbonato de amonio 50 mM. El sobrenadante y el precipitado de cada muestra se congelaron rápidamente en hielo seco y se enviaron durante la noche al laboratorio MacCoss en la Universidad de Washington, donde se completó la preparación de la muestra para LC-MS/MS. Resuspenda el precipitado en 50 µl de 0,1 % RapiGest se disolvió en bicarbonato de amonio 50 mM y se sonicó en un baño de agua. La concentración de proteína del precipitado y del sobrenadante se midió mediante el ensayo BCA. Las muestras se redujeron con ditiotreitol (DTT; Sigma) 5 mM, se alquilaron con yodoacetamida (Sigma) 15 mM y se incubaron a 37 °C (1:0 50) durante 1 hora con tripsinización: tripsina: sustrato. RapiGest se lisó mediante la adición de HCl 200 mM, seguido de una incubación a 37 °C durante 45 minutos y centrifugación a 14 000 rpm durante 10 minutos a 4 °C para eliminar los restos celulares. Las muestras se lavaron mediante extracción en fase sólida de modo dual (cartuchos Oasis MCX, Waters) y se resuspendieron en ácido fórmico al 0,1% para obtener una concentración final de proteína de 0,33 µg. µl-1. Los proteomas MAG sin marcar se analizaron de manera similar a partir de machos vírgenes. Se analizaron dos réplicas analíticas para cada muestra. A continuación, se analizó 1 µg de cada uno utilizando una columna de sílice fundida de 25 cm y 75 μm con una trampa de frita de sílice fundida Kasil1 (PQ) de 4 cm empaquetada con resina de fase inversa Jupiter C12 (Phenomenex) y cromatografía líquida de 180 minutos. Digestión de muestras: MS/MS se ejecutó en un espectrómetro de masas Q-Exactive HF (Thermo Fisher) con un sistema nanoACQUITY UPLC (Waters). Los datos de adquisición relacionados con los datos generados para cada ejecución se convirtieron al formato mzML usando Proteowizard (versión 3.0.20287) y usando Comet31 (versión 3.2) contra la base de datos FASTA que contiene secuencias de proteínas de Anopheles gambiae (VectorBase versión 54), Anopheles coluzzi Se realizó una búsqueda en Mali-NIH (VectorBase versión 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, marzo de 2021), A. gambiae RNA-seq y traducciones de tres marcos de lectura de contaminantes humanos conocidos. Los FDR coincidentes del mapa de péptidos se determinaron usando Percolator32 (versión 3.05) con un umbral de 0.01, y los péptidos se ensamblaron en identificaciones de proteínas usando parsimonia de proteínas en Limelight33 (versión 2.2.0). La abundancia relativa de proteínas se estimó utilizando el factor de abundancia espectral normalizado (NSAF) calculado para cada proteína en cada ejecución como se describió anteriormente. El NSAF relativo a cada proteína se promedió entre muestras de dos réplicas biológicas diferentes. El marcaje con 15N enmascaró con éxito el proteoma femenino, aunque se pudo detectar una pequeña cantidad de proteína no marcada de las vírgenes marcadas. Registramos la detección de reducción de proteína masculina (1-5 espectros) en muestras crudas femeninas solo en ejecuciones técnicas, donde las muestras crudas se procesaron después de las muestras masculinas/de apareamiento, como resultado del "arrastre" de HPLC. Las proteínas ocasionales encontradas como "contaminantes" de las vírgenes marcadas se enumeran en la Tabla suplementaria 1.
Dos péptidos antigénicos, QTTDRVAPAPDQQQ (dentro del isotipo PA) y MESDGTTPSGDSEQ (dentro de los isotipos PA y PB) en Genscript. Los dos péptidos se combinaron, luego se conjugaron con la proteína portadora KLH y se inyectaron en conejos de Nueva Zelanda. Los conejos fueron sacrificados después de la cuarta inyección y la IgG total se aisló mediante purificación por afinidad. La IgG del conejo más específico para EPP se utilizó para un análisis de Western blot posterior.
Para los Western blots, se añadieron por separado MAG (n = 10, donde n representa el número de muestras de mosquitos biológicamente independientes) y LRT hembra (n = 30) de machos vírgenes de 4 días de edad y hembras vírgenes o apareadas a la fuerza (<10 post-apareamiento). Las muestras se homogeneizaron inmediatamente después de la disección con un homogeneizador de perlas (perlas de vidrio de 2 mm, 2400 rpm, 90 s). Los restos insolubles se eliminaron mediante centrifugación a 20 000 g a 4 °C. Las proteínas se cuantificaron mediante el ensayo de Bradford (Bio-Rad). Luego, se añadieron 20 µg de proteína MAG, 40 µg de proteína LRT, y 20 µg de proteína residual total se desnaturalizaron y separaron mediante 10% Bis-Tris NuPAGE utilizando tampón MOPS. Las proteínas se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno utilizando el sistema de transferencia iBlot2 (Thermo Fisher). Las membranas se lavaron dos veces en 1× PBS-T (0,1% Tween-20 en PBS) y luego se bloquearon en tampón de bloqueo Odyssey (Li-Cor) durante 1 hora a 22 °C. Las membranas se agitaron durante la noche a 4 °C con anticuerpo primario policlonal de conejo anti-EPP personalizado (1:700 en tampón de bloqueo) y anticuerpo primario monoclonal de rata anti-actina MAC237 (Abeam; 1:4000). Las membranas se lavaron con PBS-T y luego se incubaron con anticuerpos secundarios (anti-conejo de burro 800CW y anti-rata de cabra 680LT (Li-Cor), ambos 1:20 000) en tampón de bloqueo. que contenía 0,01 % de SDS y 0,2 % de Tween-20 durante 1 hora a 22 °C. Las membranas se lavaron con PBS-T y se obtuvieron imágenes con un escáner Odyssey CLx. Las imágenes se recopilaron y procesaron en Image Studio (versión 5.2). No se detectó una banda específica correspondiente a la isoforma EPP-RA (82 kDa).
Las regiones codificantes de EPP (como isoforma AGAP002463-RB que contiene el dominio de histidina fosfatasa, búsqueda de dominio conservado NCBI 34) y EcK2 (AGAP002181) se clonaron en el plásmido pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); Los cebadores se enumeran en la Tabla de datos extendidos 2. Se insertaron ocho enlazadores GS4 (en tándem) antes de la etiqueta 6xHis C-terminal del constructo pET-21a(+)-EcK2. Las proteínas recombinantes se produjeron utilizando la reacción de síntesis de proteínas de E. coli libre de células NEBExpress (New England BioLabs). Las proteínas recombinantes se purificaron utilizando columnas de centrifugación de níquel NEBExpress (New England BioLabs). La proteína de control de dihidrofolato reductasa (DHFR) se produjo utilizando una plantilla de ADN del kit de síntesis de proteínas de E. coli libre de células NEBExpress. Las proteínas se almacenaron en glicerol al 50% en PBS a -20 °C durante un máximo de 3 meses.
La actividad fosfatasa de los extractos de EPP y de tejido se midió utilizando 4-nitrofenilfosfato (pNPP; Sigma-Aldrich). El tampón de reacción contenía 25 mM Tris, 50 mM ácido acético, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA y 1 mM DTT. El tejido se homogeneizó en el tampón de reacción y los restos celulares se eliminaron por centrifugación. Inicie la reacción agregando enzima o extracto de tejido al tampón de reacción que contenía 2,5 mg ml-1 de pNPP. La mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente en la oscuridad y la cantidad de pNP convertida a partir de pNPP se cuantificó midiendo la absorbancia a 405 nm en diferentes momentos.
Para la actividad de EcK in vitro, la proteína se incubó con 0,2 mg de 20E o 3D20E en 200 µl de tampón (pH 7,5) que contenía 10 mM de HEPES–NaOH, 0,1% de BSA, 2 mM de ATP y 10 mM de MgCl2 durante 2 h a 27 °C. La reacción se detuvo añadiendo 800 µl de metanol, luego se enfrió a -20 °C durante 1 hora y luego se centrifugó a 20.000 g durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante se analizó mediante HPLC-MS/MS. Para inactivar por calor las proteínas utilizadas en el grupo de control, las proteínas se incubaron en glicerol al 50% en PBS durante 20 min a 95 °C.
Para la actividad EPP in vitro, la proteína se incubó con 3D20E22P (equivalente a la cantidad encontrada en 18 pares de MAG, purificados por HPLC-MS/MS) en 100 µl de tampón (pH 7,5) que contenía 25 mM Tris, 50 mM ácido acético, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA y 1 mM DTT durante 3 horas a 27 °C. La reacción se detuvo añadiendo 400 µl de metanol y se enfrió a -20 °C durante 1 hora, luego se centrifugó a 20.000 g durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante se analizó mediante HPLC-MS/MS.
Los fragmentos de PCR para EPP (362 pb), EcK1 (AGAP004574, 365 pb) y EcK2 (556 pb) se amplificaron a partir de ADNc preparado a partir de cadáveres de mosquitos sin cabeza de ambos sexos. El fragmento de PCR del control eGFP (495 pb) se amplificó a partir del pCR2.1-eGFP descrito previamente; Los cebadores de PCR se enumeran en la Tabla de Datos Extendidos 2. El fragmento de PCR se insertó entre los promotores T7 invertidos en el plásmido pL4440. Los constructos de plásmido se recuperaron de E. coli competente NEB 5-α (New England Biolabs) y se verificaron mediante secuenciación de ADN antes de su uso (véase Datos Suplementarios 1 para la secuencia del inserto). Se utilizaron cebadores que coincidían con el promotor T7 (Tabla de Datos Extendidos 2) para amplificar el inserto del plásmido basado en pL4440. El tamaño del producto de PCR se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa. El ARN bicatenario se transcribió a partir de plantillas de PCR utilizando el kit de transcripción Megascript T7 (Thermo Fisher) y se purificó de acuerdo con las instrucciones del fabricante con las modificaciones descritas previamente.
Para la inyección de dsRNA, se inyectaron 1380 ng de dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) a una concentración de 10 ng nl-1 en el tórax de machos o hembras adultos (Nanoject III, Drummond) dentro de 1 día después de la eclosión. Los niveles de silenciamiento génico se determinaron en al menos tres réplicas biológicas mediante extracción de ARN, síntesis de ADNc y RT-qPCR. Para la inyección de ecdisona, se inyectaron a hembras vírgenes alimentadas con sangre de 4 días de edad o de 6 días de edad con 0,13, 0,21 o 0,63 µg de 20E o 3D20E (Nanoject III, Drummond) a concentraciones de 1,3, 2,1, respectivamente, dependiendo del diseño experimental o 6,3 ng nl-1. Inyectar 100 nl de 10% (vol/vol) etanol en agua; 100 nl de 3D20E22P en etanol al 10% (equivalente al 75% de la cantidad encontrada en un par de MAG). Los mosquitos fueron asignados aleatoriamente al grupo de inyección.
Para los ensayos de desove, se alimentó a hembras de 3 días de edad ad libitum con sangre humana. Se retiraron los mosquitos parcialmente alimentados o no alimentados. Dependiendo del tratamiento, las hembras se colocaron en recipientes de desove separados durante cuatro noches, al menos 48 horas después de la ingesta de sangre. Los huevos se contaron bajo un estereoscopio (Stemi 508, Zeiss); para las hembras apareadas, los huevos que eclosionaron en larvas se consideraron fértiles.
Para los ensayos de apareamiento, se permitió a las hembras al menos 2 días dependiendo del tratamiento para desarrollar resistencia al apareamiento, y posteriormente se introdujeron machos de tipo salvaje de la misma edad en la misma jaula. Dos noches después, se disecaron las vesículas fertilizadas de las hembras y se liberó el ADN genómico mediante congelación-descongelación y sonicación en un tampón que contenía 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA y 25 mM NaCl (pH 8,2). Las muestras se incubaron con proteinasa K (0,86 µg µl-1) durante 15 minutos a 55 °C, seguidos de 10 minutos a 95 °C. Las preparaciones de ADN genómico crudo se diluyeron 10 veces y se sometieron a detección por qPCR de secuencias del cromosoma Y; los cebadores se enumeran en la Tabla de datos extendidos 2. La ausencia de secuencia del cromosoma Y indica que no hubo apareamiento.
Para los ensayos de reapareamiento, se examinaron las hembras apareadas forzadamente para detectar la presencia de tapones de apareamiento para confirmar el estado de apareamiento y se les permitió 2 días para desarrollar refractariedad al apareamiento en ausencia de machos, como se describió previamente 36. Luego, se introdujeron machos portadores de esperma transgénico DsRed en las jaulas de las hembras. Dos noches después, se disecaron las vesículas de fertilización de las hembras y se preparó el ADN genómico como se describió anteriormente y se sometió a la detección por qPCR del transgén DsRed; los cebadores se enumeran en la Tabla de datos extendidos 2. La ausencia del transgén DsRed indicó que no se produjo reapareamiento.
El 3D20E se sintetizó como se describió previamente 37. Brevemente, 10 mg de 20E (Sigma-Aldrich) se disolvieron en 10 ml de agua, seguido de la adición de 30 mg de negro de platino (en forma de polvo, Sigma-Aldrich). Se burbujeó continuamente una corriente suave de O2 en la mezcla de reacción, que se agitó a temperatura ambiente. Después de 6 horas, se agregaron 30 ml de metanol para detener la reacción. La mezcla se centrifugó para eliminar las partículas del catalizador. El sobrenadante se evaporó a sequedad al vacío a temperatura ambiente. El producto de reacción seco se disolvió en etanol al 10 % y metanol para inyección para análisis HPLC-MS/MS. La tasa de conversión (de 20E a 3D20E) fue de aproximadamente el 97 % (Fig. 4b), y el espectro MS del 3D20E sintetizado coincidió con el encontrado en hembras apareadas (Fig. 4c).
La leyenda contiene detalles específicos de las pruebas estadísticas realizadas. Se utilizó GraphPad (versión 9.0) para realizar la prueba exacta de Fisher, la prueba de Mantel-Cox y la prueba t de Student. Las pruebas de Cochran-Mantel-Haenszel se realizaron utilizando un script R personalizado (disponible en https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). La distribución de los datos se probó para la normalidad utilizando la prueba de Shapiro-Wilk con un umbral de significancia de 0,05. Cuando los datos no superaron la prueba de normalidad, se realizó la prueba de Mann-Whitney. Los datos de supervivencia se analizaron utilizando la prueba de Mantel-Cox. Se utilizó el paquete DESeq2 (versión 1.28.1) para realizar el análisis de expresión diferencial a nivel de gen de RNA-seq. La barra horizontal en el gráfico representa la mediana. Se utilizó un valor de significancia de P = 0,05 como umbral para todas las pruebas.
Para obtener más información sobre el diseño del estudio, consulte el resumen del Nature Research Report vinculado a este artículo.
Los datos proteómicos de espectrometría de masas se depositaron en el Consorcio ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) a través del Repositorio Asociado PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride/) con el identificador de conjunto de datos PXD032157.
El conjunto de datos de secuenciación de ARN (RNA-seq) se encuentra depositado en la Biblioteca Integral de Expresión Génica (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) con el número de registro GSE198665.
Los conjuntos de datos adicionales generados y/o analizados durante el presente estudio pueden obtenerse de los autores correspondientes previa solicitud razonable. Este artículo proporciona los datos de origen.
De Loof, A. Ecdisteroides: ¿esteroides sexuales de insectos olvidados? Macho: Caja negra. Insect Science. 13, 325–338 (2006).
Helecho rojo, CPF 20-hidroxiecdisona y desarrollo ovárico en Anopheles stephens. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).