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Los gránulos de Ban-Lan-Gen atenúan la colitis recurrente crónica inducida por sulfato de sodio de dextrano en ratones al modular la microbiota intestinal y restaurar la producción intestinal de SCFA Derived-GLP-1.
Jiao Peng,1-3,*Li Xi,4,*Zheng Lin,3,5 Duan Lifang,1 Gao Zhengxian,2,5 Diehu,1 Li Jie,6 Li Xiaofeng,6 Shen Xiangchun,5 Xiao Haitao21Departamento de Farmacia del Hospital de la Universidad de Pekín en Shenzhen, Shenzhen, República Popular China; 2Facultad de Farmacia del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Shenzhen, Shenzhen, República Popular China; 3Centro de Investigación de Tecnología de Ingeniería de la Universidad Médica de Guizhou para el Desarrollo y la Aplicación de la Medicina Étnica y la Medicina Tradicional China Ministerio de Educación, Laboratorio Provincial Clave de Farmacia de Guizhou, Universidad Médica de Guizhou, Guiyang, República Popular China; 4 Departamento de Gastroenterología, Hospital de la Universidad de Pekín en Shenzhen, Shenzhen, República Popular China; 5 Facultad de Farmacia, Universidad Médica de Guizhou, Laboratorio Estatal Clave de Función y Aplicación de Plantas Medicinales, Guiyang; 6 Departamento de Medicina de Laboratorio, Hospital de Shenzhen de la Universidad de Pekín, Shenzhen, China [email protected] Shen Xiangchun, Facultad de Farmacia, Universidad Médica de Guizhou, Guizhou, República Popular China, 550004, Correo electrónico [email protected] Objetivo: La terapia basada en GLP-1 es una nueva opción de tratamiento para la enfermedad inflamatoria intestinal. Los gránulos de Ban-Lan-Gen (BLG) son una formulación antiviral conocida de la medicina tradicional china que exhibe una posible actividad antiinflamatoria en el tratamiento de diversas afecciones inflamatorias. Sin embargo, su efecto antiinflamatorio sobre la colitis y su mecanismo de acción aún no están claros. MÉTODOS: Establecer la colitis recurrente crónica inducida por sulfato sódico de dextrano (DSS) en ratones. Se analizaron los índices de actividad de la enfermedad, los marcadores histológicos de lesión y los niveles de citocinas proinflamatorias para evaluar el efecto protector del BLG. Los efectos del BLG sobre la microbiota intestinal y el intestino se caracterizaron mediante los niveles séricos de GLP-1 y los niveles colónicos de Gcg, GPR41 y GRP43. Expresión, composición de la microbiota intestinal, niveles fecales de SCFA y liberación de GLP-1 de la producción de GLP-1 derivada de SCFA en células epiteliales colónicas primarias de ratón. Resultados: El tratamiento con BLG redujo significativamente la pérdida de peso corporal, el DAI, el acortamiento del colon, el daño tisular del colon y los niveles de citocinas proinflamatorias de TNF-α, IL-1β e IL-6 en el tejido colónico. Además, el tratamiento con BLG puede restaurar significativamente la expresión colónica de Gcg, GPR41 y GRP43 y los niveles séricos de GLP-1 en ratones con colitis, y al aumentar las bacterias productoras de SCFA como Akkermansia y Prevotellaceae_UCG-001, y reducir la abundancia de bacterias como Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas y Oscillibacter. Además, el tratamiento con BLG puede aumentar significativamente el nivel de SCFA en las heces de ratones con colitis. Al mismo tiempo, experimentos in vitro también demostraron que el extracto fecal de ratones tratados con BLG puede estimular significativamente la secreción de GLP-1 por parte de las células epiteliales colónicas pequeñas primarias murinas. Conclusiones: Estos hallazgos sugieren que el BLG tiene un efecto anticólico. El BLG tiene potencial para desarrollarse como terapia, al menos en parte, modulando la microbiota intestinal y restaurando la producción de GLP-1 derivado de AGCC intestinal. Fármacos prometedores para la colitis crónica recurrente. Palabras clave: colitis, gránulos Ban-Lan-Gen, microbiota intestinal, ácidos grasos de cadena corta, GLP-1.
La colitis ulcerosa (CU) es una enfermedad inflamatoria crónica del colon y el recto que se caracteriza por diarrea recurrente, dolor abdominal, pérdida de peso y heces mucopurulentas con sangre.1 Recientemente, la prevalencia de la CU ha aumentado en países que anteriormente tenían una incidencia baja, incluida China, con la creciente popularidad de los estilos de vida occidentales.2 Este aumento plantea importantes problemas para la salud pública y tiene serias implicaciones para la capacidad de los pacientes para trabajar y su calidad de vida. Cabe destacar que la patogénesis de la CU sigue siendo en gran medida poco clara, pero generalmente se acepta que la genética, los factores ambientales, la microbiota intestinal y el sistema inmunitario contribuyen al desarrollo de la CU.3 Incluso ahora, no existe cura para la CU, y el objetivo del tratamiento es controlar clínicamente los síntomas clínicos, inducir y mantener la remisión, promover la curación de la mucosa y reducir la recurrencia. Los tratamientos clásicos incluyen aminosalicilatos, corticosteroides, inmunosupresores y productos biológicos. Sin embargo, estos medicamentos no pueden lograr el efecto deseado debido a sus diversos efectos secundarios.4 Recientemente, muchos estudios de casos han demostrado que los tratamientos tradicionales La medicina china (MTC) ha demostrado un gran potencial para ayudar a aliviar la CU con baja toxicidad, lo que sugiere que el desarrollo de nuevas terapias de MTC es una estrategia de tratamiento prometedora para la CU.5-7
Los gránulos de Banlangen (BLG) son una preparación de la medicina tradicional china hecha a partir del extracto acuoso de la raíz de Banlangen.8 Además de su eficacia antiviral, los BLG exhiben una actividad antiinflamatoria potencial en el tratamiento de varias afecciones inflamatorias.9,10 Además, se han aislado e identificado glucosinolatos (R,S-goitrina, progoitrina, epiprorrubina y glucósido a partir de extractos acuosos de Radix isatidis) y nucleósidos (hipoxantina, adenosina, uridina y guanosina) y alcaloides índigo como el índigo y la indirrubina.11,12 Estudios previos han documentado bien que los compuestos adenosina, uridina e indirrubina exhiben potentes efectos anticólicos en diferentes modelos animales de colitis.13-17 Sin embargo, no se han realizado estudios basados ​​en evidencia para evaluar la eficacia de los BLG en la colitis. En el presente estudio, investigamos el efecto protector de los BLG en la colitis recurrente crónica inducida por sulfato de sodio de dextrano (DSS) en Se estudió a ratones C57BL/6 y se descubrió que la administración oral de BLG atenuó significativamente la inflamación recurrente crónica del colon inducida por DSS en ratones. La inflamación, sus mecanismos reguladores están asociados con la modulación de la microbiota intestinal y la restauración de la producción del péptido 1 similar al glucagón (GLP-1) derivado del intestino.
Los gránulos de BLG (sin azúcar, aprobado por la NMPA Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Pekín, China; número de lote: 20110966) se adquirieron en farmacias. El DSS (peso molecular: 36 000–50 000 daltons) se adquirió en MP Biologicals (Santa Ana, EE. UU.). La sulfasalazina (SASP) (≥ 98 % de pureza), la hematoxilina y la eosina se adquirieron en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Los kits de ensayo ELISA luminex de TNF-α, IL-1β e IL-6 de ratón se adquirieron en R&D Systems (Minneapolis, MN, EE. UU.). El ácido acético, el ácido propiónico y el ácido butírico se adquirieron en Aladdin Industries (Shanghái, China). El ácido 2-etilbutírico se adquirió en Merck KGaA (Darmstadt, Alemania).
Se adquirieron ratones machos C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad (peso corporal 18-22 g) de Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Pekín, China) y se alojaron en un entorno de 22 ± 2 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Los ratones fueron alimentados con una dieta estándar para roedores con libre acceso a agua potable durante una semana para aclimatarse al nuevo entorno. Luego, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos: grupo de control, grupo modelo DSS, grupo tratado con SASP (200 mg/kg, oral) y grupo tratado con BLG (1 g/kg, oral). Como se muestra en la Figura 1A, según nuestro estudio anterior, se indujo colitis crónica recurrente experimental en ratones mediante tres ciclos de DSS al 1,8 % durante 5 días, seguidos de agua destilada durante 7 días, según nuestro estudio anterior.18 Los ratones de los grupos tratados con SASP y BLG fueron tratados con SASP y BLG, respectivamente, todos los días a partir del día 0. Según experimentos preliminares, la dosis de BLG se fijó en 1 g/kg. Mientras tanto, la dosis de SASP se fijó en 200 mg/kg según la literatura.4 Los grupos modelo de control y DSS recibieron el mismo volumen de agua durante todo el experimento.
Figura 1. BLG mejora la colitis recurrente crónica inducida por DSS en ratones. (A) Diseño experimental de colitis recurrente crónica y tratamiento, (B) cambio de peso corporal, (C) puntuación del índice de actividad de la enfermedad (DAI), (D) longitud del colon, (E) imagen representativa del colon, (F) tinción H&E del colon (aumento, ×100) y (G) puntuación histológica. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 6). ##p < 0,01 o ###p < 0,001 frente al grupo de control (Con); *p < 0,05 o **p < 0,01 o ***p < 0,001 frente al grupo DSS.
Se registraron diariamente el peso corporal, la consistencia de las heces y el sangrado rectal. El índice de actividad de la enfermedad (DAI) se determinó combinando puntuaciones de peso corporal, consistencia de las heces y sangrado rectal como se describió anteriormente.19 Al final del experimento, todos los ratones fueron sacrificados y se recogió sangre, heces y colon para experimentos posteriores.
El tejido del colon se fijó con formalina y se incluyó en parafina. Se realizaron secciones de 5 micrones y se tiñeron con hematoxilina-eosina (H&E), luego se cegaron y se calificaron como se describió previamente.19
El ARN total del tejido del colon se extrajo mediante el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), seguido de la extracción de ADNc con transcriptasa inversa (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Japón). La PCR cuantitativa se realizó utilizando un sistema de PCR en tiempo real con SYBR Green Master (Roche, Basilea, Suiza). Las transcripciones de los genes diana se normalizaron a β-actina y los datos se analizaron utilizando el método 2-ΔΔCT. Las secuencias de cebadores de genes se muestran en la Tabla 1.
El aislamiento y cultivo de células epiteliales colónicas primarias de ratón se realizó como se describió previamente.20 Brevemente, los colones de ratones de 6 a 8 semanas de edad se extirparon primero después del sacrificio por dislocación cervical, luego se abrieron longitudinalmente, se trataron con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS, sin calcio ni magnesio) y se cortaron en trozos pequeños de 0,5 a 1 mm. Posteriormente, los tejidos se digirieron con 0,4 mg/ml de colagenasa XI (Sigma, Poole, Reino Unido) en medio DMEM libre y se centrifugaron a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Resuspender el pellet en medio DMEM (suplementado con 10 % de suero bovino fetal, 100 unidades/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina) a 37 °C y pasar a través de una malla de nailon (tamaño de poro ~250 µm). Se colocaron alícuotas de células epiteliales colónicas en placas de fondo de vidrio y se incubaron con ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico y extractos fecales de ratón durante 2 horas a 37°C, 5% de CO2.
El tejido del colon se homogeneizó con PBS y los niveles de citocinas IL-6, TNF-α e IL-1β en el tejido del colon se detectaron utilizando kits de ensayo ELISA Luminex (R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.). Asimismo, los niveles de GLP-1 en suero y medio de cultivo de células epiteliales colónicas murinas primarias se determinaron con un kit ELISA (Bioswamp, Wuhan, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El ADN total de las heces se extrajo utilizando un kit de extracción de ADN (Tiangen, China). La calidad y la cantidad de ADN se midieron en las proporciones de 260 nm/280 nm y 260 nm/230 nm, respectivamente. Posteriormente, utilizando cada ADN extraído como plantilla, se utilizaron los cebadores específicos 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) y 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) para amplificar las regiones V3-V4 del gen ARNr 16S en diferentes regiones. Los productos de PCR se purificaron utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (QIAGEN, Alemania), se cuantificaron mediante PCR en tiempo real y se secuenciaron utilizando la plataforma de secuenciación IlluminaMiseq PE300 (Illumina Inc., CA, EE. UU.). Para el análisis bioinformático, el procesamiento de datos se realizó siguiendo los protocolos informados previamente.21,22 En resumen, utilice Cutadapt (V1.9.1) para filtrar los archivos express sin procesar. Las OTU se agruparon utilizando Se utilizó UPARSE (versión 7.0.1001) con un punto de corte de similitud del 97% y UCHIME para eliminar secuencias quiméricas. El análisis de la composición de la comunidad y la clasificación se realizaron utilizando el clasificador RDP (http://rdp.cme.msu.edu/) basado en la base de datos de genes de ARN ribosomal SILVA.
Los niveles de ácidos grasos de cadena corta (ácido acético, ácido propiónico y ácido butírico) se midieron como lo describieron previamente Tao et al., con algunas modificaciones.23 Brevemente, primero se suspendieron 100 mg de heces en 0,4 mL de agua desionizada, seguido de 0,1 mL de ácido sulfúrico al 50% y 0,5 mL de ácido 2-etilbutírico (estándar interno), luego se homogeneizaron y se calentaron a 4 °C. Centrifugar a 12.000 rpm durante 15 minutos a C. El sobrenadante se extrajo con 0,5 mL de éter y se inyectó en el GC para su análisis. Para el análisis por cromatografía de gases (GC), las muestras se analizaron utilizando un cromatógrafo de gases GC-2010 Plus (Shimadzu, Inc.) equipado con un detector de ionización de llama (FID). La separación se logró utilizando una columna ZKAT-624, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., China). Los datos se adquirieron utilizando el software de solución GC (Shimadzu, Inc.). La relación de división fue de 10:1, el gas portador fue nitrógeno y el caudal fue de 6 mL/min. El volumen de inyección fue de 1 μL. La temperatura del inyector y del detector fue de 300 °C. La temperatura del horno se mantuvo a 140 °C durante 13,5 minutos, luego se aumentó a 250°C a una velocidad de 120°C/min; la temperatura se mantuvo durante 5 minutos.
Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). La significancia de los datos se evaluó mediante ANOVA de una vía seguido de la prueba de rango múltiple de Duncan. Se utilizó el software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE. UU.) para todos los cálculos y p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
Es bien sabido que la CU es una enfermedad de colitis crónica recurrente con dolor abdominal intenso, diarrea y sangrado. Por lo tanto, se estableció la colitis crónica recurrente inducida por DSS en ratones para evaluar la eficacia anticoliótica de la BLG (Fig. 1A). En comparación con el grupo control, los ratones del grupo modelo con DSS presentaron una reducción significativa del peso corporal y un DAI más alto, cambios que se revirtieron significativamente después de 24 días de tratamiento con BLG (Figuras 1B y C). El acortamiento del colon es un rasgo distintivo importante de la CU. Como se muestra en las Figuras 1D y E, la longitud del colon de los ratones que recibieron DSS se acortó significativamente, pero se alivió con el tratamiento con BLG. Posteriormente, se realizó un análisis histopatológico para evaluar la inflamación colónica. Las imágenes teñidas con H&E y las puntuaciones patológicas mostraron que la administración de DSS alteró significativamente la arquitectura colónica y provocó la destrucción de las criptas, mientras que el tratamiento con BLG redujo significativamente la destrucción de las criptas y las puntuaciones patológicas (Figuras 1F y G). Cabe destacar el efecto protector de la BLG a una dosis de 1 La concentración de g/kg fue comparable a la de SASP en una dosis de 200 mg/kg. En conjunto, estos hallazgos sugieren que BLG es eficaz para reducir la gravedad de la colitis recurrente crónica inducida por DSS en ratones.
TNF-α, IL-1β e IL-6 son marcadores inflamatorios importantes de la inflamación colónica. Como se muestra en la Figura 2A, DSS indujo un aumento significativo en la expresión génica de TNF-α, IL-1β e IL-6 en el colon en comparación con el grupo de control. La administración de BLG puede revertir significativamente estos cambios mediados por DSS. A continuación, utilizamos ELISA para determinar los niveles de las citocinas inflamatorias TNF-α, IL-1β e IL-6 en el tejido del colon. Los resultados también mostraron que los niveles colónicos de TNF-α, IL-1β e IL-6 aumentaron significativamente en ratones tratados con DSS, mientras que el tratamiento con BLG alivió estos aumentos (Figura 2B).
Figura 2 BLG inhibe la expresión génica y la producción de las citocinas proinflamatorias TNF-α, IL-1β e IL-6 en el colon de ratones tratados con DSS. (A) Expresión génica colónica de TNF-α, IL-1β e IL-6; (B) Niveles proteicos colónicos de TNF-α, IL-1β e IL-6. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 4-6). #p < 0,05 o ##p < 0,01 o ###p < 0,001 frente al grupo de control (Con); *p < 0,05 o **p < 0,01 frente al grupo DSS.
La disbiosis intestinal es crítica en la patogénesis de la CU.24 Para investigar si BLG modula la microbiota intestinal de ratones tratados con DSS, se realizó la secuenciación del ARNr 16S para analizar la comunidad bacteriana del contenido intestinal. El diagrama de Venn muestra que los tres grupos comparten 385 OTU. Al mismo tiempo, cada grupo tenía OTU únicas (Fig. 3A). Además, el índice Chao1 y el índice de Shannon que se muestran en la Figura 3B y C mostraron que la diversidad de la comunidad de la microbiota intestinal se redujo en los ratones tratados con BLG, ya que el índice de Shannon disminuyó significativamente en el grupo tratado con BLG. El análisis de componentes principales (PCA) y el análisis de coordenadas principales (PCoA) se utilizaron para determinar los patrones de agrupamiento entre los tres grupos y mostraron que la estructura de la comunidad de los ratones tratados con DSS estaba claramente separada después del tratamiento con BLG (Figura 3D y E). Estos datos sugieren que el tratamiento con BLG afectó significativamente la estructura de la comunidad de ratones con colitis inducida por DSS.
Figura 3. La BLG altera la diversidad de la microbiota intestinal en ratones con colitis inducida por DSS. (A) Diagrama de Venn de OTU, (B) Índice Chao1, (C) Índice de riqueza de Shannon, (D) Gráfico de puntuación del Análisis de Componentes Principales (PCA) de OTU, (E) Figura de puntuación del Análisis de Coordenadas Principales (PCoA) de OTU. Los datos se presentan como media ± EEM (n = 6). **p < 0,01 frente al grupo DSS.
Para evaluar los cambios específicos en la microbiota fecal, analizamos la composición de la microbiota intestinal en todos los niveles taxonómicos. Como se muestra en la Figura 4A, los filos principales en todos los grupos fueron Firmicutes y Bacteroidetes, seguidos de Verrucomicrobia. Las abundancias relativas de Firmicutes y las proporciones Firmicutes/Bacteroidetes aumentaron significativamente en las comunidades microbianas fecales de los ratones tratados con DSS en comparación con los ratones de control, y estos cambios se revirtieron significativamente después del tratamiento con BLG. En particular, el tratamiento con BLG aumentó significativamente la abundancia relativa de Verrucobacterium en las heces de ratones con colitis inducida por DSS. A nivel del hogar, las comunidades microbianas fecales estaban ocupadas por Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae y Prevotellaceae (Fig. 4B). En comparación con el grupo DSS, el agotamiento de BLG aumentó la abundancia de Akkermansiaceae, pero disminuyó la abundancia de Lachnospiraceae y Ruminococcaceae. En particular, a nivel de género, la microbiota fecal estuvo ocupada por Lachnospira_NK4A136_group, Akkermansia y Prevotellaceae_UCG-001 (Fig. 4C). Este hallazgo también demostró que el tratamiento con BLG revirtió eficazmente el desequilibrio de la microbiota en respuesta al desafío de DSS, caracterizado por una disminución en Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas y Oscillibacter, y un aumento en Akkermansia y Prevotellaceae_UCG-001.
Figura 4. BLG altera la abundancia de la microbiota intestinal en ratones con colitis inducida por DSS. (A) Abundancia de microbiota intestinal a nivel de filo; (B) Abundancia de microbiota intestinal a nivel de familia; (C) Abundancia de microbiota intestinal a nivel de género. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 6). #p < 0,05 o ###p < 0,001 frente al grupo de control (Con); *p < 0,05 o **p < 0,01 o ***p < 0,001 frente al grupo DSS.
Teniendo en cuenta que los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) son los principales metabolitos de Akkermansia y Prevotellaceae_UCG-001, mientras que el acetato, el propionato y el butirato son los AGCC más abundantes en el lumen intestinal,25-27 todavía estamos en nuestro estudio. Como se muestra en la Figura 5, las concentraciones fecales de acetato, propionato y butirato se redujeron significativamente en el grupo tratado con DSS, mientras que el tratamiento con BLG pudo suprimir en gran medida esta reducción.
Figura 5. BLG aumenta los niveles de SCFA en las heces de ratones con colitis inducida por DSS. (A) Contenido de ácido acético en heces; (B) contenido de ácido propiónico en heces; (C) contenido de ácido butírico en heces. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 6). #p < 0,05 o ##p < 0,01 frente al grupo de control (Con); *p < 0,05 o **p < 0,01 frente al grupo DSS.
Calculamos además el coeficiente de correlación de Pearson entre los SCFA diferenciales a nivel de género y la microbiota fecal. Como se muestra en la Figura 6, Akkermansia se correlacionó positivamente con la producción de ácido propiónico (Pearson = 0,4866) y ácido butírico (Pearson = 0,6192). Por el contrario, tanto Enteromonas como Oscillobacter se asociaron negativamente con la producción de acetato, con coeficientes de Pearson de 0,4709 y 0,5104, respectivamente. Del mismo modo, Ruminococcaceae_UCG-014 se correlacionó negativamente con la producción de ácido propiónico (Pearson = 0,4508) y ácido butírico (Pearson = 0,5842), respectivamente.
Figura 6 Análisis de correlación de Pearson entre SCFA diferenciales y microbios colónicos. (A) Enteromonas con ácido acético; (B) Bacillus de la conmoción cerebral con ácido acético; (C) Akkermansia vs ácido propiónico; (D) Ruminococcus_UCG-014 con ácido propiónico; (E) Akkermansia con ácido butírico; (F) Ruminococcus_UCG-014 con ácido butírico.
El péptido similar al glucagón-1 (GLP-1) es un producto postraduccional específico del tipo celular del proglucagón (Gcg) con propiedades antiinflamatorias.28 Como se muestra en la Figura 7, el DSS indujo una disminución significativa en la expresión del ARNm de Gcg. El tratamiento con colon y BLG pudo revertir significativamente la reducción de Gcg inducida por DSS en comparación con el grupo control (Fig. 7A). Al mismo tiempo, el nivel de GLP-1 en suero se redujo significativamente en el grupo tratado con DSS, y el tratamiento con BLG pudo prevenir en gran medida esta reducción (Fig. 7B). Dado que los ácidos grasos de cadena corta pueden estimular la secreción de GLP-1 a través de la activación del receptor acoplado a proteína G 43 (GRP43) y del receptor acoplado a proteína G 41 (GRP41), también examinamos GPR41 y GRP43 en el colon de ratones con colitis y descubrimos que la expresión del ARNm colónico de GRP43 y GPR41 disminuyó significativamente después de la exposición a DSS y el tratamiento con BLG. Podrían rescatarse eficazmente estas disminuciones (Figura 7C y D).
Figura 7. BLG aumenta los niveles séricos de GLP-1 y la expresión colónica de ARNm de Gcg, GPR41 y GRP43 en ratones tratados con DSS. (A) Expresión de ARNm de Gcg en el tejido del colon; (B) Nivel de GLP-1 en suero; (C) Expresión de ARNm de GPR41 en el tejido del colon; (D) Expresión de ARNm de GPR43 en el tejido del colon. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 5-6). #p < 0,05 o ##p < 0,01 frente al grupo de control (Con); *p < 0,05 frente al grupo DSS.
Dado que el tratamiento con BLG podría aumentar los niveles séricos de GLP-1, la expresión de ARNm de Gcg colónico y los niveles de SCFA fecales en ratones tratados con DSS, examinamos más a fondo el acetato, el propionato y el butirato, así como el control (F-Con), la colitis por DSS (F-Con) -DSS) y los ratones con colitis tratada con BLG (F-BLG) en la liberación de GLP-1 de las células epiteliales colónicas primarias de ratón. Como se muestra en la Figura 8A, las células epiteliales colónicas primarias de ratón tratadas con ácido acético 2 mM, ácido propiónico y ácido butírico, respectivamente, estimularon significativamente la liberación de GLP-1, en consonancia con estudios previos.29,30 Del mismo modo, todos los F-Con, F-DSS y F-BLG (equivalentes a 0,25 g de heces) estimularon en gran medida la liberación de GLP-1 de las células epiteliales colónicas primarias de ratón. En particular, la cantidad de GLP-1 liberada por las células epiteliales colónicas primarias de ratón tratadas con F-DSS fue mucho menor que el de las células epiteliales colónicas primarias de ratón tratadas con F-Con y F-BLG (Figura 8B). Estos datos sugieren que el tratamiento con BLG restauró significativamente la producción de GLP-1 derivada de SCFA intestinal.
Figura 8. Los SCFA derivados de BLG estimulan la liberación de GLP-1 de las células epiteliales colónicas primarias murinas. (A) El ácido acético, el ácido propiónico y el ácido butírico estimularon la liberación de GLP-1 de las células epiteliales colónicas primarias murinas; (B) los extractos fecales F-Con, F-DSS y F-BLG estimularon las células epiteliales colónicas primarias murinas. Cantidad de GLP-1 liberada. Se colocaron alícuotas de células epiteliales colónicas en placas de Petri con fondo de vidrio y se trataron con ácido acético 2 mM, ácido propiónico, ácido butírico y extractos fecales F-Con, F-DSS y F-BLG (equivalentes a 0,25 g de heces), respectivamente. 2 horas a 37 °C, 5 % de CO2, respectivamente. La cantidad de GLP-1 liberada de las células epiteliales colónicas primarias murinas se detectó mediante ELISA. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 3). #p < 0,05 o ##p < 0,01 frente al blanco o F-Con; *p < 0,05 frente a F-DSS.
Abreviaturas: Ace, ácido acético; Pro, ácido propiónico; sin embargo, ácido butírico; F-Con, extracto fecal de ratones de control; F-DSS, extracto fecal de ratones con colitis; F-BLG, de colon tratado con BLG Extractos fecales de ratones inflamatorios.
Considerada por la Organización Mundial de la Salud como una enfermedad refractaria, la CU se está convirtiendo en un peligro global; Sin embargo, los métodos efectivos para predecir, prevenir y tratar la enfermedad aún son limitados. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de explorar y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas seguras y efectivas para la CU. Las preparaciones de medicina tradicional china son una opción prometedora porque se ha demostrado que muchas preparaciones de medicina tradicional china son efectivas en el tratamiento de la CU en la población china a lo largo de los siglos, y todas son materiales orgánicos biológicos y naturales que en su mayoría son inofensivos para los humanos y los animales.31,32 Este estudio tuvo como objetivo buscar una preparación de medicina tradicional china segura y efectiva para el tratamiento de la CU y explorar su mecanismo de acción. El BLG es una fórmula herbal china bien conocida que se usa para tratar la gripe.8,33 El trabajo en nuestro laboratorio y otros ha demostrado que el índigo, un producto de medicina tradicional china procesado a partir de la misma materia prima que el BLG, exhibe una eficacia significativa en el tratamiento de la CU en humanos y animales.4,34 Sin embargo, los efectos anticólicos del BLG y sus efectos El mecanismo no está claro. En el estudio actual, nuestros resultados demuestran que el BLG atenúa eficazmente la inflamación colónica inducida por DSS, que se asocia con Modulación de la microbiota intestinal y restauración de la producción de GLP-1 derivada del intestino.
Es bien sabido que la CU se caracteriza por períodos de recaída con características clínicas típicas, como pérdida de peso, diarrea, sangrado rectal y daño extenso de la mucosa colónica.35 Por lo tanto, la colitis crónica recurrente se administró mediante la administración de tres ciclos de DSS al 1,8% durante cinco días, seguidos de siete días de agua potable. Como se muestra en la Figura 1B, la pérdida de peso fluctuante y las puntuaciones DAI indicaron una inducción exitosa de colitis crónica recurrente. Los ratones en el grupo tratado con BLG mostraron una recuperación ascendente a partir del día 8, que fue significativamente diferente del día 24. Los mismos cambios también se observaron en la puntuación DAI, lo que sugiere una mejora en la mejoría clínica de la colitis. En términos de lesión de colon y estado inflamatorio, la longitud del colon, el daño tisular del colon y la expresión génica y la producción de las citocinas proinflamatorias TNF-α, IL-1β e IL-6 en el tejido del colon también mejoraron en gran medida después del tratamiento con BLG. En conjunto, estos resultados demuestran claramente que BLG es eficaz en el tratamiento de la colitis crónica recurrente en ratones.
¿Cómo ejerce BLG sus efectos farmacológicos?Numerosos estudios previos han demostrado que la microbiota intestinal desempeña un papel clave en la patogénesis de la CU, y las terapias basadas en el microbioma y dirigidas al microbioma han surgido como una estrategia muy atractiva para el tratamiento de la CU.En el presente estudio, demostramos que el tratamiento con BLG resultó en cambios significativos en la composición de la microbiota intestinal, lo que sugiere que el efecto protector de BLG contra la colitis inducida por DSS está relacionado con la modulación de la microbiota intestinal.Esta observación es consistente con la noción de que la reprogramación de la homeostasis de la microbiota intestinal es un enfoque importante para comprender la eficacia de las preparaciones de la MTC.36,37 En particular, Akkermansia es una bacteria gramnegativa y estrictamente anaeróbica que vive en la capa mucosa del intestino, que degrada las mucinas, produce ácido propiónico, estimula la diferenciación de las células caliciformes y mantiene la mucosa. función de la integridad de la barrera.26 Múltiples datos clínicos y animales sugieren que Akkermansia está altamente asociada con una mucosa sana,38 y la administración oral de Akkermansia spp. puede mejorar significativamente la inflamación de la mucosa.39 Nuestros datos actuales sugieren que la abundancia relativa de Akkermansia aumenta significativamente después del tratamiento con BLG. Además, Prevotellaceae_UCG-001 es una bacteria productora de SCFA.27 Múltiples estudios demostraron que Prevotellaceae_UCG-001 se encontró en baja abundancia relativa en las heces de animales con colitis.40,41 Nuestros datos actuales también muestran que el tratamiento con BLG puede aumentar significativamente la abundancia relativa de Prevotellaceae_UCG-001 en el colon de ratones tratados con DSS. Por el contrario, Oscillibacter es una bacteria mesófila, estrictamente anaeróbica.42 informaron que la abundancia relativa de Oscillibacter aumentó significativamente en ratones con CU y se correlacionó significativamente de manera positiva con los niveles de IL-6 e IL-1β y las puntuaciones patológicas.43,44 En particular, el tratamiento con BLG redujo significativamente la abundancia relativa de Oscillibacter en las heces de ratones tratados con DSS. En particular, estas bacterias alteradas por BLG fueron las bacterias que más SCFA producen. Numerosos estudios previos han demostrado los posibles efectos beneficiosos de los SCFA sobre la inflamación colónica y la protección de la integridad del epitelio intestinal.45,46 Nuestros datos actuales también observaron que las concentraciones de acetato, propionato y butirato de SCFA en las heces tratadas con DSS aumentaron considerablemente en los ratones tratados con BLG. En conjunto, estos hallazgos demuestran claramente que el tratamiento con BLG puede mejorar de manera efectiva las bacterias productoras de SCFA inducidas por DSS en ratones con colitis crónica recurrente.
El GLP-1 es una incretina producida principalmente en el íleon y el colon, y desempeña un papel importante en el retraso del vaciamiento gástrico y la reducción de la glucosa en sangre posprandial.47 La evidencia sugiere que la dipeptidil peptidasa (DPP)-4, un agonista del receptor de GLP-1, y una nanomedicina de GLP-1 pueden aliviar eficazmente la inflamación intestinal en ratones.48-51 Como se informó en estudios previos, las altas concentraciones de SCFA se asociaron con los niveles plasmáticos de GLP-1 en humanos y ratones. 52 Nuestros datos actuales muestran que después del tratamiento con BLG, los niveles séricos de GLP-1 y la expresión de ARNm de Gcg aumentaron significativamente. Del mismo modo, la secreción de GLP-1 aumentó significativamente en cultivos colónicos después de la estimulación con extractos fecales de ratones con colitis tratados con BLG en comparación con la estimulación con extractos fecales de ratones con colitis tratados con DSS. ¿Cómo afectan los SCFA a la liberación de GLP-1? Gwen Tolhurst et al. informaron que SCFA puede estimular la secreción de GLP-1 a través de GRP43 y GPR41.29 Nuestros datos actuales también muestran que el tratamiento con BLG aumenta significativamente la expresión de ARNm de GRP43 y GPR41 en el colon de ratones tratados con DSS. Estos datos sugieren que el tratamiento con BLG puede restaurar la producción de GLP-1 promovida por SCFA activando GRP43 y GPR41.
BLG es un medicamento de venta libre (OTC) de largo plazo en China. La dosis máxima tolerada de BLG en ratones Kunming es de 80 g/kg y no se ha observado toxicidad aguda.53 Actualmente, la dosis recomendada de BLG (sin azúcar) en humanos es de 9 a 15 g/día (3 veces al día). Nuestro estudio demostró que BLG a 1 g/kg mejoró la colitis recurrente crónica inducida por DSS en ratones. Esta dosis es cercana a la dosis de BLG utilizada clínicamente. Nuestro estudio también descubrió que su mecanismo de acción está mediado, al menos en parte, por alteraciones en la microbiota intestinal, específicamente bacterias productoras de SCFA, como Akkermansia y Prevotellaceae_UCG-001, para restaurar la producción de GLP-1 derivada del intestino. Estos hallazgos sugieren que BLG merece mayor consideración como un posible agente terapéutico para el tratamiento clínico de la colitis. Sin embargo, el mecanismo exacto por el cual modula la microbiota intestinal aún debe ser confirmado por ratones deficientes en microbiota y trasplante bacteriano fecal.
Ace, ácido acético; but, ácido butírico; BLG, pandano; DSS, sulfato sódico de dextrano; DAI, índice de actividad de la enfermedad; DPP, dipeptidil peptidasa; FID, detector de ionización de llama; F-Con, control Extractos fecales de ratones; F-DSS, extractos fecales de ratones con colitis DSS; F-BLG, extractos fecales de ratones con colitis tratados con BLG; GLP-1, péptido similar al glucagón-1; Gcg, glucagón; cromatografía de gases, cromatografía de gases; GRP43, receptor acoplado a proteína G 43; GRP41, receptor acoplado a proteína G 41; H&E, hematoxilina-eosina; HBSS, solución salina equilibrada de Hanks; OTC, OTC; PCA, análisis de componentes principales; PCoA, análisis de coordenadas principales; Pro, ácido propiónico; SASP, sulfasalazina; SCFA, ácidos grasos de cadena corta; Medicina china, medicina tradicional china; CU, colitis ulcerosa.
Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Centro Médico de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Shenzhen-Hong Kong de la Universidad de Pekín (Shenzhen, China) de acuerdo con las Pautas Institucionales y las Regulaciones Animales (número de ética A2020157).
Todos los autores hicieron contribuciones significativas a la concepción y el diseño, la adquisición de datos o el análisis e interpretación de datos; participaron en la redacción del artículo o en la revisión crítica de contenido intelectual importante; aceptaron enviar el manuscrito a la revista actual; aprobaron finalmente la versión para su publicación; fueron responsables de todos los aspectos del trabajo.
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81560676 y 81660479), el proyecto de primera clase de la Universidad de Shenzhen (86000000210), el Fondo del Comité de Innovación en Ciencia y Tecnología de Shenzhen (JCYJ20210324093810026), y el Fondo de Investigación en Ciencia y Tecnología Médica Provincial de Guangdong (A2020157 y A2020272), la Farmacia de la Universidad Médica de Guizhou, Provincia de Guizhou, financiada por Key Laboratory (YWZJ2020-01) y el Hospital de la Universidad de Pekín en Shenzhen (JCYJ2018009).
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