JavaScript está actualmente desactivado en su navegador. Algunas funciones de este sitio web no funcionarán cuando JavaScript esté desactivado.
Regístrese con sus datos específicos y el fármaco de su interés, y compararemos la información que proporcione con los artículos de nuestra extensa base de datos y le enviaremos una copia en PDF por correo electrónico de inmediato.
Los gránulos Ban-Lan-Gen atenúan la colitis crónica recurrente inducida por sulfato sódico de dextrano en ratones mediante la modulación de la microbiota intestinal y la restauración de la producción intestinal de GLP-1 derivado de ácidos grasos de cadena corta.
Jiao Peng,1-3,*Li Xi,4,*Zheng Lin,3,5 Duan Lifang,1 Gao Zhengxian,2,5 Diehu,1 Li Jie,6 Li Xiaofeng,6 Shen Xiangchun,5 Xiao Haitao21Departamento de Farmacia del Hospital de Shenzhen de la Universidad de Pekín, Shenzhen, República Popular China; 2Escuela de Farmacia del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Shenzhen, Shenzhen, República Popular China; 3Centro de Investigación de Tecnología de Ingeniería de la Universidad Médica de Guizhou para el Desarrollo y Aplicación de la Medicina Étnica y la Medicina Tradicional China del Ministerio de Educación, Laboratorio Clave Provincial de Farmacia de Guizhou, Universidad Médica de Guizhou, Guiyang, República Popular China; 4Departamento de Gastroenterología, Hospital de Shenzhen de la Universidad de Pekín, Shenzhen, República Popular China; 5Escuela de Farmacia, Universidad Médica de Guizhou, Laboratorio Estatal Clave de Función y Aplicación de Plantas Medicinales, Guiyang; 6 Departamento de Medicina de Laboratorio, Hospital Universitario de Pekín en Shenzhen, Shenzhen, China [email protected] Shen Xiangchun, Facultad de Farmacia, Universidad Médica de Guizhou, Guizhou, República Popular China, 550004, Correo electrónico [email protected] Objetivo: La terapia basada en GLP-1 es una nueva opción de tratamiento para la enfermedad inflamatoria intestinal. Los gránulos de Ban-Lan-Gen (BLG) son una formulación antiviral conocida de la medicina tradicional china que exhibe una actividad antiinflamatoria potencial en el tratamiento de diversas afecciones inflamatorias. Sin embargo, su efecto antiinflamatorio sobre la colitis y su mecanismo de acción aún no están claros. MÉTODOS: Establecer colitis crónica recurrente inducida por sulfato sódico de dextrano (DSS) en ratones. Se realizaron índices de actividad de la enfermedad, marcadores histológicos de lesión y niveles de citocinas proinflamatorias para evaluar el efecto protector del BLG. Los efectos del BLG sobre la microbiota intestinal y el intestino se caracterizaron por los niveles séricos de GLP-1 y Gcg, GPR41 y GRP43 colónicos. expresión, composición de la microbiota intestinal, niveles de SCFA fecales y liberación de GLP-1 de células epiteliales colónicas primarias de ratón producción de GLP-1 derivada de SCFA. Resultados: el tratamiento con BLG redujo significativamente la pérdida de peso corporal, DAI, acortamiento del colon, daño del tejido colónico y niveles de citocinas proinflamatorias de TNF-α, IL-1β e IL-6 en el tejido colónico. Además, el tratamiento con BLG puede restaurar significativamente la expresión colónica de Gcg, GPR41 y GRP43 y los niveles séricos de GLP-1 en ratones con colitis, y al aumentar las bacterias productoras de SCFA como Akkermansia y Prevotellaceae_UCG-001, y reducir la abundancia de bacterias como Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas y Oscillibacter. Además, el tratamiento con BLG puede aumentar significativamente el nivel de SCFA en las heces de ratones con colitis. Al mismo tiempo, los experimentos in vitro también mostraron que el extracto fecal de ratones tratados con BLG puede estimular en gran medida la secreción de GLP-1 por las células epiteliales colónicas murinas primarias. Conclusiones: Estos hallazgos sugieren que BLG tiene un efecto anticolinérgico. BLG tiene el potencial de desarrollarse como terapia, al menos en parte modulando la microbiota intestinal y restaurando la producción intestinal de GLP-1 derivado de AGCC. Fármacos prometedores para la colitis crónica recurrente. Palabras clave: colitis, gránulos Ban-Lan-Gen, microbiota intestinal, ácidos grasos de cadena corta, GLP-1
La colitis ulcerosa (CU) es una enfermedad inflamatoria crónica del colon y el recto caracterizada por diarrea recurrente, dolor abdominal, pérdida de peso y heces mucopurulentas con sangre.¹ Recientemente, la prevalencia de la CU ha aumentado en países con baja incidencia previa, como China, debido a la creciente popularidad de los estilos de vida occidentales.² Este aumento plantea importantes problemas de salud pública y tiene graves implicaciones para la capacidad laboral y la calidad de vida de los pacientes. Cabe destacar que la patogenia de la CU sigue siendo en gran medida desconocida, pero se acepta generalmente que la genética, los factores ambientales, la microbiota intestinal y el sistema inmunitario contribuyen a su desarrollo.³ Aún hoy, no existe cura para la CU, y el objetivo del tratamiento es controlar clínicamente los síntomas, inducir y mantener la remisión, promover la curación de la mucosa y reducir las recurrencias. Los tratamientos clásicos incluyen aminosalicilatos, corticosteroides, inmunosupresores y fármacos biológicos. Sin embargo, estos fármacos no logran el efecto deseado debido a sus diversos efectos secundarios.⁴ Recientemente, numerosos estudios de casos han demostrado que los tratamientos tradicionales La medicina tradicional china (MTC) ha demostrado un gran potencial para ayudar a aliviar la colitis ulcerosa con baja toxicidad, lo que sugiere que el desarrollo de nuevas terapias de MTC es una estrategia de tratamiento prometedora para la colitis ulcerosa.5-7
Los gránulos de Banlangen (BLG) son una preparación de medicina tradicional china elaborada a partir del extracto acuoso de la raíz de Banlangen.8 Además de su eficacia antiviral, BLG exhibe una actividad antiinflamatoria potencial en el tratamiento de diversas afecciones inflamatorias.9,10 Además, se han aislado e identificado glucosinolatos (R,S-goitrina, progoitrina, epiprorubina y glucósido) de extractos acuosos de Radix isatidis y nucleósidos (hipoxantina, adenosina, uridina y guanosina) y alcaloides índigo como el índigo y la indirubina.11,12 Estudios previos han documentado bien que los compuestos adenosina, uridina e indirubina exhiben potentes efectos anticolitiasis en diferentes modelos animales de colitis.13-17 Sin embargo, no se han realizado estudios basados ​​en la evidencia para evaluar la eficacia de BLG en la colitis. En el presente estudio, investigamos el efecto protector de BLG sobre la colitis crónica recurrente inducida por sulfato sódico de dextrano (DSS) en Se utilizaron ratones C57BL/6 y se descubrió que la administración oral de BLG atenuaba significativamente la recidiva crónica del colon inducida por DSS en ratones. La inflamación y sus mecanismos reguladores están asociados con la modulación de la microbiota intestinal y la restauración de la producción del péptido similar al glucagón-1 (GLP-1) derivado del intestino.
Los gránulos de BLG (sin azúcar, aprobados por la NMPA Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Beijing, China; número de lote: 20110966) se compraron en farmacias. El DSS (peso molecular: 36.000–50.000 Dalton) se compró en MP Biologicals (Santa Ana, EE. UU.). La sulfasalazina (SASP) (pureza ≥ 98%), la hematoxilina y la eosina se compraron en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Los kits de ensayo Elisa Luminex de TNF-α, IL-1β e IL-6 de ratón se compraron en R&D Systems (Minneapolis, MN, EE. UU.). El ácido acético, el ácido propiónico y el ácido butírico se compraron en Aladdin Industries (Shanghái, China). El ácido 2-etilbutírico se compró en Merck KGaA (Darmstadt, Alemania).
Se adquirieron ratones macho C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad (peso corporal 18-22 g) de Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Beijing, China) y se alojaron en un ambiente de 22 ± 2 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Los ratones fueron alimentados con una dieta estándar para roedores con libre acceso a agua potable durante una semana para aclimatarse al nuevo entorno. Luego, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos: grupo control, grupo modelo DSS, grupo tratado con SASP (200 mg/kg, oral) y grupo tratado con BLG (1 g/kg, oral). Como se muestra en la Figura 1A, de acuerdo con nuestro estudio previo, se indujo colitis crónica recidivante experimental en ratones mediante tres ciclos de DSS al 1,8 % durante 5 días, seguidos de agua destilada durante 7 días, de acuerdo con nuestro estudio previo.18 Los ratones de los grupos tratados con SASP y BLG fueron tratados con SASP y BLG, respectivamente, todos los días a partir del día 0.Según experimentos preliminares, la dosis de BLG se estableció en 1 g/kg. Mientras tanto, la dosis de SASP se estableció en 200 mg/kg según la literatura.4 Los grupos de control y del modelo DSS recibieron el mismo volumen de agua durante todo el experimento.
Figura 1 BLG mejora la colitis recurrente crónica inducida por DSS en ratones. (A) Diseño experimental de la colitis recurrente crónica y tratamiento, (B) cambio de peso corporal, (C) puntuación del índice de actividad de la enfermedad (DAI), (D) longitud del colon, (E) imagen representativa del colon, (F) tinción de H&E del colon (aumento, ×100) y (G) puntuación histológica. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 6). ##p < 0,01 o ###p < 0,001 frente al grupo control (Con); *p < 0,05 o **p < 0,01 o ***p < 0,001 frente al grupo DSS.
El peso corporal, la consistencia de las heces y el sangrado rectal se registraron diariamente. El índice de actividad de la enfermedad (DAI) se determinó combinando las puntuaciones del peso corporal, la consistencia de las heces y el sangrado rectal como se describió anteriormente.19 Al final del experimento, todos los ratones fueron sacrificados y se recolectaron sangre, heces y colon para experimentos posteriores.
El tejido de colon se fijó con formalina y se incluyó en parafina. Se realizaron cortes de 5 micras y se tiñeron con hematoxilina-eosina (H&E), luego se analizaron a ciegas y se evaluaron como se describió previamente.19
El ARN total del tejido del colon se extrajo con el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), seguido de la extracción de ADNc con transcriptasa inversa (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Japón). La PCR cuantitativa se realizó utilizando un sistema de PCR en tiempo real con SYBR Green Master (Roche, Basilea, Suiza). Los transcritos del gen objetivo se normalizaron con β-actina y los datos se analizaron utilizando el método 2-ΔΔCT. Las secuencias de los cebadores del gen se muestran en la Tabla 1.
El aislamiento y cultivo de células epiteliales colónicas primarias de ratón se realizó como se describió previamente.20 Brevemente, los colonos de ratones de 6 a 8 semanas de edad se extirparon primero después del sacrificio por dislocación cervical, luego se abrieron longitudinalmente, se trataron con solución salina balanceada de Hanks (HBSS, sin calcio ni magnesio) y se cortaron en pequeños trozos de 0,5 a 1 mm. Posteriormente, los tejidos se digirieron con 0,4 mg/ml de colagenasa XI (Sigma, Poole, Reino Unido) en medio DMEM libre y se centrifugaron a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente. El precipitado se resuspendió en medio DMEM (suplementado con 10 % de suero fetal bovino, 100 unidades/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina) a 37 °C y se pasó a través de una malla de nailon (tamaño de poro ~250 µm). Se colocaron alícuotas de células epiteliales colónicas en placas con fondo de vidrio y se incubaron con Ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico y extractos fecales de ratón durante 2 horas a 37 °C y 5 % de CO2.
El tejido del colon se homogeneizó con PBS y se detectaron los niveles de las citocinas IL-6, TNF-α e IL-1β en el tejido del colon utilizando kits de ensayo ELISA Luminex (R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.). Asimismo, los niveles de GLP-1 en el suero y el medio de cultivo de células epiteliales colónicas murinas primarias se determinaron con un kit ELISA (Bioswamp, Wuhan, China) siguiendo las instrucciones del fabricante.
El ADN total de las heces se extrajo utilizando un kit de extracción de ADN (Tiangen, China). La calidad y cantidad de ADN se midieron en las proporciones de 260 nm/280 nm y 260 nm/230 nm, respectivamente. Posteriormente, utilizando cada ADN extraído como plantilla, se utilizaron los cebadores específicos 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) y 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) para amplificar las regiones V3-V4 del gen del ARNr 16S en diferentes regiones. Los productos de PCR se purificaron utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (QIAGEN, Alemania), se cuantificaron mediante PCR en tiempo real y se secuenciaron utilizando la plataforma de secuenciación IlluminaMiseq PE300 (Illumina Inc., CA, EE. UU.). Para el análisis bioinformático, el procesamiento de datos se realizó siguiendo protocolos previamente informados.21,22 En resumen, utilice Cutadapt (V1.9.1) para filtrar los archivos de expresión sin procesar. Las OTU se agruparon utilizando Se utilizó UPARSE (versión 7.0.1001) con un umbral de similitud del 97%, y UCHIME para eliminar secuencias quiméricas. El análisis y la clasificación de la composición de la comunidad se realizaron utilizando el clasificador RDP (http://rdp.cme.msu.edu/) basado en la base de datos de genes de ARN ribosómico SILVA.
Los niveles de ácidos grasos de cadena corta (ácido acético, ácido propiónico y ácido butírico) se midieron como se describió previamente por Tao et al., con algunas modificaciones.23 Brevemente, 100 mg de heces se suspendieron primero en 0,4 ml de agua desionizada, seguidos de 0,1 ml de ácido sulfúrico al 50 % y 0,5 ml de ácido 2-etilbutírico (estándar interno), luego se homogeneizaron y se calentaron a 4 °C. Centrifugar a 12.000 rpm durante 15 minutos a C. El sobrenadante se extrajo con 0,5 mL de éter y se inyectó en el GC para su análisis. Para el análisis por cromatografía de gases (GC), las muestras se analizaron utilizando un cromatógrafo de gases GC-2010 Plus (Shimadzu, Inc.) equipado con un detector de ionización de llama (FID). La separación se logró utilizando una columna ZKAT-624, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., China). Los datos se adquirieron utilizando el software GC solution (Shimadzu, Inc.). La relación de división fue 10:1, el gas portador fue nitrógeno y el caudal fue de 6 mL/min. El volumen de inyección fue de 1 μL. La temperatura del inyector y del detector fue de 300 °C. La temperatura del horno se mantuvo a 140 °C durante 13,5 minutos y luego se aumentó a 250 °C a una velocidad de 120 °C/min; la temperatura se mantuvo durante 5 minutos.
Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). La significación de los datos se evaluó mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de rangos múltiples de Duncan. Se utilizó el software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE. UU.) para todos los cálculos y se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05.
Es bien sabido que la CU es una enfermedad crónica recurrente con dolor abdominal intenso, diarrea y sangrado. Por lo tanto, se estableció un modelo de colitis crónica recurrente inducida por DSS en ratones para evaluar la eficacia anticolitiasis de BLG (Fig. 1A). En comparación con el grupo control, los ratones del grupo modelo DSS presentaron un peso corporal significativamente reducido y un DAI más alto, y estos cambios se revirtieron significativamente después de 24 días de tratamiento con BLG (Figura 1B y C). El acortamiento del colon es una característica importante de la CU. Como se muestra en las Figuras 1D y E, la longitud del colon de los ratones que recibieron DSS se acortó significativamente, pero se alivió con el tratamiento con BLG. Posteriormente, se realizó un análisis histopatológico para evaluar la inflamación colónica. Las imágenes teñidas con H&E y las puntuaciones patológicas mostraron que la administración de DSS alteró significativamente la arquitectura colónica y provocó la destrucción de las criptas, mientras que el tratamiento con BLG redujo significativamente la destrucción de las criptas y las puntuaciones patológicas (Figura 1F y G). Cabe destacar que el efecto protector de BLG a una dosis de 1 g/Kg fue comparable al de SASP a una dosis de 200 mg/Kg. En conjunto, estos hallazgos sugieren que BLG es eficaz para reducir la gravedad de la colitis recurrente crónica inducida por DSS en ratones.
TNF-α, IL-1β e IL-6 son marcadores inflamatorios importantes de la inflamación colónica. Como se muestra en la Figura 2A, DSS indujo un aumento significativo en la expresión génica de TNF-α, IL-1β e IL-6 en el colon en comparación con el grupo de control. La administración de BLG puede revertir significativamente estos cambios mediados por DSS. A continuación, utilizamos ELISA para determinar los niveles de las citocinas inflamatorias TNF-α, IL-1β e IL-6 en el tejido del colon. Los resultados también mostraron que los niveles colónicos de TNF-α, IL-1β e IL-6 aumentaron significativamente en ratones tratados con DSS, mientras que el tratamiento con BLG alivió estos aumentos (Figura 2B).
Figura 2 BLG inhibe la expresión génica y la producción de las citocinas proinflamatorias TNF-α, IL-1β e IL-6 en el colon de ratones tratados con DSS. (A) Expresión génica colónica de TNF-α, IL-1β e IL-6; (B) niveles de proteína colónica de TNF-α, IL-1β e IL-6. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 4–6). #p < 0,05 o ##p < 0,01 o ###p < 0,001 frente al grupo control (Con); *p < 0,05 o **p < 0,01 frente al grupo DSS.
La disbiosis intestinal es crítica en la patogénesis de la UC.24 Para investigar si BLG modula la microbiota intestinal de ratones tratados con DSS, se realizó una secuenciación de ARNr 16S para analizar la comunidad bacteriana del contenido intestinal. El diagrama de Venn muestra que los tres grupos comparten 385 OTU. Al mismo tiempo, cada grupo tenía OTU únicas (Fig. 3A). Además, el índice Chao1 y el índice Shannon mostrados en la Figura 3B y C mostraron que la diversidad de la comunidad de la microbiota intestinal se redujo en los ratones tratados con BLG, ya que el índice Shannon disminuyó significativamente en el grupo tratado con BLG. El análisis de componentes principales (PCA) y el análisis de coordenadas principales (PCoA) se utilizaron para determinar los patrones de agrupamiento entre los tres grupos y mostraron que la estructura de la comunidad de los ratones tratados con DSS se separó claramente después del tratamiento con BLG (Figura 3D y E). Estos datos sugieren que el tratamiento con BLG afectó significativamente la estructura de la comunidad de ratones con colitis inducida por DSS.
Figura 3 BLG altera la diversidad de la microbiota intestinal en ratones con colitis inducida por DSS. (A) Diagrama de Venn de OTU, (B) Índice Chao1, (C) Índice de riqueza de Shannon, (D) Gráfico de puntuación del análisis de componentes principales (PCA) de OTU, (E) Puntuación del análisis de coordenadas principales (PCoA) de OTU. Figura. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 6). **p < 0,01 frente al grupo DSS.
Para evaluar cambios específicos en la microbiota fecal, analizamos la composición de la microbiota intestinal en todos los niveles taxonómicos. Como se muestra en la Figura 4A, los principales filos en todos los grupos fueron Firmicutes y Bacteroidetes, seguidos de Verrucomicrobia. Las abundancias relativas de Firmicutes y las proporciones Firmicutes/Bacteroidetes aumentaron significativamente en las comunidades microbianas fecales de ratones tratados con DSS en comparación con los ratones de control, y estos cambios se revirtieron significativamente después del tratamiento con BLG. En particular, el tratamiento con BLG aumentó significativamente la abundancia relativa de Verrucobacterium en las heces de ratones con colitis inducida por DSS. A nivel doméstico, las comunidades microbianas fecales estaban ocupadas por Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae y Prevotellaceae (Fig. 4B). En comparación con el grupo DSS, el agotamiento de BLG aumentó la abundancia de Akkermansiaceae, pero disminuyó la abundancia de Lachnospiraceae y Ruminococcaceae. Cabe destacar que, a nivel de género, la microbiota fecal estaba ocupada por Lachnospira_NK4A136_group, Akkermansia y Prevotellaceae_UCG-001 (Fig. 4C). Este hallazgo también demostró que el tratamiento con BLG revirtió eficazmente el desequilibrio de la microbiota en respuesta al desafío con DSS, caracterizado por una disminución en Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas y Oscillibacter, y un aumento en Akkermansia y Prevotellaceae_UCG-001.
Figura 4 BLG altera la abundancia de la microbiota intestinal en ratones con colitis inducida por DSS. (A) Abundancia de la microbiota intestinal a nivel de filo; (B) Abundancia de la microbiota intestinal a nivel de familia; (C) Abundancia de la microbiota intestinal a nivel de género. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 6). #p < 0,05 o ###p < 0,001 frente al grupo control (Con); *p < 0,05 o **p < 0,01 o ***p < 0,001 frente al grupo DSS.
Considerando que los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) son los principales metabolitos de Akkermansia y Prevotellaceae_UCG-001, mientras que el acetato, el propionato y el butirato son los AGCC más abundantes en la luz intestinal, 25-27 seguimos en nuestro estudio. Como se muestra en la Figura 5, las concentraciones fecales de acetato, propionato y butirato se redujeron significativamente en el grupo tratado con DSS, mientras que el tratamiento con BLG pudo suprimir en gran medida esta reducción.
Figura 5. BLG aumenta los niveles de AGCC en las heces de ratones con colitis inducida por DSS. (A) Contenido de ácido acético en las heces; (B) contenido de ácido propiónico en las heces; (C) contenido de ácido butírico en las heces. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 6). #p < 0,05 o ##p < 0,01 frente al grupo control (Con); *p < 0,05 o **p < 0,01 frente al grupo DSS.
Además, calculamos el coeficiente de correlación de Pearson entre los AGCC diferenciales a nivel de género y la microbiota fecal. Como se muestra en la Figura 6, Akkermansia se correlacionó positivamente con la producción de ácido propiónico (Pearson = 0,4866) y ácido butírico (Pearson = 0,6192). Por el contrario, tanto Enteromonas como Oscillobacter se asociaron negativamente con la producción de acetato, con coeficientes de Pearson de 0,4709 y 0,5104, respectivamente. Asimismo, Ruminococcaceae_UCG-014 se correlacionó negativamente con la producción de ácido propiónico (Pearson = 0,4508) y ácido butírico (Pearson = 0,5842), respectivamente.
Figura 6 Análisis de correlación de Pearson entre AGCC diferenciales y microbios colónicos. (A) Enteromonas con ácido acético; (B) Bacilo de la conmoción con ácido acético; (C) Akkermansia vs ácido propiónico; (D) Ruminococcus_UCG-014 con ácido propiónico; (E) Akkermansia con ácido butírico; (F) Ruminococcus_UCG-014 con ácido butírico.
El péptido similar al glucagón-1 (GLP-1) es un producto postraduccional específico del tipo celular del proglucagón (Gcg) con propiedades antiinflamatorias.28 Como se muestra en la Figura 7, el DSS indujo una disminución significativa en la expresión de ARNm de Gcg. El tratamiento con colon y BLG pudo revertir significativamente la reducción de Gcg inducida por DSS en comparación con el grupo control (Fig. 7A). Al mismo tiempo, el nivel de GLP-1 en suero se redujo significativamente en el grupo tratado con DSS, y el tratamiento con BLG pudo prevenir en gran medida esta reducción (Fig. 7B). Dado que los ácidos grasos de cadena corta pueden estimular la secreción de GLP-1 a través de la activación del receptor acoplado a proteína G 43 (GRP43) y del receptor acoplado a proteína G 41 (GRP41), también examinamos GPR41 y GRP43 en el colon de ratones con colitis y encontramos que la expresión de ARNm colónico de GRP43 y GPR41 disminuyó significativamente después del desafío con DSS y el tratamiento con BLG. podría revertir eficazmente estas disminuciones (Figura 7C y D).
Figura 7 BLG aumenta los niveles séricos de GLP-1 y la expresión de ARNm de Gcg, GPR41 y GRP43 en el colon de ratones tratados con DSS. (A) Expresión de ARNm de Gcg en el tejido del colon; (B) Nivel de GLP-1 en suero; (C) Expresión de ARNm de GPR41 en el tejido del colon; (D) Expresión de ARNm de GPR43 en el tejido del colon. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 5–6). #p < 0,05 o ##p < 0,01 frente al grupo control (Con); *p < 0,05 frente al grupo DSS.
Dado que el tratamiento con BLG podría aumentar los niveles séricos de GLP-1, la expresión de ARNm de Gcg colónico y los niveles de AGCC fecales en ratones tratados con DSS, examinamos además el acetato, el propionato y el butirato, así como de ratones control (F-Con), con colitis por DSS (F-Con-DSS) y con colitis tratada con BLG (F-BLG) sobre la liberación de GLP-1 de células epiteliales colónicas murinas primarias. Como se muestra en la Figura 8A, las células epiteliales colónicas murinas primarias tratadas con 2 mM de ácido acético, ácido propiónico y ácido butírico, respectivamente, estimularon significativamente la liberación de GLP-1, en consonancia con estudios previos.29,30 Asimismo, todos los F-Con, F-DSS y F-BLG (equivalente a 0,25 g de heces) estimularon en gran medida la liberación de GLP-1 de células epiteliales colónicas murinas primarias. Cabe destacar que la cantidad de GLP-1 liberada por las células epiteliales colónicas murinas primarias tratadas con F-DSS fue mucho menor que la de las células epiteliales colónicas primarias de ratón tratadas con F-Con y F-BLG (Figura 8B). Estos datos sugieren que el tratamiento con BLG restauró significativamente la producción intestinal de GLP-1 derivada de SCFA.
Figura 8 Los SCFA derivados de BLG estimulan la liberación de GLP-1 de células epiteliales colónicas murinas primarias. (A) El ácido acético, el ácido propiónico y el ácido butírico estimularon la liberación de GLP-1 de células epiteliales colónicas murinas primarias; (B) los extractos fecales F-Con, F-DSS y F-BLG estimularon las células epiteliales colónicas murinas primarias. Cantidad de GLP-1 liberado. Se colocaron alícuotas de células epiteliales colónicas en placas de Petri con fondo de vidrio y se trataron con 2 mM de ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico y extractos fecales F-Con, F-DSS y F-BLG (equivalente a 0,25 g de heces), respectivamente. 2 horas a 37 °C, 5 % de CO2, respectivamente. La cantidad de GLP-1 liberada de células epiteliales colónicas murinas primarias se detectó mediante ELISA. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 3). #p < 0,05 o ##p < 0,01 frente a blanco o F-Con; *p < 0,05 frente a F-DSS.
Abreviaturas: Ace, ácido acético; Pro, ácido propiónico; sin embargo, ácido butírico; F-Con, extracto fecal de ratones control; F-DSS, extracto fecal de ratones con colitis; F-BLG, de colon tratado con BLG. Extractos fecales de ratones inflamatorios.
La colitis ulcerosa, catalogada por la Organización Mundial de la Salud como una enfermedad refractaria, se está convirtiendo en un peligro mundial; Sin embargo, los métodos eficaces para predecir, prevenir y tratar la enfermedad aún son limitados. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de explorar y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas seguras y eficaces para la CU. Las preparaciones de medicina tradicional china son una opción prometedora porque muchas de ellas han demostrado ser eficaces en el tratamiento de la CU en la población china a lo largo de los siglos, y todas son orgánicas biológicas y materiales naturales que en su mayoría son inofensivos para los humanos y los animales.31,32 Este estudio tuvo como objetivo buscar una preparación de medicina tradicional china segura y eficaz para el tratamiento de la CU y explorar su mecanismo de acción. BLG es una fórmula herbal china bien conocida que se utiliza para tratar la gripe.8,33 El trabajo realizado en nuestro laboratorio y en otros ha demostrado que el índigo, un producto de medicina tradicional china procesado a partir de la misma materia prima que BLG, exhibe una eficacia significativa en el tratamiento de la CU en humanos y animales.4,34 Sin embargo, los efectos anticolinérgicos de BLG y su mecanismo de acción no están claros. En el presente estudio, nuestros resultados demuestran que BLG atenúa eficazmente la inflamación colónica inducida por DSS, que está asociada con Modulación de la microbiota intestinal y restauración de la producción de GLP-1 de origen intestinal.
Es bien sabido que la UC se caracteriza por períodos de recaída con características clínicas típicas, como pérdida de peso, diarrea, sangrado rectal y daño extenso de la mucosa colónica.35 Por lo tanto, la colitis crónica recurrente se administró mediante la administración de tres ciclos de DSS al 1,8% durante cinco días, seguidos de siete días de agua potable. Como se muestra en la Figura 1B, la pérdida de peso fluctuante y las puntuaciones DAI indicaron una inducción exitosa de la colitis crónica recurrente. Los ratones del grupo tratado con BLG mostraron una recuperación ascendente a partir del día 8, que fue significativamente diferente del día 24. Los mismos cambios también se observaron en la puntuación DAI, lo que sugiere una mejora en la mejora clínica de la colitis. En términos de lesión del colon y estado inflamatorio, la longitud del colon, el daño del tejido del colon y la expresión génica y la producción de las citocinas proinflamatorias TNF-α, IL-1β e IL-6 en el tejido del colon también mejoraron en gran medida después del tratamiento con BLG. En conjunto, estos resultados demuestran claramente que BLG es eficaz en el tratamiento de la colitis crónica recurrente en ratones.
¿Cómo ejerce BLG sus efectos farmacológicos? Numerosos estudios previos han demostrado que la microbiota intestinal juega un papel clave en la patogénesis de la UC, y las terapias basadas en el microbioma y dirigidas al microbioma han surgido como una estrategia muy atractiva para el tratamiento de la UC. En el presente estudio, demostramos que el tratamiento con BLG produjo cambios significativos en la composición de la microbiota intestinal, lo que sugiere que el efecto protector de BLG contra la colitis inducida por DSS está relacionado con la modulación de la microbiota intestinal. Esta observación es consistente con la noción de que reprogramar la homeostasis de la microbiota intestinal es un enfoque importante para comprender la eficacia de las preparaciones de la MTC.36,37 Cabe destacar que Akkermansia es una bacteria Gram negativa y estrictamente anaeróbica que vive en la capa de moco del intestino, que degrada las mucinas, produce ácido propiónico, estimula la diferenciación de las células caliciformes y mantiene la mucosa. función de integridad de barrera.26 Múltiples datos clínicos y en animales sugieren que Akkermansia está altamente asociada con mucosa sana,38 y la administración oral de Akkermansia spp. puede mejorar significativamente la inflamación de la mucosa.39 Nuestros datos actuales sugieren que la abundancia relativa de Akkermansia aumenta significativamente después del tratamiento con BLG. Además, Prevotellaceae_UCG-001 es una bacteria productora de AGCC.27 Múltiples estudios mostraron que Prevotellaceae_UCG-001 se encontró en baja abundancia relativa en las heces de animales con colitis.40,41 Nuestros datos actuales también muestran que el tratamiento con BLG puede aumentar significativamente la abundancia relativa de Prevotellaceae_UCG-001 en el colon de ratones tratados con DSS. En contraste, Oscillibacter es una bacteria mesófila, estrictamente anaeróbica.42 informaron que la abundancia relativa de Oscillibacter aumentó significativamente en ratones con UC y se correlacionó significativamente de forma positiva con los niveles de IL-6 e IL-1β y las puntuaciones patológicas.43,44 Cabe destacar que el tratamiento con BLG redujo significativamente la abundancia relativa de Oscillibacter en las heces de ratones tratados con DSS. Cabe destacar que estas bacterias alteradas por BLG fueron Las bacterias que producen más AGCC. Numerosos estudios previos han demostrado los posibles efectos beneficiosos de los AGCC sobre la inflamación colónica y la protección de la integridad del epitelio intestinal.45,46 Nuestros datos actuales también observaron que las concentraciones de acetato, propionato y butirato de AGCC en las heces tratadas con DSS aumentaron considerablemente en los ratones tratados con BLG. En conjunto, estos hallazgos demuestran claramente que el tratamiento con BLG puede mejorar eficazmente las bacterias productoras de AGCC inducidas por DSS en ratones con colitis crónica recurrente.
GLP-1 es una incretina producida principalmente en el íleon y el colon y juega un papel importante en el retraso del vaciamiento gástrico y la reducción de la glucosa en sangre posprandial.47 La evidencia sugiere que la dipeptidil peptidasa (DPP)-4, un agonista del receptor de GLP-1 y una nanomedicina de GLP-1 pueden aliviar eficazmente la inflamación intestinal en ratones.48-51 Como se informó en estudios previos, las altas concentraciones de SCFA se asociaron con los niveles plasmáticos de GLP-1 en humanos y ratones. 52 Nuestros datos actuales muestran que después del tratamiento con BLG, los niveles séricos de GLP-1 y la expresión de ARNm de Gcg aumentaron significativamente. Asimismo, la secreción de GLP-1 aumentó significativamente en cultivos colónicos después de la estimulación con extractos fecales de ratones con colitis tratados con BLG en comparación con la estimulación con extractos fecales de ratones con colitis tratados con DSS. ¿Cómo afectan los SCFA a la liberación de GLP-1? Gwen Tolhurst et al. Se ha informado que los AGCC pueden estimular la secreción de GLP-1 a través de GRP43 y GPR41.29 Nuestros datos actuales también muestran que el tratamiento con BLG aumenta significativamente la expresión de ARNm de GRP43 y GPR41 en el colon de ratones tratados con DSS. Estos datos sugieren que el tratamiento con BLG puede restaurar la producción de GLP-1 promovida por los AGCC mediante la activación de GRP43 y GPR41.
BLG es un medicamento de venta libre (OTC) de uso prolongado en China. La dosis máxima tolerada de BLG en ratones Kunming es de 80 g/kg, y no se ha observado toxicidad aguda.53 Actualmente, la dosis recomendada de BLG (sin azúcar) en humanos es de 9-15 g/día (3 veces al día). Nuestro estudio mostró que BLG a 1 g/kg mejoró la colitis recurrente crónica inducida por DSS en ratones. Esta dosis es cercana a la dosis de BLG utilizada clínicamente. Nuestro estudio también encontró que su mecanismo de acción está mediado, al menos en parte, por alteraciones en la microbiota intestinal, específicamente bacterias productoras de SCFA, como Akkermansia y Prevotellaceae_UCG-001, para restaurar la producción de GLP-1 derivada del intestino. Estos hallazgos sugieren que BLG merece una mayor consideración como un agente terapéutico potencial para el tratamiento clínico de la colitis. Sin embargo, el mecanismo exacto por el cual modula la microbiota intestinal aún debe confirmarse mediante ratones deficientes en microbiota y trasplante bacteriano fecal.
Ace, ácido acético; but, ácido butírico; BLG, pandano; DSS, sulfato sódico de dextrano; DAI, índice de actividad de la enfermedad; DPP, dipeptidil peptidasa; FID, detector de ionización de llama; F-Con, control Extractos fecales de ratones; F-DSS, extractos fecales de ratones con colitis por DSS; F-BLG, extractos fecales de ratones con colitis tratados con BLG; GLP-1, péptido similar al glucagón-1; Gcg, glucagón; cromatografía de gases, cromatografía de gases; GRP43, receptor acoplado a proteína G 43; GRP41, receptor acoplado a proteína G 41; H&E, hematoxilina-eosina; HBSS, solución salina balanceada de Hanks; OTC, OTC; PCA, análisis de componentes principales; PCoA, análisis de coordenadas principales; Pro, ácido propiónico; SASP, sulfasalazina; SCFA, ácidos grasos de cadena corta; Medicina china, medicina tradicional china; CU, colitis ulcerosa.
Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Centro Médico de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Shenzhen-Hong Kong de la Universidad de Pekín (Shenzhen, China) de acuerdo con las Directrices Institucionales y el Reglamento sobre Animales (número de ética A2020157).
Todos los autores realizaron contribuciones significativas a la concepción y el diseño, la adquisición de datos o el análisis e interpretación de datos; participaron en la redacción del artículo o en la revisión crítica de contenido intelectual importante; aceptaron enviar el manuscrito a la revista actual; aprobaron finalmente la versión para su publicación; y son responsables de todos los aspectos del trabajo.
Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81560676 y 81660479), el proyecto de primera clase de la Universidad de Shenzhen (86000000210), el Fondo del Comité de Innovación Científica y Tecnológica de Shenzhen (JCYJ20210324093810026), el Fondo Provincial de Investigación en Ciencia y Tecnología Médica de Guangdong (A2020157 y A2020272), el Laboratorio Clave Financiado por la Farmacia de la Universidad Médica de Guizhou de la Provincia de Guizhou (YWZJ2020-01) y el Hospital de Shenzhen de la Universidad de Pekín (JCYJ2018009).
1. Tang B, Zhu J, Zhang B, et al. Potencial terapéutico del triptólido como agente antiinflamatorio en la colitis experimental inducida por sulfato sódico de dextrano en ratones. pre-immune. 2020;11:592084. doi: 10.3389/fimmu.2020.592084
2. Kaplan GG. La carga global de la EII: de 2015 a 2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2015;12:720–727. doi: 10.1038/nrgastro.2015.150
3. Peng J, Zheng TT, Li Xue, et al. Alcaloides derivados de plantas: prometedores modificadores de la enfermedad en la enfermedad inflamatoria intestinal. Prepharmacology. 2019;10:351. doi:10.3389/fphar.2019.00351
4. Xiao Haiteng, Peng Jie, Wen B, et al. Indigo Naturalis inhibe el estrés oxidativo colónico y las respuestas Th1/Th17 en la colitis inducida por DSS en ratones. Oxid Med Cell Longev. 2019;2019:9480945. doi: 10.1155/2019/9480945
5. Chen M, Ding Y, Tong Z. Eficacia y seguridad de la medicina herbal china Sophora flavescens (Sophora flavescens) en el tratamiento de la colitis ulcerosa: evidencia clínica y mecanismos potenciales. Prepharmacology. 2020;11:603476. doi:10.3389/fphar.2020.603476
6. Cao Fang, Liu Jie, Sha Benxing, Pan HF. Productos naturales: fármacos experimentalmente eficaces para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal. Curr Pharmaceuticals. 2019;25:4893–4913. doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. Zhang C, Jiang M, Lu A. Reflexiones sobre el tratamiento adyuvante de la colitis ulcerosa con medicina tradicional china. Clinical Rev Allergy Immunization. 2013;44:274–283. doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. Li Zhongteng, Li Li, Chen TT, et al. Eficacia y seguridad de los gránulos de Banlangen en el tratamiento de la gripe estacional: protocolo de estudio para un ensayo controlado aleatorizado. trial.2015;16:126. doi: 10.1186/s13063-015-0645-x