La clasificación de proteínas en la vía secretora es esencial para mantener la compartimentación y la homeostasis celular. Además de la clasificación mediada por la capa, el papel de los lípidos en la clasificación de la kinesina en el proceso de transporte secretor es una pregunta básica de larga data que aún no ha sido respondida. Aquí, realizamos imágenes 3D multicolor simultáneas de alta resolución en tiempo real para demostrar in vivo que las proteínas recién sintetizadas inmovilizadas en glicosilfosfatidilinositol con fracciones lipídicas de ceramida muy largas se agrupan y clasifican en un sitio de salida neto de endoplasma especializado, que es diferente del utilizado por las proteínas transmembrana. Además, demostramos que la longitud de la cadena de ceramida en la membrana del retículo endoplasmático es crítica para esta selectividad de clasificación. Nuestro estudio proporciona la primera evidencia directa in vivo para clasificar las cargas de proteínas basadas en la longitud de la cadena lipídica en sitios de exportación selectivos en la vía secretora.
En las células eucariotas, las proteínas sintetizadas en el retículo endoplasmático (RE) se clasifican durante el transporte a través de la vía secretora para su entrega a su destino celular apropiado (1). Además de la clasificación mediada por la cubierta, se especuló durante mucho tiempo que ciertos lípidos también pueden servir como puntos de salida selectivos al agruparlos en dominios de membrana específicos que proteínas específicas (2-5). Sin embargo, todavía hay una falta de evidencia directa in vivo para probar este posible mecanismo basado en lípidos. Para resolver este problema básico, estudiamos en levadura cómo las proteínas ancladas a glicosilfosfatidilinositol (GPI) (GPI-AP) se exportan diferencialmente desde el RE. Las GPI-AP son una variedad de proteínas de la superficie celular conectadas a lípidos (6, 7). GPI-AP es una proteína secretada unida a las láminas externas de la membrana plasmática a través de la fracción glucolipídica (anclaje GPI). Aceptan anclajes GPI como modificaciones postraduccionales conservadoras en el lumen del RE (8). Tras su fijación, la GPI-AP atraviesa el aparato de Golgi (5, 9) desde el RE hasta la membrana plasmática. La presencia de anclajes de GPI hace que la GPI-AP se transporte por separado de las proteínas secretadas transmembrana (incluidas otras proteínas de la membrana plasmática) a lo largo de la vía secretora (5, 9, 10). En las células de levadura, las GPI-AP se separan de otras proteínas secretadas en el retículo endoplasmático y luego se empaquetan en vesículas únicas envueltas por el complejo de proteína de cubierta II (COPII) (6, 7). Los determinantes de este proceso de clasificación en el proceso de exportación del RE no están claros, pero se especula que este mecanismo puede requerir lípidos, especialmente la remodelación estructural de la porción lipídica del anclaje de GPI (5, 8). En la levadura, la remodelación lipídica de la GPI comienza inmediatamente después de su fijación y, en muchos casos, provoca que la ceramida se una al ácido graso saturado de cadena larga de 26 carbonos (C26:0) (11, 12). La ceramida C26 es la principal ceramida producida por las células de levadura hasta la fecha. Se sintetiza en el RE y la mayor parte se exporta al aparato de Golgi a través de vesículas COPII (13). La exportación de GPI-AP al RE requiere específicamente una síntesis continua de ceramida (14, 15) y, a su vez, la conversión de ceramida a ceramida de fosfato de inositol (IPC) en el aparato de Golgi depende de la síntesis de anclaje de GPI (16). Estudios biofísicos con membranas artificiales han demostrado que las ceramidas de cadena acilo muy larga pueden coalescer para formar dominios ordenados con propiedades físicas únicas (17, 18). Estos datos conducen a la hipótesis de que la ceramida C26 y el GPI-AP con ceramida C26 utilizan sus propiedades físicas para coalescer en regiones ordenadas o regiones en el entorno lipídico relativamente desordenado de la membrana del RE. Está compuesto principalmente de glicerolípidos cortos e insaturados (C16:1 y C18:1) (19, 20). Estas regiones se centrarán selectivamente en sitios de salida de ER específicos (ERES), donde la ceramida y el GPI-AP basado en ceramida pueden cotransportarse al Golgi en la misma vesícula COPII dedicada (5).
En este estudio, hemos probado directamente este mecanismo basado en lípidos mediante el uso de microscopía confocal de imágenes en tiempo real de súper resolución (SCLIM), que es una técnica de microscopía de vanguardia que puede observar simultáneamente proteínas marcadas con fluorescencia. Las imágenes tridimensionales (3D) y en tres colores tienen una resolución y velocidad extremadamente altas en células vivas (21, 22).
Primero aplicamos la tecnología SCLIM para definir con mayor precisión cómo se cribaba el GPI-AP normal con el grupo ceramida C26 a partir de proteínas secretadas transmembrana tras salir del RE en S. cerevisiae. Para comprobar la clasificación del RE, utilizamos un sistema genético que puede visualizar directamente la carga recién sintetizada que entra en el ERES in vivo (7, 23). Como carga, elegimos el GPI-AP basado en ceramida C26 Gas1 marcado con proteína verde fluorescente (GFP) y la proteína secretada transmembrana Mid2 marcada con proteína fluorescente infrarroja cercana (iRFP), ambas diana en la membrana plasmática (24-26). En el mutante sensible a la temperatura sec31-1, estas dos cargas se expresan bajo un promotor inducible por galactosa y un marcador ERES constitutivo. A la temperatura extrema (37 °C), debido a que la mutación sec31-1 afecta la función del componente de la cubierta COPII Sec31 para inhibir la germinación de COPII y la exportación al RE, la carga recién sintetizada se acumula en el RE (23). Tras enfriarse a baja temperatura (24 °C), las células mutantes sec31-1 se recuperaron del área secretora y la nueva carga sintética acumulada comenzó a exportarse desde el RE. La visualización CLIM mostró que la mayor parte de las nuevas sintetizadas Gas1-GFP y Mid2-iRFP seguían acumulándose en el RE de las células mutantes sec31-1 tras la incubación a 37 °C y su posterior liberación a 24 °C durante 5 minutos (Figura 1). Dado que Mid2-iRFP se distribuye por toda la membrana del RE, y Gas1-GFP se concentra y se reúne en la zona discontinua de la membrana del RE, su distribución es completamente diferente (Figura 1, A a C y Película S1). Además, como se muestra en la Figura 1D, el grupo Gas1-GFP no contiene Mid2-iRFP. Estos resultados indican que GPI-AP y las proteínas transmembrana se separaron precozmente en diferentes regiones de la membrana del RE. El grupo Gas1-GFP está adyacente a un ERES específico marcado con la proteína de cubierta COPII Sec13 de mCherry (Figura 1, E y F, y película S1) (23).
Las células sec31-1 expresan secreciones inducidas por galactosa, una ceramida de cadena acilo larga (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, verde) y la proteína transmembrana Mid2-iRFP (TMP, azul) y este marcaje ERES constructivo Sec13-mCherry (ERES, magenta) se incubó a 37 °C durante 30 minutos, se trasladó a 24 °C y se obtuvo una imagen mediante SCLIM 5 minutos después. (A a C) muestra una imagen 2D representativa fusionada o única de un plano (A), una imagen de proyección 2D de 10 secciones z (B) o una imagen 3D del hemisferio celular de los marcadores de carga y ERES (C). Barra de escala 1 μm (A y B). La unidad de escala es 0,551 μm (C). Gas1-GFP se detectó en regiones o grupos discretos del RE, mientras que Mid2-iRFP se detectó y distribuyó por toda la membrana del RE (C). (D) El gráfico muestra la intensidad relativa de fluorescencia de Gas1-GFP y Mid2-iRFP en el grupo Gas1-GFP a lo largo de la flecha blanca (izquierda). AU: unidad arbitraria. (E y F) representan la imagen 3D que combina las marcas de los productos y ERES. Se detectaron grupos Gas1-GFP cerca del ERES específico. La unidad de escala es 0,551 μm. (F) La flecha blanca continua marca el grupo Gas1-GFP asociado a ERES. Los paneles central y derecho muestran la imagen 3D ampliada fusionada y una vista rotada del grupo Gas1-GFP seleccionado.
La estrecha relación espacial entre el clúster Gas1-GFP y un ERES específico indica que Gas1-GFP puede entrar en ERES selectivos, lo cual es diferente de la selectividad utilizada por Mid2-iRFP para salir del ER. Para abordar esta posibilidad, cuantificamos la relación ERES para solo uno o dos bienes (Figura 2, A a C). Encontramos que la mayoría de los ERES (70%) contienen solo un tipo de carga. La imagen inferior de la Figura 2C muestra dos ejemplos típicos de ERES con solo Gas1-GFP (Figura 1) o solo Mid2-iRFP (Figura 2). Por el contrario, aproximadamente el 20% de los ERES contiene dos cargas que se superponen en la misma área. Se encontró que algunos ERES (10%) contenían dos tipos de carga, pero estaban aislados en áreas claramente diferentes. Por lo tanto, este análisis estadístico muestra que después de que se exporta el ER, GPI-AP Gas1-GFP y la carga transmembrana Mid2-iRFP se dividen en diferentes ERES (Figura 2D). Esta eficiencia de clasificación es muy consistente con el análisis bioquímico previo (6) y la determinación morfológica (7). También podemos observar el comportamiento de la carga en cuarentena que ingresa al ERES (Figura 2E y Película S2). La Figura 2E muestra que solo una pequeña porción de Gas1-GFP (panel 3) o Mid2-iRFP (panel 4) ingresa al ERES desde un lado y está confinada en un área discreta. El panel 5 de la Figura 2E muestra que Gas1-GFP y Mid2-iRFP a veces se encuentran en el mismo ERES, pero ingresan desde diferentes lados y se concentran en regiones separadas que pueden representar diferentes vesículas COPII. También confirmamos que la separación y clasificación observadas de GPI-AP basado en ceramida C26 Gas1 como ERES selectivo es específica porque otra carga de secreción transmembrana, la proteína de membrana plasmática marcada con GFP Axl2 (27), muestra un comportamiento similar a Mid2-iRFP. (Imagen S1 y Película S3). La Axl2-GFP recién sintetizada se distribuye a través de la membrana del RE al igual que Mid2-iRFP (Figuras S1, A y B) y se colocaliza con Mid2-iRFP en la mayoría de los ERES (Figuras S1, B a D). Los paneles 1 y 2 de la Figura 1. S1C muestran dos ejemplos típicos de ERES donde dos cargas transmembrana se superponen. En estos casos, ambas cargas entran juntas en el ERES (Figura S1E, Panel 3 y Película S3).
Las células sec31-1 que expresan secreciones inducibles por galactosa, Gas1-GFP (GPI-AP, verde) y Mid2-iRFP (TMP, azul) y el marcaje constitutivo ERES Sec13-mCherry (ERES, magenta) se colocaron a 37 Después de incubar durante 30 minutos a °C, mover a 24 °C para liberar el bloqueo de secreción y la imagen con SCLIM después de 20 minutos. (A a C) Imágenes representativas de proyección 2D (A; barra de escala, 1 μm) o imágenes 3D del hemisferio celular (B y C; unidad de escala, 0,456 μm) de la carga y 10 secciones z marcadas por ERES. El panel inferior en (B) y el panel en (C) muestran imágenes procesadas para mostrar solo los bienes presentes en ERES (magenta) [Gas1-GFP (gris) y Mid2-iRFP (azul claro)]. (C) Flecha abierta: ERES solo lleva una pieza de carga (1 a 4). Flecha gris: ERES contiene carga segregada (5). Flecha sólida blanca: ERES contiene carga co-ubicada. Abajo: El ERES único seleccionado contiene solo Gas1-GFP (1) o Mid2-iRFP (2). Barra de escala, 100 nm. (D) Cuantificación de la fotomicrografía descrita en (C). El porcentaje promedio de ERES que contiene solo una carga (Gas1-GFP o Mid2-iRFP), carga segregada y carga superpuesta. En tres experimentos independientes, n = 432 en 54 células. Barra de error = DE. Prueba t no pareada de dos colas. *** P = 0,0002. (E) Imagen 3D de ERES seleccionados de carga en cuarentena marcada con (C). Gas1-GFP (verde) (3) o Mid2-iRFP (azul) (4) ingresa a ERES (magenta) desde un lado y se restringe a un área pequeña dentro de ERES. A veces, ambos tipos de carga entran al mismo ERES (5) por el mismo lado y quedan confinados en una zona aislada dentro del ERES. Barra de escala, 100 nm.
A continuación, probamos una hipótesis de que la ceramida de cadena acilo larga (C26) presente en la membrana del RE impulsa el agrupamiento y la clasificación específicos de Gas1 en ERES selectivos. Para este fin, utilizamos una cepa de levadura modificada GhLag1, en la que las dos sintasas de ceramida endógenas Lag1 y Lac1 fueron reemplazadas por GhLag1 (el homólogo de Lag1 del algodón), lo que resultó en una cepa de levadura con una cepa de ceramida de membrana celular más corta que el tipo silvestre (Figura 3A) (28). El análisis de espectrometría de masas (MS) mostró que en las cepas de tipo silvestre, el 95% de la ceramida total es ceramida de cadena muy larga (C26), mientras que en GhLag1, el 85% de la ceramida es muy larga (C18 y C16). ), solo el 2% de la ceramida es ceramida de cadena muy larga (C26). Aunque las ceramidas C18 y C16 son las principales ceramidas detectadas en la membrana de GhLag1 hasta ahora, el análisis de MS también confirmó que el anclaje GPI de Gas1-GFP expresado en la cepa GhLag1 contiene ceramida C26, que es comparable a los lípidos de tipo salvaje. La calidad es la misma (Fig. 3A) (26). Por lo tanto, esto significa que la enzima remodeladora de ceramida Cwh43 es altamente selectiva para la ceramida C26, como se muestra en la Figura 26, incorpora preferentemente el anclaje GPI de una pequeña cantidad de ceramida C26 en la cepa GhLag1. S2 (29). Sin embargo, la membrana celular de GhLag1 básicamente solo contiene ceramida C18-C16, mientras que Gas1-GFP todavía tiene ceramida C26. Este hecho hace que esta cepa sea una herramienta ideal para resolver específicamente el problema de la longitud de la cadena acilo de la ceramida de membrana en el RE. El papel hipotético de la clase y la clasificación. Luego, primero estudiamos la capacidad de C26 Gas1-GFP para acumularse en grupos en GhLag1 con un alelo mutante sensible a la temperatura de sec31-1 a través de microscopía de fluorescencia convencional, donde solo la cadena larga (C18-C16) existe en la ceramida de la membrana del RE (Fig. 3). Observamos que en sec31-1, la mayor parte de Gas1-GFP se concentró en grupos, mientras que Gas1-GFP en sec31-1 GhLag1 con membrana del RE de ceramida larga (C18-C16) no se agrupó y se distribuyó en toda la membrana del RE. Para ser precisos, debido a que la agrupación basada en ceramida C26 está estrechamente relacionada con ERES específicos (Figura 1), a continuación investigamos si este proceso también puede involucrar la función del mecanismo de la proteína de exportación del RE. GPI-AP utiliza un sistema COPII especial para la exportación del RE, que está regulado activamente por la remodelación estructural de Ted1 de la porción de glicano del ancla de GPI (30, 31). El GPI-glicano recombinante es reconocido por el complejo p24 del receptor de carga transmembrana, que a su vez recluta selectivamente Lst1, una isoforma específica de la subunidad principal de unión a la carga COPII, Sec24, formando vesículas COPII ricas en GPI-AP (31-33). Por lo tanto, construimos un mutante doble que combinaba la deleción de estas proteínas individuales (Emp24, componente del complejo p24, la enzima remodeladora de GPI-glicano Ted1 y Lst1, subunidad específica de COPII) con la cepa mutante sec31-1, y estudiamos si es posible formar GFP del grupo Gas1 (Figura 3). Observamos que en sec31-1emp24Δ y sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP está principalmente desagrupado y distribuido por toda la membrana del RE, como se vio previamente en sec31-1 GhLag1, mientras que en sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP como sec31-1. Estos resultados indican que, además de la presencia de ceramida C26 en la membrana del RE, el agrupamiento de Gas1-GFP también necesita unirse al complejo p24 y no requiere el reclutamiento específico de Lst1. Luego, exploramos la posibilidad de que la longitud de la cadena de ceramida en la membrana del RE pueda regular la unión de Gas1-GFP a p24. Sin embargo, encontramos que la presencia de ceramida C18-C16 en la membrana no afecta a los GPI-glicanos reconstruidos por el complejo p24 (Figuras S3 y S4, A y B) ni a la unión a GPI-AP y la exportación de GPI-AP. Reclutar el subtipo Lst1 de COPII (Figura S4C). Por lo tanto, la agrupación dependiente de la ceramida C26 no requiere interacciones proteicas con diferentes mecanismos de las proteínas exportadoras del RE, sino que apoya un mecanismo de clasificación alternativo impulsado por la longitud del lípido. Posteriormente, analizamos si la longitud de la cadena de acilo de la ceramida en la membrana del RE es importante para la clasificación efectiva de Gas1-GFP como ERES selectivo. Dado que Gas1 en la cepa GhLag1 con ceramida de cadena corta abandona el RE y entra en la membrana plasmática (Figura S5), creemos que si la clasificación está impulsada por la longitud de la cadena de acilo de la ceramida, Gas1 en la cepa GhLag1 puede ser redirigido y cruzado. ERES con la misma membrana.
(A) La membrana celular de GhLag1 contiene principalmente ceramidas C18-C16 más cortas, mientras que el anclaje GPI de Gas1-GFP aún tiene el mismo IPC C26 que las células de tipo salvaje. Arriba: análisis de la longitud de la cadena de acilo de la ceramida en la membrana celular de las cepas de tipo salvaje (Wt) y GhLag1p por espectrometría de masas (MS). Los datos representan el porcentaje de ceramida total. El promedio de tres experimentos independientes. Barra de error = DE. Prueba t no pareada de dos colas. **** P ＜0,0001. Panel inferior: análisis MS de la longitud de la cadena de acilo del IPC presente en el anclaje GPI de Gas1-GFP (GPI-IPC) expresado en las cepas de tipo salvaje y GhLag1p. Los datos representan el porcentaje de la señal total de IPC. Promedio de cinco experimentos independientes. Barra de error = DE. Prueba t no pareada de dos colas. ns, no importante. P = 0,9134. (B) Micrografías de fluorescencia de células sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ y sec31-1lst1Δ que expresan Gas1-GFP inducido por galactosa se incubaron a 37 °C durante 30 minutos y se pasaron a Realizar microscopía de fluorescencia de rutina después de 24 °C. Flecha blanca: Grupo de Gas1-GFP del RE. Flecha abierta: Gas1-GFP no agrupado se distribuye en toda la membrana del RE, mostrando la tinción de anillo nuclear característica del RE. Barra de escala, 5 μm. (C) Cuantificación de la fotomicrografía descrita en (B). El porcentaje promedio de células con estructura punteada de Gas1-GFP. En tres experimentos independientes, n ≥ 300 células. Barra de error = DE. Prueba t no pareada de dos colas. **** P ＜0,0001.
Para resolver directamente este problema, realizamos la visualización SCLIM de Gas1-GFP y Mid2-iRFP en GhLag1 con el alelo mutante sensible a la temperatura sec31-1 (Figura 4 y Película S4). Después de que el RE se mantuvo a 37 °C y posteriormente se liberó a 24 °C, la mayor parte del Gas1-GFP recién sintetizado no se agrupó ni distribuyó por toda la membrana del RE, como se observó con microscopios convencionales (Figura 4, A y B). Además, un gran porcentaje de ERES (67 %) incluye dos tipos de carga co-localizada en él (Figura 4D). Los paneles 1 y 2 de la Figura 4C muestran dos ejemplos típicos de ERES con Gas1-GFP y Mid2-GFP superpuestos. Además, ambos bienes fueron reclutados en el mismo ERES (Figura 4E, panel 3 y película S4). Por lo tanto, nuestros resultados indican que la longitud de la cadena de acilo de ceramida en la membrana del RE es un determinante importante de la agregación y clasificación de proteínas del RE.
Células Sec31-1 GhLag1 que expresan secreciones inducidas por galactosa, Gas1-GFP (GPI-AP, verde) y Mid2-iRFP (TMP, azul) y Sec13-mCherry marcada con ERES constitutiva (ERES, magenta). Incubar a 37 °C. Continuar durante 30 minutos, bajar a 24 °C para liberar las secreciones y obtener imágenes con SCLIM después de 20 minutos. (A a C) Imágenes representativas de proyección 2D (A; barra de escala, 1 μm) o imágenes 3D del hemisferio celular (B y C; unidad de escala, 0,45 μm) de las 10 secciones z marcadas por carga y ERES. El panel inferior en (B) y el panel en (C) muestran imágenes procesadas para mostrar solo los bienes presentes en ERES (magenta) [Gas1-GFP (gris) y Mid2-iRFP (azul claro)]. (C) Flecha blanca rellena: ERES, superposición de bienes. Flecha abierta: ERES contiene solo un elemento. Panel inferior: El ERES seleccionado tiene bienes superpuestos (1 y 2) marcados en (C). Barra de escala, 100 nm. (D) Cuantificación de la fotomicrografía descrita en (C). En las unidades sec31-1 y sec31-1 GhLag1, solo se incluye una carga (Gas1-GFP o Mid2-iRFP), y el porcentaje promedio de ERES para carga aislada y carga superpuesta. En tres experimentos independientes, n = 432 en 54 células (sec31-1) y n = 430 en 47 células (sec31-1 GhLag1). Barra de error = DE. Prueba t no pareada de dos colas. *** P = 0,0002 (sec31-1) y ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Imagen 3D de ERES seleccionado con carga superpuesta (3) marcada en (C). Gas1-GFP (verde) y Mid2-iRFP (azul) se aproximan a ERES (magenta) desde el mismo lado y permanecen en la misma zona restringida de ERES. Barra de escala, 100 nm.
Este estudio proporciona evidencia directa in vivo de que las cargas proteicas basadas en lípidos se clasifican en sitios de exportación selectivos en la vía secretora y revela la importancia de la longitud de la cadena de acilo para la selectividad de la clasificación. Utilizando una técnica de microscopía potente y de vanguardia llamada SCLIM, demostramos la recién sintetizada Gas1-GFP (un importante GPI-AP de la membrana plasmática con una porción lipídica de ceramida de cadena acilo (C26) muy larga) en levadura). Las regiones agrupadas en ER discretos están asociadas con ERES específicos, mientras que las proteínas secretadas transmembrana se distribuyen por toda la membrana del ER (Figura 1). Además, estos dos tipos de mercancías entran selectivamente en diferentes ERES (Figura 2). La longitud de la cadena de acilo de la ceramida celular en la membrana se reduce de C26 a C18-C16, el grupo Gas1-GFP se interrumpe en la región discreta del ER y Gas1-GFP se redirige para salir del ER con la proteína transmembrana a través del mismo ERES (Figura 3 y Figura 4).
Aunque GPI-AP utiliza un mecanismo proteico especializado para salir del RE, descubrimos que la separación dependiente de ceramida C26 no depende de interacciones proteicas diferenciales que puedan conducir a la especialización de ERES (Figuras S4 y S5). En cambio, nuestros hallazgos respaldan un mecanismo de clasificación alternativo impulsado por la agrupación de proteínas basada en lípidos y la posterior exclusión de otras cargas. Nuestras observaciones indican que la región o agrupación Gas1-GFP asociada a un ERES específico carece de la proteína secretada transmembrana Mid2-iRFP, lo que indica que la agrupación de GPI-AP dependiente de ceramida C26 facilitará su entrada en el ERES relevante y, al mismo tiempo, excluirá las secreciones transmembrana que entran en este ERES en particular (Figuras 1 y 2). Por el contrario, la presencia de ceramidas C18-C16 en la membrana del RE no hace que GPI-AP forme regiones o agrupaciones, por lo que no excluyen ni reemplazan las proteínas secretadas transmembrana en el mismo ERES (Figuras 3 y 4). Por lo tanto, proponemos que la ceramida C26 impulsa la separación y la clasificación al facilitar la agrupación de proteínas vinculadas a ERES específicos.
¿Cómo lograr esta agrupación dependiente de la ceramida C26 en un área específica del RE? La tendencia de la ceramida de la membrana a separarse lateralmente puede causar que GPI-AP y la ceramida C26 formen lípidos pequeños e instantáneamente ordenados en el entorno lipídico más irregular de la membrana del RE que contiene glicerolípidos más cortos e insaturados. Agrupaciones de calidad (17, 18). Estas pequeñas agrupaciones temporales pueden fusionarse aún más en agrupaciones más grandes y estables después de unirse al complejo p24 (34). En consonancia con esto, demostramos que C26 Gas1-GFP necesita interactuar con el complejo p24 para formar agrupaciones visibles más grandes (Figura 3). El complejo p24 es un oligómero heterocigoto compuesto por cuatro proteínas transmembrana p24 diferentes en levadura (35), que proporciona una unión multivalente, que puede conducir a la reticulación de pequeñas agrupaciones de GPI-AP, generando así una agrupación estable más grande (34). La interacción entre los ectodominios proteicos de los GPI-AP también puede contribuir a su agregación, como se muestra durante su transporte a Golgi en células epiteliales polarizadas de mamíferos (36). Sin embargo, cuando la ceramida C18-C16 está presente en la membrana del RE, cuando el complejo p24 se une a Gas1-GFP, no se formarán grandes grupos separados. El mecanismo subyacente puede depender de las propiedades físicas y químicas específicas de la ceramida de cadena acilo larga. Los estudios biofísicos de membranas artificiales muestran que, aunque tanto las ceramidas de cadena acilo larga (C24) como las cortas (C18-C16) pueden causar separación de fases, solo las ceramidas de cadena acilo larga (C24) pueden promover una alta curvatura y flexión de la película para remodelar la película. A través de la referencia mutua (17, 37, 38). Se ha demostrado que la hélice transmembrana de TMED2, el homólogo humano de Emp24, interactúa selectivamente con la esfingomielina basada en ceramida C18 en los lobulillos citoplasmáticos (39). Utilizando simulaciones de dinámica molecular (MD), encontramos que las ceramidas C18 y C26 se acumulan alrededor de los lobulillos citoplasmáticos de la hélice transmembrana de Emp24, y tienen preferencias similares (Figura S6). Vale la pena señalar que esto indica que la hélice transmembrana de Emp24 puede conducir a una distribución asimétrica de lípidos en la membrana. Este es un resultado reciente basado en células de mamíferos. Simulaciones MD similares también muestran la presencia de lípidos de éter (40). Por lo tanto, especulamos que la ceramida C26 en los dos lobulillos de ER26 está enriquecida localmente. Cuando GPI-AP en los lobulillos luminales se une directamente a p24 multivalente y la acumulación de ceramida C26 alrededor de p24 en los lobulillos citoplasmáticos, puede promover la agregación de proteínas acompañante y la curvatura de la membrana se generan a través de los dedos (41), causando que GPI-AP se separe en regiones discretas adyacentes a ERES, lo que también favorece las regiones altamente curvadas de la membrana del RE (42). Informes previos respaldaron el mecanismo propuesto (43, 44). La unión multivalente de oligolectinas, patógenos o anticuerpos a glucoesfingolípidos basados ​​en ceramida (GSL) en la membrana plasmática desencadena una gran agregación de GSL, mejora la separación de fases y causa la deformación e internalización de la membrana (44). Iwabuchi etc. (43) Se encontró que en presencia de cadenas de acilo largas (C24) pero no cortas (C16), el ligando multivalente unido a la lactosilceramida GSL indujo la formación de grandes grupos e invaginación de la membrana, y la transducción de señales mediada por Lyn del citoplasma en los folíolos está entrelazada por cadenas de acilo en neutrófilos acoplados.
En células epiteliales polarizadas de mamíferos, la concentración de la red anti-Golgi (TGN) a nivel de la membrana plasmática apical controla la separación y clasificación de GPI-AP (10, 45). Esta agregación es impulsada por la oligomerización de GPI-AP (36), pero también puede depender de la longitud de la cadena de ceramida que encontramos en la levadura. Aunque el GPI-AP de mamíferos tiene un anclaje basado en lípidos de éter, y su estructura química es muy diferente de la ceramida de cadena acilo muy larga, un estudio reciente encontró que ambos lípidos tienen propiedades físicas y químicas evolutivamente similares y función (40). Por lo tanto, la parte del lípido de éter en células de mamíferos puede ser similar a la ceramida C26 en la levadura, y su papel es asociarse con la ceramida de cadena larga en la membrana para promover la agregación y clasificación de GPI-AP. Aunque esta posibilidad aún debe evaluarse directamente, hallazgos previos respaldan que el transporte de la ceramida de cadena acilo larga al aparato de Golgi no se realiza mediante proteínas de transferencia citoplasmáticas, sino que depende de la síntesis de anclajes GPI, como en la levadura. Por lo tanto, el mecanismo evolutivo conservativo parece ser capaz de cotransportar selectivamente la ceramida de cadena acilo muy larga y el GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) en la misma vesícula de transporte.
En sistemas de células epiteliales polarizadas de levaduras y mamíferos, la agregación y separación de GPI-AP de otras proteínas de la membrana plasmática ocurren antes de alcanzar la superficie celular. Paladino et al. (48) encontraron que en el TGN de ​​células epiteliales polarizadas de mamíferos, la agrupación de GPI-AP no solo es necesaria para la clasificación selectiva de GPI-APs a la membrana plasmática apical, sino que también regula la organización de agrupación de GPI-APs y su actividad biológica. Superficie celular. En levaduras, este estudio mostró que la agrupación de GPI-AP dependiente de ceramida C26 en el RE puede regular la organización de agrupación y la actividad funcional de GPI-AP en la membrana plasmática (24, 49). En consonancia con este modelo, las células GhLag1 son alérgicas a inhibidores de GPI o fármacos que afectan la integridad de la pared celular (28), y la necesidad de agrupaciones funcionales Gas1-GFP (49) de la ceramida de la punta proyectada en el apareamiento de células de levadura indica G Posibles consecuencias fisiológicas de células hLag1. Error de GPI-AP. Sin embargo, nuestra futura investigación se centrará en comprobar si la organización funcional de la superficie celular ha sido programada desde el RE mediante un método de clasificación basado en la longitud de los lípidos.
Las cepas de Saccharomyces cerevisiae utilizadas en este trabajo se listan en la Tabla S1. Las cepas MMY1583 y MMY1635 de SCLIM para imágenes de células vivas se construyeron en el fondo de W303. Estas cepas que expresan Sec13-mCherry con una etiqueta de proteína fluorescente se construyeron utilizando un método basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el plásmido pFA6a como plantilla (23). La cepa que expresa Mid2-iRFP marcada con proteína fluorescente bajo el control del promotor GAL1 se construyó de la siguiente manera. Amplificación por PCR de la secuencia iRFP-KanMx del vector pKTiRFP-KAN (donación de E. O'Shea, número de plásmido Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identificador de recurso de investigación (RRID): Addgene_64687) e insertada en el extremo C-terminal de Mid2 endógeno. Tras amplificar y clonar la secuencia genómica de Mid2-iRFP en el promotor GAL1, se integró en el sitio Not I-Sac I del plásmido de integración pRS306. El plásmido resultante, pRGS7, se linealizó con Pst I para integrarse en el locus URA3.
El gen de fusión Gas1-GFP se expresa bajo el control del promotor GAL1 en el plásmido centrómero (CEN), que se construye de la siguiente manera. La secuencia Gas1-GFP se amplificó por PCR a partir del plásmido pRS416-GAS1-GFP (24) (donación de L. Popolo) y se clonó en el sitio Xma I–Xho I del plásmido CEN pBEVY-GL LEU2 (donación de C). Miller; número de plásmido Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). El plásmido resultante se denominó pRGS6. El gen de fusión Axl2-GFP también se expresa bajo el control del promotor GAL1 del vector pBEVY-GL LEU2, y su construcción es la siguiente. La secuencia Axl2-GFP se amplificó mediante PCR a partir del plásmido pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) y se clonó en el sitio Bam HI-Pst I del vector pBEVY-GL LEU2. El plásmido resultante se denominó pRGS12. La secuencia de los oligonucleótidos utilizados en este estudio se muestra en la Tabla S2.
La cepa se complementó con 0,2% de adenina y 2% de glucosa [YP-dextrosa (YPD)], 2% de medio rico en rafinosa [YP-rafinosa] proteína p (YP) (1% de extracto de levadura y 2% de proteína ept). (YPR)] o 2% de galactosa [YP-galactosa (YPG)] como fuente de carbono, o en un medio mínimo sintético (0,15% de base nitrogenada de levadura y 0,5% de sulfato de amonio) para complementar los aminoácidos y bases apropiados requeridos para la nutrición, y que contiene 2% de glucosa (medio mínimo de glucosa sintética) o 2% de galactosa (medio mínimo de galactosa sintética) como fuente de carbono.
Para la obtención de imágenes en tiempo real, se cultivaron células mutantes sec31-1 sensibles a la temperatura que expresaban el constructo bajo el promotor GAL1 en medio YPR a 24 °C durante la noche hasta la fase logarítmica media. Tras la inducción en YPG a 24 °C durante una hora, las células se incubaron en SG a 37 °C durante 30 minutos y, posteriormente, se transfirieron a 24 °C para liberarlas del bloqueo de secreción. Se utilizó concanavalina A para fijar las células en un portaobjetos de vidrio y se obtuvieron imágenes mediante SCLIM. SCLIM es una combinación de microscopio de fluorescencia invertido Olympus IX-71 y lente de aceite de apertura numérica UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), escáner confocal de disco giratorio de alta velocidad y alta relación señal-ruido (Yokogawa Electric), espectrómetro personalizado y enfriamiento personalizado El intensificador de imagen del sistema (Hamamatsu Photonics) puede proporcionar un sistema de lente de aumento con un aumento final de ×266.7 y una cámara de dispositivo de carga acoplada que multiplica electrones (Hamamatsu Photonics) (21). La adquisición de imágenes se realiza mediante software personalizado (Yokogawa Electric). Para imágenes 3D, usamos un actuador piezoeléctrico hecho a medida para vibrar la lente del objetivo verticalmente y recolectamos las partes ópticas separadas 100 nm en una pila. La imagen de la pila Z se convierte en datos de vóxeles 3D, y la función de dispersión de puntos teórica usada para el microscopio confocal de disco giratorio se usa para el procesamiento de deconvolución mediante el software Volocity (PerkinElmer). Mediante el software Volocity, que establece automáticamente el umbral para el análisis de coubicación, se midió el ERES, incluida la carga. El análisis de escaneo lineal se realizó con el software MetaMorph (Molecular Devices).
Utilice el software GraphPad Prism para determinar la significancia estadística. Para la prueba t de Student bilateral y el análisis de varianza (ANOVA) unidireccional ordinario, se considera que las diferencias entre grupos tienen un impacto significativo en p < 0,05 (*).
Para la microscopía de fluorescencia de Gas1-GFP, las células en fase logarítmica se cultivaron durante la noche en YPD y se recolectaron por centrifugación, se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato y se incubaron en hielo durante al menos 15 minutos. Posteriormente, se analizaron al microscopio como se describió previamente (Check [24]). Para la adquisición, se utilizó el microscopio Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS), equipado con un objetivo, un filtro L5 (GFP), una cámara Hamamatsu y el software Application Suite X (LAS X).
Las muestras se desnaturalizaron con tampón de muestra SDS a 65 °C durante 10 minutos y luego se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (PAGE). Para el análisis de inmunotransferencia, se cargaron 10 μl de muestra por carril. Anticuerpo primario: Utilice anti-Gas1 policlonal de conejo a una dilución de 1:3000, anti-Emp24 policlonal de conejo a una dilución de 1:500 y anti-GFP policlonal de conejo (un obsequio de H. Riezman) a una dilución de 1:3000. El anticuerpo monoclonal de ratón anti-Pgk1 se utilizó a una dilución de 1:5000 (un obsequio de J. de la Cruz). Anticuerpo secundario: inmunoglobulina G (IgG) de cabra anti-conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) utilizada a una dilución de 1:3000 (Pierce). Se utilizó IgG de cabra antirratón conjugada con HRP a una dilución de 1:3000 (Pierce). La zona de respuesta inmunitaria se observó mediante el método de quimioluminiscencia del reactivo SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Como se describe en (31), se realizó un experimento de inmunoprecipitación natural en la fracción de ER enriquecida. En resumen, lavar las células de levadura con tampón TNE [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsulfonil fluoruro e inhibidor de proteasa) a 600 nm (OD600) a una densidad óptica de 100 dos veces. Se rompió con perlas de vidrio y luego los restos celulares y las perlas de vidrio se eliminaron por centrifugación. Luego, el sobrenadante se centrifugó a 17.000 g durante 15 minutos a 4 °C. El pellet se resuspendió en TNE y se añadió saponina digital a una concentración final del 1 %. La suspensión se incubó durante 1 hora con rotación a 4 °C y luego los componentes insolubles se eliminaron por centrifugación a 13.000 g a 4 °C durante 60 minutos. Para la inmunoprecipitación de Gas1-GFP, primero se preincubó la muestra con microesferas de agarosa vacías (ChromoTek) a 4 °C durante 1 hora y, a continuación, se incubó con GFP-Trap_A (ChromoTek) a 4 °C durante 3 horas. Las microesferas inmunoprecipitadas se lavaron cinco veces con TNE con 0,2 % de digoxigenina, se eluyeron con tampón de muestra SDS, se separaron mediante SDS-PAGE y se analizaron mediante inmunotransferencia.
Como se describe en (31), se determinó la reticulación en la fracción de RE enriquecida. Brevemente, la fracción de RE enriquecida se incubó con 0,5 mM de ditiobis(succinimidil propionato) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EE. UU.; 20 °C, 20 min). La reacción de reticulación se extinguió añadiendo glicina (concentración final de 50 mM, 5 minutos, 20 °C).
Como se describió previamente (50), se realizó un análisis de MS de ceramida en cepas de tipo silvestre y GhLag1. En resumen, las células se cultivaron hasta la fase exponencial (3 a 4 unidades de DO600/ml) en YPD a 30 °C, y se recolectaron 25 × 10⁻¹ células. Su metabolismo se inhibió con ácido tricloroacético. Se utilizó disolvente de extracción [etanol, agua, éter, piridina e hidróxido de amonio 4,2 N (15:15:5:1:0,018 v/v)] y 1,2 nmol de ceramida C17 estándar interna (860517, Avanti polar lipid). Se utilizó el reactivo de monometilamina [metanol, agua, n-butanol y solución de metilamina (4:3:1:5 v/v)] para realizar una hidrólisis alcalina suave del extracto y, a continuación, se utilizó n-butanol saturado con agua para desalinizar. Finalmente, el extracto se resuspendió en un disolvente de modo positivo [cloroformo/metanol/agua (2:7:1) + acetato de amonio 5 mM] y se inyectó en el espectrómetro de masas. Se realizó un monitoreo multirreacción (MRM) para la identificación y cuantificación de las moléculas de esfingolípidos. El espectrómetro de masas cuadrupolo terciario TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) está equipado con una fuente de iones de nanoflujo robótica Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) para el análisis de lípidos. La energía de colisión está optimizada para cada categoría de ceramida. Los datos de MS se obtuvieron en modo positivo. Para cada réplica biológica, la señal lipídica es la mediana de tres mediciones independientes.
Como se describe en (31), las células (800×107) que expresan Gas1-GFP se sometieron a inmunoprecipitación natural. El Gas1-GFP purificado se separó por SDS-PAGE y se transfirió a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF). La proteína se visualizó tiñendo PVDF con negro de amida. La banda de Gas1-GFP se cortó del PVDF y se lavó 5 veces con metanol y una vez con agua de grado para cromatografía líquida-MS (LC-MS). Al incubar la tira de membrana con 500 μl de NaOAc 0,3 M (pH 4,0), tampón y 500 μl de mezcla de nitrito de sodio 1 M recién disuelto a 37 °C durante 3 horas, la fracción lipídica se libera de Gas1-GFP y se liza Liberación de ceramida de fosfato de inosina entre glucosamina e inositol (51). Después de eso, la tira de membrana se lavó cuatro veces con agua de grado LC-MS, se secó a temperatura ambiente y se almacenó en una atmósfera de nitrógeno a -80 °C hasta su análisis. Como control, se utilizó una muestra en blanco de membrana de PVDF para cada experimento. El lípido extraído de Gas1-GFP se analizó luego por MS como se describe (50). En resumen, las tiras de PVDF que contenían GPI-lípido se resuspendieron en 75 μl de disolvente de molde negativo [cloroformo/metanol (1:2) + acetato de amonio 5 mM] y se sometieron a análisis de especies de esfingolípidos por ionización por electrospray (ESI)-MRM/MS (TSQ Vantage). En este caso, los datos de MS se obtuvieron en modo de ion negativo.
Como se mencionó anteriormente, la porción lipídica del ancla de GPI se separó del GPI-AP marcado con [3H]-inositol (16). Los lípidos se separaron mediante cromatografía en capa fina utilizando un sistema de disolventes (cloroformo-metanol-KCl al 0,25 % 55:45:10) y se visualizaron con FLA-7000 (Fujifilm).
Las células que expresaban Gas1-GFP (600×10⁻¹) se lavaron dos veces con tampón TNE, se rompieron con microesferas de vidrio y se centrifugaron para eliminar los restos celulares y las microesferas. El sobrenadante se centrifugó a 17 000 g durante 1 hora a 4 °C. El sedimento se lavó con TNE y se incubó con 1 U de PI-PLC (Invitrogen) en TNE con 0,2 % de saponina digital durante 1 hora a 37 °C. Tras el tratamiento enzimático, la membrana se eliminó por centrifugación a 17 000 g a 4 °C durante 1 hora. Para inmunoprecipitar Gas1-GFP, el sobrenadante se incubó con GFP-Trap_A (ChromoTek) a 4 °C durante la noche. El Gas1-GFP purificado, separado por SDS-PAGE, se tiñó con azul brillante de Coomassie. La banda de tinción de Gas1-GFP se separó del gris que rodeaba el acueducto y, tras la alquilación con yodoacetamida y la reducción con ditiotreitol, se realizó la digestión en gel con tripsina. Se extrajeron y secaron los péptidos tripsíticos y los péptidos con GPI-glicanos. El péptido seco se disolvió en 20 μl de agua. Se inyectó una porción (8 μl) en el LC. Se utilizó una columna de octadecilsilano (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diámetro interior 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, Prefectura de Aichi, Japón) para separar los péptidos en condiciones de gradiente específicas. La fase móvil es el disolvente A (ácido fórmico al 0,08 %) y el disolvente B (ácido fórmico al 0,15 % en acetonitrilo al 80 %). Se utilizó un sistema HPLC Accela (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) para eluir la columna con el disolvente A en 55 minutos a un caudal de 50 μl min⁻¹ durante 5 minutos, y posteriormente se aumentó la concentración del disolvente B al 40 %. (Estados Unidos). El eluido se introdujo continuamente en la fuente de iones ESI, y los péptidos tripsídicos y los péptidos con GPI-glicanos se analizaron mediante el LTQ Orbitrap XL (espectrómetro de masas híbrido de trampa de iones lineal-orbitrap; Thermo Fisher Scientific). En la configuración MS, el voltaje de la fuente capilar se ajustó a 4,5 kV y la temperatura del capilar de transferencia se mantuvo a 300 °C. El voltaje del capilar y el voltaje de la lente del tubo se ajustaron a 15 V y 50 V, respectivamente. Los datos de MS se obtuvieron en el modo de iones positivos (resolución de 60 000; precisión de masa de 10 partes por millón) en un rango de masa de 300/m/z relación masa/carga (m/z) 3000. Los datos MS/MS se obtienen a través de la trampa de iones en el LTQ Orbitrap XL [los primeros 3 dígitos de los que dependen los datos, disociación inducida por colisión (CID)].
Las simulaciones MD se realizaron utilizando el software GROMACS (52) y el campo de fuerza MARTINI 2 (53-55). Luego se utilizó el CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) para construir una bicapa que contiene dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) y Cer C18 o DOPC y Cer C26. La topología y las coordenadas de Cer C26 se derivan de DXCE eliminando las perlas adicionales de la cola de esfingosina. Utilice el proceso descrito a continuación para equilibrar la doble capa y ejecutarlo, luego utilice las últimas coordenadas del sistema para construir un sistema que contenga Emp24. El dominio transmembrana de levadura Emp24 (residuos 173 a 193) se construyó como una hélice α utilizando la estructura molecular de la herramienta MD visual (VMD) (58). Luego, después de eliminar los lípidos superpuestos, la proteína se granuló de forma gruesa y se insertó en la bicapa utilizando CHARMM GUI. El sistema final contiene 1202 DOPC y 302 Cer C26 o 1197 DOPC y 295 Cer C18 y Emp24. Se ioniza el sistema a una concentración de 0,150 M. Se realizaron cuatro réplicas independientes para dos composiciones de bicapa.
La bicapa lipídica se equilibra mediante el proceso CHARMM GUI, que implica minimizar y equilibrar 405 000 pasos. Las restricciones de posición se reducen y eliminan gradualmente, y el paso de tiempo aumenta de 0,005 ps a 0,02 ps. Tras el equilibrio, se producen 6 µs con un paso de tiempo de 0,02 ps. Tras insertar Emp24, se utiliza el mismo proceso CHARMM GUI para minimizar y equilibrar el sistema, y ​​luego se ejecuta durante 8 s en producción.
Para todos los sistemas, durante el proceso de balanceo, la presión es controlada por el barostato Berendsen (59), y durante el proceso de producción, la presión es controlada por el barostato Parrinello-Rahman (60). En todos los casos, la presión promedio es de 1 bar y se utiliza un esquema de acoplamiento de presión semiisotrópico. En el proceso de balanceo y producción, se utiliza un termostato (61) con recalibración de velocidad para acoplar la temperatura de las partículas de proteína, lípido y solvente respectivamente. Durante toda la operación, la temperatura objetivo es de 310 K. La interacción de no enlace se calcula generando una lista de emparejamiento utilizando el esquema de Verlet con una tolerancia de tampón de 0,005. El término de Coulomb se calcula utilizando el campo de reacción y una distancia de corte de 1,1 nm. El término de Vander Waals utiliza un esquema de corte con una distancia de corte de 1,1 nm, y el esquema de corte de Verlet se utiliza para la deriva potencial (62).
Utilizando VMD, la longitud de onda de corte entre las microesferas de fosfato DOPC o las microesferas de ceramida AM1 y la proteína es de 0,7 nm, y se calcula la cantidad de lípidos que interactúan con la proteína. Según la siguiente fórmula, calcule el factor de depleción-enriquecimiento (ED) como en (63): Factor ED = (cantidad total de lípidos en la proteína = 0,7) en la proteína = 0,7 (cantidad de Cer en los lípidos totales).
El valor reportado se obtiene como promedio, y las barras de error representan cuatro copias independientes de EE. La significancia estadística del factor DE se calcula mediante la prueba t [(promedioDE-factor-1)/EE]. Calcule el valor p a partir de la distribución unilateral.
Se utilizó la herramienta GROMACS para calcular el mapa de densidad lateral 2D del sistema que contiene Emp24 en los últimos 250 ns de la traza. Para obtener el mapa de enriquecimiento/agotamiento de ceramida, el mapa de densidad de Cer se divide por la suma del mapa de Cer y DOPC, y luego por la concentración de Cer en el cuerpo. Se utiliza la misma escala de color del mapa.
Para obtener materiales complementarios para este artículo, consulte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
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Las imágenes tridimensionales de alta resolución en tiempo real revelan la importancia de la longitud de la cadena de ceramida para la clasificación de proteínas en sitios de salida selectivos.
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