La clasificación de proteínas en la vía secretora es esencial para mantener la compartimentación celular y la homeostasis. Además de la clasificación mediada por la membrana, el papel de los lípidos en la clasificación de la kinesina durante el transporte secretor es una cuestión fundamental que aún no se ha resuelto. En este estudio, realizamos imágenes tridimensionales simultáneas multicolor de alta resolución en tiempo real para demostrar in vivo que las proteínas recién sintetizadas, inmovilizadas en glicosilfosfatidilinositol y con largas cadenas lipídicas de ceramida, se agrupan y clasifican en un sitio de salida especializado del retículo endoplasmático, diferente del utilizado por las proteínas transmembrana. Además, demostramos que la longitud de la cadena de ceramida en la membrana del retículo endoplasmático es crucial para esta selectividad de clasificación. Nuestro estudio proporciona la primera evidencia directa in vivo para clasificar las cargas proteicas según la longitud de la cadena lipídica en sitios de exportación selectivos en la vía secretora.
En las células eucariotas, las proteínas sintetizadas en el retículo endoplasmático (RE) se clasifican durante su transporte a través de la vía secretora para su entrega a su destino celular apropiado (1). Además de la clasificación mediada por la cubierta, se especuló durante mucho tiempo que ciertos lípidos también pueden servir como puntos de salida selectivos al agruparlos en dominios de membrana específicos que contienen proteínas específicas (2-5). Sin embargo, todavía hay una falta de evidencia directa in vivo que demuestre este posible mecanismo basado en lípidos. Para resolver este problema fundamental, estudiamos en levadura cómo las proteínas ancladas a glicosilfosfatidilinositol (GPI-AP) se exportan diferencialmente del RE. Las GPI-AP son una variedad de proteínas de la superficie celular conectadas a lípidos (6, 7). Una GPI-AP es una proteína secretada unida a las capas externas de la membrana plasmática a través de la porción de glicolípido (anclaje GPI). Aceptan los anclajes GPI como modificaciones postraduccionales conservadas en el lumen del RE (8). Tras su unión, la GPI-AP pasa a través del aparato de Golgi (5, 9) desde el RE hasta la membrana plasmática. La presencia de anclajes GPI hace que la GPI-AP se transporte por separado de las proteínas transmembrana secretadas (incluidas otras proteínas de la membrana plasmática) a lo largo de la vía secretora (5, 9, 10). En las células de levadura, las GPI-AP se separan de otras proteínas secretadas en el retículo endoplasmático y luego se empaquetan en vesículas únicas envueltas por el complejo de proteína de cubierta II (COPII) (6, 7). Los determinantes de este proceso de clasificación en el proceso de exportación del RE no están claros, pero se especula que este mecanismo puede requerir lípidos, especialmente la remodelación estructural de la porción lipídica del anclaje GPI (5, 8). En la levadura, la remodelación lipídica de la GPI comienza inmediatamente después de la unión de la GPI y, en muchos casos, hace que la ceramida se una al ácido graso saturado de cadena larga de 26 carbonos (C26:0) (11, 12). La ceramida C26 es la principal ceramida producida por las células de levadura hasta el momento. Se sintetiza en el RE y la mayor parte se exporta al aparato de Golgi a través de vesículas COPII (13). La exportación de GPI-AP desde el RE requiere específicamente la síntesis continua de ceramida (14, 15), y a su vez, la conversión de ceramida a ceramida de inositol fosfato (IPC) en el aparato de Golgi depende de la síntesis del anclaje GPI (16). Estudios biofísicos con membranas artificiales han demostrado que las ceramidas de cadena acilo muy larga pueden coalescer para formar dominios ordenados con propiedades físicas únicas (17, 18). Estos datos llevan a la hipótesis de que la ceramida C26 y el GPI-AP con ceramida C26 utilizan sus propiedades físicas para coalescer en regiones ordenadas o regiones en el entorno lipídico relativamente desordenado de la membrana del RE. Está compuesta principalmente por glicerolípidos cortos e insaturados (C16:1 y C18:1) (19, 20). Estas regiones se centrarán selectivamente en sitios de salida del RE (ERES) específicos, donde la ceramida y el GPI-AP basado en ceramida pueden ser cotransportados al Golgi en la misma vesícula COPII dedicada (5).
En este estudio, hemos probado directamente este mecanismo basado en lípidos utilizando microscopía de imágenes confocales de superresolución en tiempo real (SCLIM), que es una técnica de microscopía de vanguardia que puede observar simultáneamente proteínas marcadas con fluorescencia. Las imágenes tridimensionales (3D) y de tres colores tienen una resolución y velocidad extremadamente altas en células vivas (21, 22).
Primero aplicamos la tecnología SCLIM para definir con mayor precisión cómo se seleccionaba la GPI-AP normal con el grupo ceramida C26 de las proteínas transmembrana secretadas después de salir del RE en S. cerevisiae. Para verificar la clasificación del RE, utilizamos un sistema genético que puede visualizar directamente la carga recién sintetizada que entra en el ERES in vivo (7, 23). Como carga, elegimos la GPI-AP basada en ceramida C26 Gas1 marcada con proteína fluorescente verde (GFP) y la proteína transmembrana secretada Mid2 marcada con proteína fluorescente de infrarrojo cercano (iRFP), ambas dirigidas a la membrana plasmática (24–26). En el mutante termosensible sec31-1, estas dos cargas se expresan bajo un promotor inducible por galactosa y un marcador ERES constitutivo. A la temperatura extrema (37 °C), debido a que la mutación sec31-1 afecta la función del componente de la cubierta COPII Sec31 para inhibir la germinación de COPII y la exportación del RE, la carga recién sintetizada se acumula en el RE (23). Después de enfriar a una temperatura baja (24 °C), las células mutantes sec31-1 se recuperaron del área secretora, y la nueva carga sintética acumulada comenzó a exportarse del RE. La visualización CLIM mostró que la mayor parte de Gas1-GFP y Mid2-iRFP recién sintetizados aún se acumulaban en el RE de las células mutantes sec31-1 después de la incubación a 37 °C y luego se liberaron a 24 °C durante 5 minutos (Figura 1). Dado que Mid2-iRFP se distribuye en toda la membrana del RE, y Gas1-GFP se concentra y se acumula en el área discontinua de la membrana del RE, su distribución es completamente diferente (Figura 1, A a C y Video S1). Además, como se muestra en la Figura 1D, el grupo de Gas1-GFP no tiene Mid2-iRFP. Estos resultados indican que GPI-AP y las proteínas transmembrana se separaron en diferentes regiones de la membrana del RE tempranamente. El grupo Gas1-GFP está adyacente a un ERES específico marcado con la proteína de cubierta COPII Sec13 de mCherry (Figura 1, E y F, y vídeo S1) (23).
Las células sec31-1 expresan secreciones inducidas por galactosa, una cadena acilo larga (C26) ceramida GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, verde) y la proteína transmembrana Mid2-iRFP (TMP, azul) y este marcaje constructivo de ERES Sec13-mCherry (ERES, magenta) se incubó a 37 °C durante 30 minutos, se movió a 24 °C y se obtuvo una imagen mediante SCLIM 5 minutos después. (A a C) muestra una imagen 2D fusionada o única representativa de un plano (A), una imagen de proyección 2D de 10 secciones z (B) o una imagen 3D del hemisferio celular de la carga y los marcadores ERES (C). Barra de escala 1 μm (A y B). La unidad de escala es 0,551 μm (C). Gas1-GFP se detectó en regiones o grupos discretos del RE, mientras que Mid2-iRFP se detectó y distribuyó por toda la membrana del RE (C). (D) El gráfico muestra la intensidad de fluorescencia relativa de Gas1-GFP y Mid2-iRFP en el grupo de Gas1-GFP a lo largo de la línea de la flecha blanca (izquierda). AU, unidad arbitraria. (E y F) representan la imagen 3D que combina los genes y la marca ERES. Los grupos de Gas1-GFP se detectaron cerca del ERES específico. La unidad de escala es 0,551 μm. (F) La flecha blanca continua marca el grupo de Gas1-GFP asociado con ERES. Los paneles central y derecho muestran la imagen 3D ampliada fusionada y una vista rotada del grupo de Gas1-GFP seleccionado.
La estrecha relación espacial entre el clúster Gas1-GFP y un ERES específico indica que Gas1-GFP puede entrar en ERES selectivos, lo que difiere de la selectividad utilizada por Mid2-iRFP para salir del ER. Para abordar esta posibilidad, cuantificamos la proporción de ERES para solo uno o dos productos (Figura 2, A a C). Encontramos que la mayoría de los ERES (70%) contienen solo un tipo de carga. La imagen inferior de la Figura 2C muestra dos ejemplos típicos de ERES con solo Gas1-GFP (Figura 1) o solo Mid2-iRFP (Figura 2). En contraste, aproximadamente el 20% de los ERES contienen dos cargas que se superponen en la misma área. Se encontró que algunos ERES (10%) contenían dos tipos de carga, pero estaban aislados en áreas claramente diferentes. Por lo tanto, este análisis estadístico muestra que después de la exportación del ER, GPI-AP Gas1-GFP y la carga transmembrana Mid2-iRFP se dividen en diferentes ERES (Figura 2D). Esta eficiencia de clasificación es muy consistente con el análisis bioquímico previo (6) y la determinación morfológica (7). También podemos observar el comportamiento de la carga en cuarentena que ingresa al ERES (Figura 2E y Video S2). La Figura 2E muestra que solo una pequeña porción de Gas1-GFP (panel 3) o Mid2-iRFP (panel 4) ingresa al ERES desde un lado y se confina en un área discreta. El panel 5 de la Figura 2E muestra que Gas1-GFP y Mid2-iRFP a veces se encuentran en el mismo ERES, pero ingresan desde lados diferentes y se concentran en regiones separadas que pueden representar diferentes vesículas COPII. También confirmamos que la separación y clasificación observada de GPI-AP Gas1 basado en ceramida C26 como ERES selectivo es específica porque otra carga de secreción transmembrana, la proteína de membrana plasmática Axl2 marcada con GFP (27), muestra un comportamiento similar a Mid2-iRFP. (Imagen S1 y Video S3). La proteína Axl2-GFP recién sintetizada se distribuye a través de la membrana del RE como Mid2-iRFP (Figura S1, A y B), y se localiza junto con Mid2-iRFP en la mayoría de los ERES (Figura S1, B a D). Los paneles 1 y 2 de la Figura 1. S1C muestran dos ejemplos típicos de ERES donde se superponen dos cargas transmembrana. En estos casos, ambas cargas ingresan al ERES simultáneamente (Figura S1E, Panel 3 y Video S3).
Las células sec31-1 que expresan secreciones inducibles por galactosa, Gas1-GFP (GPI-AP, verde) y Mid2-iRFP (TMP, azul) y marcaje ERES constitutivo Sec13-mCherry (ERES, magenta) se colocaron a 37 Después de incubar durante 30 minutos a °C, mover a 24 °C para liberar el bloqueo de secreción y obtener imágenes con SCLIM después de 20 minutos. (A a C) Imágenes de proyección 2D representativas (A; barra de escala, 1 μm) o imágenes de hemisferio celular 3D (B y C; unidad de escala, 0,456 μm) de la carga y 10 secciones z marcadas por ERES. El panel inferior en (B) y el panel en (C) muestran imágenes procesadas para mostrar solo los productos presentes en ERES (magenta) [Gas1-GFP (gris) y Mid2-iRFP (azul claro)]. (C) Flecha abierta: ERES solo transporta una pieza de carga (1 a 4). Flecha gris: ERES contiene carga segregada (5). Flecha blanca sólida: ERES que contiene carga colocalizada. Abajo: El ERES único seleccionado contiene solo Gas1-GFP (1) o Mid2-iRFP (2). Barra de escala, 100 nm. (D) Cuantificación de la fotomicrografía descrita en (C). El porcentaje promedio de ERES que contiene solo una carga (Gas1-GFP o Mid2-iRFP), carga segregada y carga superpuesta. En tres experimentos independientes, n=432 en 54 células. Barra de error = DE. Prueba t no pareada de dos colas. *** P = 0,0002. (E) Imagen 3D de ERES seleccionado de carga en cuarentena marcada con (C). Gas1-GFP (verde) (3) o Mid2-iRFP (azul) (4) entra en ERES (magenta) desde un lado y se restringe a una pequeña área dentro de ERES. En ocasiones, ambos tipos de carga ingresan al mismo ERES (5) desde el mismo lado y quedan confinados a un área aislada dentro del ERES. Barra de escala: 100 nm.
A continuación, probamos una hipótesis de que la ceramida de cadena acilo larga (C26) presente en la membrana del RE impulsa la agrupación y clasificación específica de Gas1 en ERES selectivos. Para ello, utilizamos una cepa de levadura modificada GhLag1, en la que las dos sintasas de ceramida endógenas Lag1 y Lac1 fueron reemplazadas por GhLag1 (el homólogo de Lag1 del algodón), lo que dio como resultado una cepa de levadura con una cepa de ceramida de membrana celular más corta que la del tipo silvestre (Figura 3A) (28). El análisis de espectrometría de masas (EM) mostró que en las cepas de tipo silvestre, el 95% de la ceramida total es ceramida de cadena muy larga (C26), mientras que en GhLag1, el 85% de la ceramida es muy larga (C18 y C16), y solo el 2% de la ceramida es ceramida de cadena muy larga (C26). Aunque las ceramidas C18 y C16 son las principales ceramidas detectadas en la membrana de GhLag1 hasta ahora, el análisis de MS también confirmó que el anclaje GPI de Gas1-GFP expresado en la cepa GhLag1 contiene ceramida C26, que es comparable a los lípidos de tipo silvestre. La calidad es la misma (Fig. 3A) (26). Por lo tanto, esto significa que la enzima remodeladora de ceramida Cwh43 es altamente selectiva para la ceramida C26, como se muestra en la Figura 26, incorpora preferentemente el anclaje GPI de una pequeña cantidad de ceramida C26 en la cepa GhLag1. S2 (29). Sin embargo, la membrana celular de GhLag1 básicamente solo contiene ceramida C18-C16, mientras que Gas1-GFP todavía tiene ceramida C26. Este hecho hace de esta cepa una herramienta ideal para resolver específicamente el problema de la longitud de la cadena acilo de la ceramida de membrana en el RE. El papel hipotético de la clase y la clasificación. Luego, primero estudiamos la capacidad de C26 Gas1-GFP para acumularse en cúmulos en GhLag1 con un alelo mutante termosensible de sec31-1 a través de microscopía de fluorescencia convencional, donde solo la cadena larga (C18-C16) existe en la ceramida de la membrana del RE (Fig. 3). Observamos que en sec31-1, la mayor parte de Gas1-GFP estaba concentrada en cúmulos, mientras que Gas1-GFP en sec31-1 GhLag1 con ceramida larga (C18-C16) de la membrana del RE no estaba agrupada principalmente y se distribuía en toda la membrana del RE. Para ser precisos, debido a que la agrupación basada en ceramida C26 está estrechamente relacionada con ERES específicos (Figura 1), luego investigamos si este proceso también puede involucrar la función del mecanismo de la proteína de exportación del RE. GPI-AP utiliza un sistema COPII especial para la exportación del RE, que está regulado activamente por la remodelación estructural de Ted1 de la porción de glicano del anclaje GPI (30, 31). El glicano GPI recombinante es reconocido por el complejo receptor de carga transmembrana p24, que a su vez recluta selectivamente a Lst1, que es una isoforma específica de la subunidad principal de unión de carga COPII Sec24, formando vesículas COPII ricas en GPI-AP (31-33). Por lo tanto, construimos un mutante doble que combinaba la deleción de estas proteínas individuales (el componente del complejo p24 Emp24, la enzima de remodelación de glicano GPI Ted1 y la subunidad COPII específica Lst1) con la cepa mutante sec31-1, y estudiamos si es posible formar el clúster Gas1 GFP (Figura 3). Observamos que en sec31-1emp24Δ y sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP se encuentra principalmente sin agrupar y distribuido por toda la membrana del RE, como se vio previamente en sec31-1 GhLag1, mientras que en sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP es similar a sec31-1. Estos resultados indican que, además de la presencia de ceramida C26 en la membrana del RE, el agrupamiento de Gas1-GFP también necesita unirse al complejo p24 y no requiere el reclutamiento específico de Lst1. Luego, exploramos la posibilidad de que la longitud de la cadena de ceramida en la membrana del RE pueda regular la unión de Gas1-GFP a p24. Sin embargo, encontramos que la presencia de ceramida C18-C16 en la membrana no afecta a los glicanos GPI reconstruidos por el complejo p24 (Figuras S3 y S4, A y B) ni a la unión a GPI-AP y la capacidad de exportar GPI-AP. Reclutar el subtipo COPII Lst1 (Figura S4C). Por lo tanto, el agrupamiento dependiente de ceramida C26 no requiere interacciones proteicas con diferentes mecanismos de proteínas de exportación del RE, sino que apoya un mecanismo de clasificación alternativo impulsado por la longitud del lípido. Luego, analizamos si la longitud de la cadena acilo de ceramida en la membrana del RE es importante para la clasificación efectiva de Gas1-GFP como ERES selectivo. Dado que Gas1 en la cepa GhLag1 con ceramida de cadena corta sale del RE y entra en la membrana plasmática (Figura S5), creemos que si la clasificación está impulsada por la longitud de la cadena acilo de ceramida, Gas1 en la cepa GhLag1 puede ser redirigido y atravesar. ERES bienes con la misma membrana.
(A) La membrana celular de GhLag1 contiene principalmente ceramidas C18-C16 más cortas, mientras que el anclaje GPI de Gas1-GFP todavía tiene el mismo IPC C26 que las células de tipo silvestre. Arriba: análisis de la longitud de la cadena acilo de la ceramida en la membrana celular de cepas de tipo silvestre (Wt) y GhLag1p por espectrometría de masas (MS). Los datos representan el porcentaje de ceramida total. El promedio de tres experimentos independientes. Barra de error = DE. Prueba t no pareada de dos colas. **** P ＜0,0001. Panel inferior: análisis de MS de la longitud de la cadena acilo del IPC presente en el anclaje GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) expresado en las cepas de tipo silvestre y GhLag1p. Los datos representan el porcentaje de la señal total de IPC. Promedio de cinco experimentos independientes. Barra de error = DE. Prueba t no pareada de dos colas. ns, no importante. P = 0,9134. (B) Micrografías de fluorescencia de células sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ y sec31-1lst1Δ que expresan Gas1-GFP inducida por galactosa se incubaron a 37 °C durante 30 minutos y se pasaron a Realizar microscopía de fluorescencia de rutina después de 24 °C. Flecha blanca: grupo de Gas1-GFP del RE. Flecha abierta: Gas1-GFP no agrupado se distribuye en toda la membrana del RE, mostrando la tinción característica del anillo nuclear del RE. Barra de escala, 5 μm. (C) Cuantificación de la fotomicrografía descrita en (B). El porcentaje promedio de células con estructura punteada de Gas1-GFP. En tres experimentos independientes, n ≥ 300 células. Barra de error = DE. Prueba t no pareada de dos colas. **** P < 0,0001.
Para resolver directamente este problema, realizamos una visualización SCLIM de Gas1-GFP y Mid2-iRFP en GhLag1 con el alelo mutante termosensible sec31-1 (Figura 4 y Vídeo S4). Después de que el RE se retuviera a 37 °C y posteriormente se liberara a 24 °C, la mayor parte de la Gas1-GFP recién sintetizada no se agrupó ni se distribuyó por toda la membrana del RE, como se observó con microscopios convencionales (Figura 4, A y B). Además, un gran porcentaje de ERES (67 %) incluye dos tipos de carga coubicadas en él (Figura 4D). Los paneles 1 y 2 de la Figura 4C muestran dos ejemplos típicos de ERES con Gas1-GFP y Mid2-GFP superpuestos. Además, ambos productos fueron reclutados en el mismo ERES (Figura 4E, panel 3 y vídeo S4). Por lo tanto, nuestros resultados indican que la longitud de la cadena acilo de ceramida en la membrana del RE es un determinante importante de la agregación y clasificación de proteínas del RE.
Células Sec31-1 GhLag1 que expresan secreciones inducidas por galactosa, Gas1-GFP (GPI-AP, verde) y Mid2-iRFP (TMP, azul) y Sec13-mCherry (ERES, magenta) marcado con ERES constitutivo. Incubar a 37 °C. Continuar durante 30 minutos, bajar a 24 °C para liberar las secreciones y obtener imágenes con SCLIM después de 20 minutos. (A a C) Imágenes de proyección 2D representativas (A; barra de escala, 1 μm) o imágenes de hemisferios celulares 3D (B y C; unidad de escala, 0,45 μm) de las 10 secciones z marcadas por carga y ERES. El panel inferior en (B) y el panel en (C) muestran imágenes procesadas para mostrar solo los productos presentes en ERES (magenta) [Gas1-GFP (gris) y Mid2-iRFP (azul claro)]. (C) Flecha blanca rellena: ERES, superposición de productos. Flecha abierta: ERES contiene solo un elemento. Panel inferior: El ERES seleccionado tiene productos superpuestos (1 y 2) marcados en (C). Barra de escala, 100 nm. (D) Cuantificación de la fotomicrografía descrita en (C). En las unidades sec31-1 y sec31-1 GhLag1, solo se incluye una carga (Gas1-GFP o Mid2-iRFP), y el porcentaje promedio de ERES para carga aislada y carga superpuesta. En tres experimentos independientes, n = 432 en 54 células (sec31-1) y n = 430 en 47 células (sec31-1 GhLag1). Barra de error = DE. Prueba t no pareada de dos colas. *** P = 0,0002 (sec31-1) y ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Imagen 3D de ERES seleccionado con carga superpuesta (3) marcada en (C). Gas1-GFP (verde) y Mid2-iRFP (azul) se aproximan a ERES (magenta) desde el mismo lado y permanecen en la misma zona restringida por ERES. Barra de escala: 100 nm.
Este estudio proporciona evidencia directa in vivo de que las cargas proteicas basadas en lípidos se clasifican en sitios de exportación selectivos en la vía secretora, y revela la importancia de la longitud de la cadena acilo para la selectividad de clasificación. Utilizando una técnica de microscopía potente y de vanguardia llamada SCLIM, demostramos la recién sintetizada Gas1-GFP (una GPI-AP principal de la membrana plasmática con una porción lipídica de ceramida de cadena acilo muy larga (C26)) en levadura. Las regiones agrupadas en RE discretos están asociadas con ERES específicos, mientras que las proteínas secretadas transmembrana se distribuyen por toda la membrana del RE (Figura 1). Además, estos dos tipos de productos entran selectivamente en diferentes ERES (Figura 2). La longitud de la cadena acilo de la ceramida celular en la membrana se reduce de C26 a C18-C16, el grupo Gas1-GFP se disgrega en la región discreta del RE, y Gas1-GFP se redirige para salir del RE con la proteína transmembrana a través del mismo ERES (Figura 3 y Figura 3). 4).
Aunque GPI-AP utiliza un mecanismo proteico especializado para salir del RE, encontramos que la separación dependiente de ceramida C26 no depende de interacciones proteicas diferenciales que puedan conducir a la especialización de ERES (Figuras S4 y S5). En cambio, nuestros hallazgos respaldan un mecanismo de clasificación alternativo impulsado por la agrupación de proteínas basada en lípidos y la posterior exclusión de otras cargas. Nuestras observaciones indican que la región o grupo Gas1-GFP asociado con un ERES específico carece de la proteína transmembrana secretada Mid2-iRFP, lo que indica que el grupo GPI-AP dependiente de ceramida C26 facilitará su entrada en el ERES relevante y, al mismo tiempo, excluirá las secreciones transmembrana que entran en este ERES en particular (Figuras 1 y 2). Por el contrario, la presencia de ceramidas C18-C16 en la membrana del RE no hace que GPI-AP forme regiones o grupos, por lo que no excluyen ni reemplazan las proteínas transmembrana secretadas en el mismo ERES (Figuras 3 y 4). Por lo tanto, proponemos que la ceramida C26 impulsa la separación y clasificación al facilitar la agrupación de proteínas vinculadas a ERES específicos.
¿Cómo lograr este agrupamiento dependiente de ceramida C26 en un área específica del RE? La tendencia de la ceramida de membrana a separarse lateralmente puede hacer que GPI-AP y la ceramida C26 formen lípidos pequeños y ordenados instantáneamente en el entorno lipídico más irregular de la membrana del RE que contiene glicerolípidos más cortos e insaturados. Clústeres de calidad (17, 18). Estos pequeños clústeres temporales pueden fusionarse aún más en clústeres más grandes y estables después de unirse al complejo p24 (34). Congruente con esto, mostramos que C26 Gas1-GFP necesita interactuar con el complejo p24 para formar clústeres visibles más grandes (Figura 3). El complejo p24 es un oligómero heterocigoto compuesto por cuatro proteínas transmembrana p24 diferentes en levadura (35), que proporciona una unión multivalente, que puede conducir al entrecruzamiento de pequeños clústeres de GPI-AP, generando así un clúster estable más grande (34). La interacción entre los ectodominios proteicos de GPI-AP también puede contribuir a su agregación, como se muestra durante su transporte de Golgi en células epiteliales polarizadas de mamíferos (36). Sin embargo, cuando la ceramida C18-C16 está presente en la membrana del RE, cuando el complejo p24 se une a Gas1-GFP, no se formarán grandes cúmulos separados. El mecanismo subyacente puede depender de las propiedades físicas y químicas específicas de la ceramida de cadena acilo larga. Los estudios biofísicos de membranas artificiales muestran que, aunque tanto las ceramidas de cadena acilo larga (C24) como las cortas (C18-C16) pueden causar separación de fases, solo las ceramidas de cadena acilo larga (C24) pueden promover una alta curvatura y flexión de la película para remodelarla. A través de referencia mutua (17, 37, 38). Se ha demostrado que la hélice transmembrana de TMED2, el homólogo humano de Emp24, interactúa selectivamente con la esfingomielina basada en ceramida C18 en los lóbulos citoplasmáticos (39). Mediante simulaciones de dinámica molecular (DM), encontramos que tanto las ceramidas C18 como las C26 se acumulan alrededor de los lóbulos citoplasmáticos de la hélice transmembrana de Emp24, y tienen preferencias similares (Figura S6). Cabe destacar que esto indica que la hélice transmembrana de Emp24 puede conducir a una distribución asimétrica de lípidos en la membrana. Este es un resultado reciente basado en células de mamíferos. Simulaciones de DM similares también muestran la presencia de lípidos éter (40). Por lo tanto, especulamos que la ceramida C26 en los dos lóbulos de ER26 está enriquecida localmente. Cuando GPI-AP en los lobulillos luminales se une directamente a p24 multivalente y la acumulación de ceramida C26 alrededor de p24 en los lobulillos citoplasmáticos, puede promover la agregación de proteínas y la curvatura de la membrana que se generan a través de los dedos (41), lo que hace que GPI-AP se separe en regiones discretas adyacentes a ERES, lo que también favorece las regiones altamente curvadas de la membrana del RE (42). Informes anteriores respaldaron el mecanismo propuesto (43, 44). La unión multivalente de oligolectinas, patógenos o anticuerpos a los glicoesfingolípidos (GSL) basados ​​en ceramida en la membrana plasmática desencadena una gran agregación de GSL, mejora la separación de fases y causa deformación e internalización de la membrana (44). Iwabuchi et. (43) Se encontró que en presencia de cadenas acilo largas (C24) pero no cortas (C16), el ligando multivalente unido a la lactosilceramida GSL indujo la formación de grandes cúmulos e invaginación de la membrana, y la transducción de señales mediada por Lyn citoplasmática en las hojuelas está interdigitada por cadenas acilo en neutrófilos acoplados.
En las células epiteliales polarizadas de mamíferos, la concentración de la red anti-Golgi (TGN) a nivel de la membrana plasmática apical controla la separación y clasificación de GPI-AP (10, 45). Esta agregación es impulsada por la oligomerización de GPI-AP (36), pero también puede depender de la longitud de la cadena de ceramida que encontramos en levaduras. Aunque el GPI-AP de mamíferos tiene un anclaje basado en lípidos éter, y su estructura química es muy diferente de la ceramida de cadena acilo muy larga, un estudio reciente encontró que ambos lípidos tienen propiedades físicas y químicas evolutivamente similares y función (40). Por lo tanto, la parte de lípido éter en las células de mamíferos puede ser similar a la ceramida C26 en levaduras, y su función es asociarse con la ceramida de cadena larga en la membrana para promover la agregación y clasificación de GPI-AP. Aunque esta posibilidad aún debe comprobarse directamente, estudios previos sugieren que el transporte de la ceramida de cadena acilo larga al aparato de Golgi no se realiza mediante proteínas de transferencia citoplasmáticas, sino que depende de la síntesis de anclajes GPI, como en la levadura. Por lo tanto, el mecanismo conservado evolutivamente parece ser capaz de cotransportar selectivamente ceramida de cadena acilo muy larga y GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) en la misma vesícula de transporte.
En los sistemas de células epiteliales polarizadas de levadura y mamíferos, la agregación de GPI-AP y la separación de otras proteínas de la membrana plasmática ocurren antes de llegar a la superficie celular. Paladino et al. (48) encontraron que en el TGN de ​​las células epiteliales polarizadas de mamíferos, el agrupamiento de GPI-AP no solo es necesario para la clasificación selectiva de GPI-AP a la membrana plasmática apical, sino que también regula la organización del agrupamiento de GPI-AP y su actividad biológica. Superficie celular. En levadura, este estudio mostró que el agrupamiento de GPI-AP dependiente de ceramida C26 en el RE puede regular la organización del agrupamiento y la actividad funcional de GPI-AP en la membrana plasmática (24, 49). De acuerdo con este modelo, las células GhLag1 son alérgicas a los inhibidores de GPI o a los fármacos que afectan la integridad de la pared celular (28), y la necesidad de agrupamientos funcionales de Gas1-GFP (49) de la punta de ceramida proyectada en el apareamiento de las células de levadura indica posibles consecuencias fisiológicas de las células hLag1. Error de GPI-AP. Sin embargo, nuestra investigación futura consistirá en comprobar si la organización funcional de la superficie celular ha sido programada desde el RE mediante un método de clasificación basado en la longitud de los lípidos.
Las cepas de Saccharomyces cerevisiae utilizadas en este trabajo se enumeran en la Tabla S1. Las cepas MMY1583 y MMY1635 de SCLIM para imágenes de células vivas se construyeron en el fondo de W303. Estas cepas que expresan Sec13-mCherry con una etiqueta de proteína fluorescente se construyeron utilizando un método basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el plásmido pFA6a como plantilla (23). La cepa que expresa Mid2-iRFP marcada con proteína fluorescente bajo el control del promotor GAL1 se construyó de la siguiente manera. Amplificación por PCR de la secuencia iRFP-KanMx del vector pKTiRFP-KAN (donación de E. O'Shea, número de plásmido Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identificador de recursos de investigación (RRID): Addgene_64687) E insertada en el extremo C-terminal de Mid2 endógeno. Tras amplificar la secuencia genómica de Mid2-iRFP y clonarla en el promotor GAL1, se integró en el sitio Not I-Sac I del plásmido de integración pRS306. El plásmido resultante, pRGS7, se linealizó con Pst I para integrarlo en el locus URA3.
El gen de fusión Gas1-GFP se expresa bajo el control del promotor GAL1 en el plásmido del centrómero (CEN), que se construye de la siguiente manera. La secuencia Gas1-GFP se amplificó por PCR a partir del plásmido pRS416-GAS1-GFP (24) (donación de L. Popolo) y se clonó en el sitio Xma I–Xho I del plásmido CEN pBEVY-GL LEU2 (donación de C) Miller; número de plásmido Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). El plásmido resultante se denominó pRGS6. El gen de fusión Axl2-GFP también se expresa bajo el control del promotor GAL1 del vector pBEVY-GL LEU2, y su construcción es la siguiente. La secuencia Axl2-GFP se amplificó a partir del plásmido pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) mediante PCR y se clonó en el sitio Bam HI-Pst I del vector pBEVY-GL LEU2. El plásmido resultante se denominó pRGS12. La secuencia de los oligonucleótidos utilizados en este estudio se muestra en la Tabla S2.
La cepa se suplementó con 0,2 % de adenina y 2 % de glucosa [YP-dextrosa (YPD)], 2 % de rafinosa [YP-rafinosa], proteína de extracto de levadura p (YP) (1 % de extracto de levadura y 2 % de proteína ept). (YPR)] o 2 % de galactosa [YP-galactosa (YPG)] como fuente de carbono, o en un medio mínimo sintético (0,15 % de base de nitrógeno de levadura y 0,5 % de sulfato de amonio) para suplementar los aminoácidos y bases apropiados necesarios para la nutrición, y que contiene 2 % de glucosa (medio mínimo de glucosa sintética) o 2 % de galactosa (medio mínimo de galactosa sintética) como fuente de carbono.
Para la obtención de imágenes en tiempo real, las células mutantes sec31-1 sensibles a la temperatura que expresan el constructo bajo el promotor GAL1 se cultivaron en medio YPR a 24 °C durante la noche hasta la fase logarítmica media. Tras la inducción en YPG a 24 °C durante 1 hora, las células se incubaron en SG a 37 °C durante 30 minutos y, posteriormente, se transfirieron a 24 °C para eliminar el bloqueo de secreción. Se utilizó concanavalina A para fijar las células en un portaobjetos y se obtuvieron imágenes mediante SCLIM. SCLIM es una combinación de microscopio de fluorescencia invertido Olympus IX-71 y lente de aceite UPlanSApo de 100×1.4 de apertura numérica (Olympus), escáner confocal de disco giratorio de alta velocidad y alta relación señal-ruido (Yokogawa Electric), espectrómetro personalizado y refrigeración personalizada. El intensificador de imagen del sistema (Hamamatsu Photonics) puede proporcionar un sistema de lentes de aumento con un aumento final de ×266.7 y una cámara de dispositivo de carga acoplada que multiplica electrones (Hamamatsu Photonics) (21). La adquisición de imágenes se realiza mediante software personalizado (Yokogawa Electric). Para imágenes 3D, utilizamos un actuador piezoeléctrico hecho a medida para vibrar la lente del objetivo verticalmente y recolectamos las partes ópticas separadas 100 nm en una pila. La imagen de pila Z se convierte en datos de vóxel 3D, y la función de dispersión de punto teórica utilizada para el microscopio confocal de disco giratorio se utiliza para el procesamiento de deconvolución mediante el software Volocity (PerkinElmer). Mediante el software Volocity, que establece automáticamente el umbral para el análisis de colocalización, se midió la presencia de ERES, incluyendo la carga. El análisis de escaneo lineal se realizó con el software MetaMorph (Molecular Devices).
Utilice el software GraphPad Prism para determinar la significación estadística. Para la prueba t de Student de dos colas y la prueba de análisis de varianza (ANOVA) unidireccional ordinaria, las diferencias entre grupos se consideran significativas si P < 0,05 (*).
Para la microscopía de fluorescencia de Gas1-GFP, las células en fase logarítmica se cultivaron durante la noche en YPD y se recolectaron por centrifugación, se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato y se incubaron en hielo durante al menos 15 minutos, y luego se procedió bajo el microscopio como se describió previamente Check (24). Para la adquisición se utilizó el microscopio Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) equipado con una lente objetivo, filtro L5 (GFP), cámara Hamamatsu y software Application Suite X (LAS X).
Las muestras se desnaturalizaron con tampón de muestra SDS a 65 °C durante 10 minutos y luego se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (PAGE). Para el análisis de inmunoblot, se cargaron 10 μl de muestra por carril. Anticuerpo primario: Se utilizó anti-Gas1 policlonal de conejo a una dilución de 1:3000, anti-Emp24 policlonal de conejo a una dilución de 1:500 y anti-GFP policlonal de conejo (donado por H. Riezman) a una dilución de 1:3000. El anticuerpo monoclonal de ratón anti-Pgk1 se utilizó a una dilución de 1:5000 (donado por J. de la Cruz). Anticuerpo secundario: Inmunoglobulina G (IgG) de cabra anti-conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) utilizada a una dilución de 1:3000 (Pierce). Se utilizó IgG de cabra anti-ratón conjugada con HRP a una dilución de 1:3000 (Pierce). La zona de respuesta inmune se observó mediante el método de quimioluminiscencia del reactivo SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Como se describe en (31), se realizó un experimento de inmunoprecipitación natural en la fracción de RE enriquecida. En resumen, se lavaron las células de levadura con tampón TNE [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo y mezcla de inhibidores de proteasa) a 600 nm (OD600) a 100 densidad óptica dos veces. Se rompió con perlas de vidrio, y luego los restos celulares y las perlas de vidrio se eliminaron por centrifugación. El sobrenadante se centrifugó a 17.000 g durante 15 minutos a 4 °C. El precipitado se resuspendió en TNE y se añadió saponina digital a una concentración final del 1 %. La suspensión se incubó durante 1 hora con rotación a 4 °C, y luego los componentes insolubles se eliminaron por centrifugación a 13.000 g a 4 °C durante 60 minutos. Para la inmunoprecipitación de Gas1-GFP, primero se preincubó la muestra con perlas de agarosa vacías (ChromoTek) a 4 °C durante 1 hora, y luego se incubó con GFP-Trap_A (ChromoTek) a 4 °C durante 3 horas. Las perlas inmunoprecipitadas se lavaron cinco veces con TNE que contenía 0,2 % de digoxigenina, se eluyeron con tampón de muestra SDS, se separaron mediante SDS-PAGE y se analizaron mediante inmunoblot.
Tal como se describe en (31), la determinación de la reticulación se realizó en la fracción de RE enriquecida. Brevemente, la fracción de RE enriquecida se incubó con 0,5 mM de ditiobis(succinimidil propionato) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EE. UU.; 20 °C, 20 min). La reacción de reticulación se detuvo añadiendo glicina (concentración final de 50 mM, 5 minutos, 20 °C).
Como se describió previamente (50), se realizó un análisis de MS de ceramida en cepas de tipo salvaje y GhLag1. En resumen, las células se cultivaron hasta la fase exponencial (3 a 4 unidades OD600/ml) en YPD a 30 °C, y se cosecharon 25 × 10⁷ células. Su metabolismo se detuvo con ácido tricloroacético. Se utilizó un disolvente de extracción [etanol, agua, éter, piridina e hidróxido de amonio 4,2 N (15:15:5:1:0,018 v/v)] y 1,2 nmol de estándar interno de ceramida C17 (860517, Avanti polar lipid) calidad). Se utilizó un reactivo de monometilamina [metanol, agua, n-butanol y solución de metilamina (4:3:1:5 v/v)] para realizar una hidrólisis alcalina suave del extracto, y luego se utilizó n-butanol saturado con agua para desalinizar. Finalmente, el extracto se resuspendió en un solvente de modo positivo [cloroformo/metanol/agua (2:7:1) + 5 mM de acetato de amonio] y se inyectó en el espectrómetro de masas. Se realizó un monitoreo de reacciones múltiples (MRM) para la identificación y cuantificación de moléculas de esfingolípidos. El espectrómetro de masas de cuadrupolo terciario TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) está equipado con una fuente de iones de nanoflujo robótica Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) para el análisis de lípidos. La energía de colisión se optimizó para cada categoría de ceramida. Los datos de MS se obtuvieron en modo positivo. Para cada réplica biológica, la señal lipídica es la mediana de tres mediciones independientes.
Como se describe en (31), las células (800×107) que expresan Gas1-GFP se sometieron a inmunoprecipitación natural. El Gas1-GFP purificado se separó por SDS-PAGE y se transfirió a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF). La proteína se visualizó tiñendo el PVDF con negro amida. La banda de Gas1-GFP se cortó del PVDF y se lavó 5 veces con metanol y una vez con agua de grado de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). Al incubar la tira de membrana con 500 μl de NaOAc 0,3 M (pH 4,0), tampón y 500 μl de una mezcla de nitrito de sodio 1 M recién disuelta a 37 °C durante 3 horas, la fracción lipídica se libera de Gas1-GFP y se lisa Liberación de ceramida de fosfato de inosina entre glucosamina e inositol (51). Después de eso, la tira de membrana se lavó cuatro veces con agua de grado LC-MS, se secó a temperatura ambiente y se almacenó en una atmósfera de nitrógeno a -80 °C hasta el análisis. Como control, se utilizó una muestra en blanco de membrana de PVDF para cada experimento. El lípido extraído de Gas1-GFP se analizó luego por MS como se describe (50). En resumen, las tiras de PVDF que contenían GPI-lípido se resuspendieron en 75 μl de disolvente de molde negativo [cloroformo/metanol (1:2) + 5 mM de acetato de amonio] y se sometieron a análisis de especies de esfingolípidos mediante ionización por electrospray (ESI)-MRM/MS (TSQ Vantage). En este caso, los datos de MS se obtuvieron en modo de iones negativos.
Como se mencionó anteriormente, la porción lipídica del anclaje GPI se separó del GPI-AP marcado con [3H]-inositol (16). Los lípidos se separaron mediante cromatografía de capa fina utilizando un sistema de disolventes (55:45:10 cloroformo-metanol-0,25 % KCl) y se visualizaron utilizando FLA-7000 (Fujifilm).
Las células que expresaban Gas1-GFP (600×107) se lavaron dos veces con tampón TNE y se rompieron con perlas de vidrio, y luego se centrifugaron para eliminar los restos celulares y las perlas de vidrio. El sobrenadante se centrifugó a 17 000 g durante 1 hora a 4 °C. El precipitado se lavó en TNE y se incubó con 1 U de PI-PLC (Invitrogen) en TNE que contenía 0,2 % de saponina digital durante 1 hora a 37 °C. Después del tratamiento enzimático, la membrana se eliminó por centrifugación a 17 000 g a 4 °C durante 1 hora. Para inmunoprecipitar Gas1-GFP, el sobrenadante se incubó con GFP-Trap_A (ChromoTek) a 4 °C durante toda la noche. El Gas1-GFP purificado separado por SDS-PAGE se tiñó con azul brillante de Coomassie. La banda de tinción Gas1-GFP se cortó del gris que rodeaba el acueducto, y luego, después de la alquilación con yodoacetamida y la reducción con ditiotreitol, se realizó la digestión en gel con tripsina. Extraer y secar los péptidos trípticos y los péptidos con glicanos GPI. El péptido seco se disolvió en 20 μl de agua. Inyectar una porción (8 μl) en el LC. Se utilizó una columna de octadecilsilano (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diámetro interno 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, Prefectura de Aichi, Japón) para separar los péptidos bajo condiciones de gradiente específicas. La fase móvil es el solvente A (ácido fórmico al 0,08 %) y el solvente B (ácido fórmico al 0,15 % en acetonitrilo al 80 %). Se utilizó un sistema HPLC Accela (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) para eluir la columna con el solvente A en 55 minutos a un caudal de 50 μl min-1 durante 5 minutos, y luego se aumentó la concentración del solvente B al 40%. , Estados Unidos). El eluato se introdujo continuamente en la fuente de iones ESI, y los péptidos trípticos y los péptidos con glicanos GPI se analizaron mediante LTQ Orbitrap XL (espectrómetro de masas híbrido de trampa de iones lineal-orbitrap; Thermo Fisher Scientific). En la configuración de MS, el voltaje de la fuente capilar se ajustó a 4,5 kV, y la temperatura del capilar de transferencia se mantuvo a 300 °C. El voltaje del capilar y el voltaje de la lente del tubo se ajustaron a 15 V y 50 V, respectivamente. Los datos de MS se obtuvieron en modo de iones positivos (resolución de 60 000; precisión de masa de 10 partes por millón) en un rango de masa de 300/m/z relación masa/carga (m/z) 3000. Los datos de MS/MS se obtienen a través de la trampa de iones en el LTQ Orbitrap XL [los primeros 3 dígitos de los que dependen los datos, disociación inducida por colisión (CID)].
Las simulaciones de MD se realizaron utilizando el software GROMACS (52) y el campo de fuerza MARTINI 2 (53-55). Luego se utilizó el CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) para construir una bicapa que contenía dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) y Cer C18 o DOPC y Cer C26. La topología y las coordenadas de Cer C26 se derivan de DXCE eliminando las perlas adicionales de la cola de esfingosina. Utilice el proceso descrito a continuación para equilibrar la doble capa y ejecutarla, luego use las últimas coordenadas del sistema para construir un sistema que contenga Emp24. El dominio transmembrana de Emp24 de levadura (residuos 173 a 193) se construyó como una α-hélice utilizando la herramienta de estructura molecular visual MD (VMD) (58). Luego, después de eliminar los lípidos superpuestos, la proteína se granuló gruesamente y se insertó en la bicapa utilizando CHARMM GUI. El sistema final contiene 1202 DOPC y 302 Cer C26 o 1197 DOPC y 295 Cer C18 y Emp24. Ionice el sistema a una concentración de 0,150 M. Se realizaron cuatro réplicas independientes para dos composiciones de bicapa.
La bicapa lipídica se equilibra mediante el proceso CHARMM GUI, que consiste en minimizar y luego equilibrar 405 000 pasos, donde las restricciones de posición se reducen y eliminan gradualmente, y el paso de tiempo se incrementa de 0,005 ps a 0,02 ps. Tras el equilibrio, se obtienen 6 µs con un paso de tiempo de 0,02 ps. Después de insertar Emp24, se utiliza el mismo proceso CHARMM GUI para minimizar y equilibrar el sistema, y ​​luego se ejecuta durante 8 s en producción.
Para todos los sistemas, durante el proceso de balanceo, la presión se controla mediante el barostato de Berendsen (59), y durante el proceso de producción, la presión se controla mediante el barostato de Parrinello-Rahman (60). En todos los casos, la presión promedio es de 1 bar y se utiliza un esquema de acoplamiento de presión semiisotrópico. En el proceso de balanceo y producción, se utiliza un termostato (61) con recalibración de velocidad para acoplar la temperatura de las partículas de proteína, lípido y disolvente respectivamente. Durante toda la operación, la temperatura objetivo es de 310 K. La interacción no enlazante se calcula generando una lista de emparejamiento utilizando el esquema de Verlet con una tolerancia de tampón de 0,005. El término de Coulomb se calcula utilizando el campo de reacción y una distancia de corte de 1,1 nm. El término de Van der Waals utiliza un esquema de corte con una distancia de corte de 1,1 nm, y se utiliza el esquema de corte de Verlet para la deriva potencial (62).
Utilizando VMD, la longitud de onda de corte entre las perlas de fosfato DOPC o las perlas de ceramida AM1 y la proteína es de 0,7 nm, y se calcula el número de lípidos que interactúan con la proteína. Según la siguiente fórmula, calcule el factor de agotamiento-enriquecimiento (DE) como en (63): factor DE = (cantidad de lípidos totales en la proteína 0,7) en la proteína 0,7 (cantidad de Cer en los lípidos totales)
El valor reportado se obtiene como un promedio, y las barras de error representan cuatro copias independientes del error estándar (EE). La significancia estadística del factor DE se calcula mediante la prueba t [(promedio del factor DE - 1) / EE]. Calcule el valor p a partir de la distribución unilateral.
Se utilizó la herramienta GROMACS para calcular el mapa de densidad lateral bidimensional del sistema que contiene Emp24 durante los últimos 250 ns del registro. Para obtener el mapa de enriquecimiento/agotamiento de ceramida, se dividió el mapa de densidad de Cer entre la suma de los mapas de Cer y DOPC, y posteriormente entre la concentración de Cer en el organismo. Se empleó la misma escala de color.
Para consultar los materiales complementarios de este artículo, visite http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
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Las imágenes tridimensionales de alta resolución en tiempo real revelan la importancia de la longitud de la cadena de ceramida para la clasificación de proteínas en sitios de salida selectivos.
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©2020 Asociación Estadounidense para el Avance de la Ciencia. reservados todos los derechos. AAAS es socio de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef y COUNTER. Avances científicos ISSN 2375-2548.