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El sulfuro de hidrógeno (H₂S) tiene múltiples efectos fisiológicos y patológicos en el cuerpo humano. El hidrosulfuro de sodio (NaHS) se usa ampliamente como herramienta farmacológica para evaluar los efectos del H₂S en experimentos biológicos. Aunque la pérdida de H₂S de las soluciones de NaHS toma solo unos minutos, las soluciones de NaHS se han usado como compuestos donantes de H₂S en el agua potable en algunos estudios con animales. Este estudio investigó si el agua potable con una concentración de NaHS de 30 μM preparada en botellas para ratas/ratones podría permanecer estable durante al menos 12-24 horas, como sugieren algunos autores. Prepare una solución de NaHS (30 μM) en agua potable y viértala inmediatamente en botellas de agua para ratas/ratones. Se recogieron muestras de la punta y del interior de la botella de agua a las 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 y 24 horas para medir el contenido de sulfuro utilizando el método del azul de metileno. Además, se inyectó NaHS (30 μM) a ratas macho y hembra durante dos semanas y se midieron las concentraciones séricas de sulfuro cada dos días durante la primera semana y al final de la segunda semana. La solución de NaHS en la muestra obtenida de la punta de la botella de agua fue inestable; disminuyó en un 72% y un 75% después de 12 y 24 horas, respectivamente. En las muestras obtenidas del interior de las botellas de agua, la disminución de NaHS no fue significativa en 2 horas; sin embargo, disminuyó en un 47% y un 72% después de 12 y 24 horas, respectivamente. La inyección de NaHS no afectó el nivel sérico de sulfuro de ratas macho y hembra. En conclusión, las soluciones de NaHS preparadas a partir de agua potable no deben usarse para la donación de H2S porque la solución es inestable. Esta vía de administración expondrá a los animales a cantidades irregulares y más pequeñas de lo esperado de NaHS.
El sulfuro de hidrógeno (H2S) se ha utilizado como toxina desde 1700; sin embargo, su posible papel como molécula de bioseñalización endógena fue descrito por Abe y Kimura en 1996. Durante las últimas tres décadas, se han dilucidado numerosas funciones del H2S en varios sistemas humanos, lo que llevó a la conclusión de que las moléculas donantes de H2S pueden tener aplicaciones clínicas en el tratamiento o manejo de ciertas enfermedades; véase Chirino et al. para una revisión reciente.
El hidrosulfuro de sodio (NaHS) se ha utilizado ampliamente como herramienta farmacológica para evaluar los efectos del H₂S en numerosos estudios con cultivos celulares y animales5,6,7,8. Sin embargo, el NaHS no es un donante ideal de H₂S, ya que se convierte rápidamente en H₂S/HS₁ en solución, se contamina fácilmente con polisulfuros y se oxida y volatiliza con facilidad4,9. En muchos experimentos biológicos, el NaHS se disuelve en agua, lo que provoca volatilización pasiva y pérdida de H₂S10,11,12, oxidación espontánea de H₂S11,12,13 y fotólisis14. El sulfuro en la solución original se pierde muy rápidamente debido a la volatilización de H₂S11. En un recipiente abierto, la vida media (t½) del H₂S es de aproximadamente 5 minutos y su concentración disminuye aproximadamente un 13 % por minuto10. Aunque la pérdida de sulfuro de hidrógeno de las soluciones de NaHS toma solo unos minutos, algunos estudios en animales han utilizado soluciones de NaHS como fuente de sulfuro de hidrógeno en el agua potable durante 1 a 21 semanas, reemplazando la solución que contiene NaHS cada 12 a 24 horas.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Esta práctica no es consistente con los principios de la investigación científica, ya que las dosis de los medicamentos deben basarse en su uso en otras especies, especialmente en humanos.27
La investigación preclínica en biomedicina busca mejorar la calidad de la atención al paciente o los resultados de sus tratamientos. Sin embargo, los resultados de la mayoría de los estudios en animales aún no se han aplicado a humanos28,29,30. Una de las razones de este fracaso es la falta de atención a la calidad metodológica de los estudios en animales30. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue investigar si las soluciones de NaHS de 30 μM preparadas en botellas de agua para ratas/ratones podían permanecer estables en el agua potable durante 12-24 h, como se afirma o sugiere en algunos estudios.
Todos los experimentos de este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices publicadas para el cuidado y uso de animales de laboratorio en Irán31. Todos los informes experimentales de este estudio también siguieron las directrices ARRIVE32. El Comité de Ética del Instituto de Ciencias Endocrinas de la Universidad de Ciencias Médicas Shahid Beheshti aprobó todos los procedimientos experimentales de este estudio.
El acetato de zinc dihidratado (CAS: 5970-45-6) y el cloruro férrico anhidro (CAS: 7705-08-0) se adquirieron de Biochem, Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, Francia). El hidrosulfuro de sodio hidratado (CAS: 207683-19-0) y la N,N-dimetil-p-fenilendiamina (DMPD) (CAS: 535-47-0) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El isoflurano se adquirió de Piramal (Bethlehem, PA, EE. UU.). El ácido clorhídrico (HCl) se adquirió de Merck (Darmstadt, Alemania).
Prepare una solución de NaHS (30 μM) en agua potable y viértala inmediatamente en las botellas de agua de la rata/ratón. Esta concentración se eligió con base en numerosas publicaciones que utilizan NaHS como fuente de H₂S; consulte la sección de Discusión. NaHS es una molécula hidratada que puede contener cantidades variables de agua de hidratación (es decir, NaHS•xH₂O); según el fabricante, el porcentaje de NaHS utilizado en nuestro estudio fue del 70,7 % (es decir, NaHS•1,3 H₂O), y tomamos este valor en cuenta en nuestros cálculos, donde utilizamos un peso molecular de 56,06 g/mol, que es el peso molecular del NaHS anhidro. El agua de hidratación (también llamada agua de cristalización) son las moléculas de agua que conforman la estructura cristalina33. Los hidratos tienen diferentes propiedades físicas y termodinámicas en comparación con los anhidratos34.
Antes de agregar NaHS al agua potable, mida el pH y la temperatura del solvente. Vierta inmediatamente la solución de NaHS en la botella de agua para ratas/ratones en la jaula de los animales. Se recogieron muestras de la punta y del interior de la botella de agua a las 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 y 24 h para medir el contenido de sulfuro. Las mediciones de sulfuro se tomaron inmediatamente después de cada muestreo. Obtuvimos muestras de la punta del tubo porque algunos estudios han demostrado que el pequeño tamaño de poro del tubo de agua puede minimizar la evaporación de H2S15,19. Este problema parece aplicarse también a la solución en la botella. Sin embargo, este no fue el caso de la solución en el cuello de la botella de agua, que tuvo una mayor tasa de evaporación y fue autooxidante; de ​​hecho, los animales bebieron esta agua primero.
Se utilizaron ratas Wistar macho y hembra en el estudio. Las ratas se alojaron en jaulas de polipropileno (2-3 ratas por jaula) en condiciones estándar (temperatura 21-26 °C, humedad 32-40%) con 12 h de luz (7 am a 7 pm) y 12 h de oscuridad (7 pm a 7 am). Las ratas tenían libre acceso a agua del grifo y se alimentaron con pienso estándar (Khorak Dam Pars Company, Teherán, Irán). Las ratas Wistar hembras (n = 10, peso corporal: 190-230 g) y machos (n = 10, peso corporal: 320-370 g) de la misma edad (6 meses) se dividieron aleatoriamente en grupos de control y tratados con NaHS (30 μM) (n = 5 por grupo). Para determinar el tamaño de la muestra, utilizamos el enfoque KISS (Keep It Simple, Stupid), que combina la experiencia previa y el análisis de potencia35. Primero realizamos un estudio piloto en 3 ratas y determinamos el nivel medio de sulfuro total en suero y la desviación estándar (8,1 ± 0,81 μM). Luego, considerando una potencia del 80% y asumiendo un nivel de significancia bilateral del 5%, determinamos un tamaño de muestra preliminar (n = 5 con base en la literatura previa) que correspondía a un tamaño del efecto estandarizado de 2,02 con el valor predefinido sugerido por Festing para calcular el tamaño de muestra de animales experimentales35. Después de multiplicar este valor por la DE (2,02 × 0,81), el tamaño del efecto detectable previsto (1,6 μM) fue del 20%, lo cual es aceptable. Esto significa que n = 5/grupo es suficiente para detectar un cambio medio del 20% entre los grupos. Las ratas se dividieron aleatoriamente en grupos de control y tratados con NaSH utilizando la función aleatoria del software Excel 36 (Fig. 1 suplementaria). Se realizó cegamiento a nivel de resultados y los investigadores que realizaron las mediciones bioquímicas no conocían las asignaciones de grupos.
Los grupos NaHS de ambos sexos fueron tratados con una solución de NaHS 30 μM preparada en agua de bebida durante 2 semanas; se suministró solución fresca cada 24 h, tiempo durante el cual se midió el peso corporal. Se recogieron muestras de sangre de las puntas de la cola de todas las ratas bajo anestesia con isoflurano cada dos días al final de la primera y la segunda semana. Las muestras de sangre se centrifugaron a 3000 g durante 10 min, se separó el suero y se almacenó a -80 °C para la posterior medición de urea sérica, creatinina (Cr) y sulfuro total. La urea sérica se determinó mediante el método enzimático de la ureasa, y la creatinina sérica se determinó mediante el método fotométrico de Jaffe utilizando kits disponibles comercialmente (Man Company, Teherán, Irán) y un analizador automático (Selectra E, número de serie 0-2124, Países Bajos). Los coeficientes de variación intraensayo e interensayo para la urea y el Cr fueron inferiores al 2,5 %.
El método del azul de metileno (MB) se utiliza para medir el sulfuro total en agua potable y suero que contiene NaHS; MB es el método más comúnmente utilizado para medir sulfuro en soluciones a granel y muestras biológicas11,37. El método MB se puede utilizar para estimar el pool total de sulfuro38 y medir sulfuros inorgánicos en forma de H2S, HS- y S2 en la fase acuosa39. En este método, el azufre se precipita como sulfuro de zinc (ZnS) en presencia de acetato de zinc11,38. La precipitación con acetato de zinc es el método más utilizado para separar sulfuros de otros cromóforos11. ZnS se redisolvió utilizando HCl11 en condiciones fuertemente ácidas. El sulfuro reacciona con DMPD en una proporción estequiométrica de 1:2 en una reacción catalizada por cloruro férrico (Fe3+ actúa como agente oxidante) para formar el colorante MB, que se detecta espectrofotométricamente a 670 nm40,41. El límite de detección del método MB es de aproximadamente 1 μM11.
En este estudio, se añadieron 100 μL de cada muestra (solución o suero) a un tubo; a continuación, se añadieron 200 μL de acetato de zinc (1 % p/v en agua destilada), 100 μL de DMPD (20 mM en HCl 7,2 M) y 133 μL de FeCl3 (30 mM en HCl 1,2 M). La mezcla se incubó a 37 °C en oscuridad durante 30 min. La solución se centrifugó a 10 000 g durante 10 min y se leyó la absorbancia del sobrenadante a 670 nm con un lector de microplacas (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, EE. UU.). Las concentraciones de sulfuro se determinaron con una curva de calibración de NaHS (0–100 μM) en ddH2O (Fig. 2 suplementaria). Todas las soluciones utilizadas para las mediciones se prepararon en el momento. Los coeficientes de variación intraensayo e interensayo para las mediciones de sulfuro fueron del 2,8 % y el 3,4 %, respectivamente. También se determinó el sulfuro total recuperado de muestras de agua potable y suero con tiosulfato de sodio mediante el método de muestra fortificada42. Las recuperaciones para las muestras de agua potable y suero con tiosulfato de sodio fueron del 91 ± 1,1 % (n = 6) y del 93 ± 2,4 % (n = 6), respectivamente.
El análisis estadístico se realizó con el software GraphPad Prism versión 8.0.2 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU., www.graphpad.com). Se empleó una prueba t pareada para comparar la temperatura y el pH del agua potable antes y después de la adición de NaHS. La pérdida de H₂S en la solución con NaHS se calculó como una disminución porcentual con respecto a la absorción basal y, para evaluar si la pérdida era estadísticamente significativa, se realizó un ANOVA de medidas repetidas de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett. Se compararon el peso corporal, la urea sérica, la creatinina sérica y el sulfuro sérico total a lo largo del tiempo entre ratas control y tratadas con NaHS de diferentes sexos mediante un ANOVA mixto de dos vías (entre-dentro) seguido de una prueba post hoc de Bonferroni. Los valores de p bilaterales < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
El pH del agua potable fue de 7,60 ± 0,01 antes de la adición de NaHS y de 7,71 ± 0,03 después de la adición de NaHS (n = 13, p = 0,0029). La temperatura del agua potable fue de 26,5 ± 0,2 y disminuyó a 26,2 ± 0,2 después de la adición de NaHS (n = 13, p = 0,0128). Prepare una solución de NaHS de 30 μM en agua potable y guárdela en una botella de agua. La solución de NaHS es inestable y su concentración disminuye con el tiempo. Al tomar muestras del cuello de la botella de agua, se observó una disminución significativa (68,0 %) en la primera hora, y el contenido de NaHS en la solución disminuyó en un 72 % y un 75 % después de 12 y 24 horas, respectivamente. En muestras obtenidas de botellas de agua, la reducción de NaHS no fue significativa hasta las 2 horas, pero después de 12 y 24 horas, disminuyó un 47 % y un 72 %, respectivamente. Estos datos indican que el porcentaje de NaHS en una solución de 30 μM preparada en agua potable disminuyó a aproximadamente una cuarta parte del valor inicial después de 24 horas, independientemente del lugar de muestreo (Figura 1).
Estabilidad de la solución de NaHS (30 μM) en agua potable en botellas de rata/ratón. Tras la preparación de la solución, se tomaron muestras de la punta y del interior de la botella. Los datos se presentan como media ± DE (n = 6/grupo). * y #, p < 0,05 en comparación con el tiempo 0. La fotografía de la botella muestra la punta (con la abertura) y el cuerpo. El volumen de la punta es de aproximadamente 740 μL.
La concentración de NaHS en la solución recién preparada de 30 μM fue de 30,3 ± 0,4 μM (rango: 28,7–31,9 μM, n = 12). Sin embargo, después de 24 h, la concentración de NaHS disminuyó a un valor inferior (media: 3,0 ± 0,6 μM). Como se muestra en la Figura 2, las concentraciones de NaHS a las que estuvieron expuestas las ratas no se mantuvieron constantes durante el período de estudio.
El peso corporal de las ratas hembra aumentó significativamente con el tiempo (de 205,2 ± 5,2 g a 213,8 ​​± 7,0 g en el grupo control y de 204,0 ± 8,6 g a 211,8 ± 7,5 g en el grupo tratado con NaHS); sin embargo, el tratamiento con NaHS no tuvo efecto sobre el peso corporal (Fig. 3). El peso corporal de las ratas macho aumentó significativamente con el tiempo (de 338,6 ± 8,3 g a 352,4 ± 6,0 g en el grupo control y de 352,4 ± 5,9 g a 363,2 ± 4,3 g en el grupo tratado con NaHS); sin embargo, el tratamiento con NaHS no tuvo efecto sobre el peso corporal (Fig. 3).
Cambios en el peso corporal en ratas hembra y macho tras la administración de NaHS (30 μM). Los datos se presentan como media ± EEM y se compararon mediante un análisis de varianza mixto de dos vías (intermedio) con la prueba post hoc de Bonferroni. n = 5 de cada sexo en cada grupo.
Las concentraciones séricas de urea y fosfato de creatina fueron comparables en las ratas control y tratadas con NaSH durante todo el estudio. Además, el tratamiento con NaSH no afectó las concentraciones séricas de urea y creatincromo (Tabla 1).
Las concentraciones séricas basales de sulfuro total fueron comparables entre las ratas macho (8,1 ± 0,5 μM frente a 9,3 ± 0,2 μM) y hembra (9,1 ± 1,0 μM frente a 6,1 ± 1,1 μM) del grupo control y las tratadas con NaHS. La administración de NaHS durante 14 días no tuvo efecto sobre los niveles séricos de sulfuro total en ratas macho ni hembra (Fig. 4).
Cambios en las concentraciones séricas totales de sulfuro en ratas macho y hembra tras la administración de NaHS (30 μM). Los datos se presentan como media ± EEM y se compararon mediante un análisis de varianza mixto (intra-intra) de dos vías con la prueba post hoc de Bonferroni. N = 5 por grupo para cada sexo.
La principal conclusión de este estudio es que el agua potable que contiene NaHS es inestable: solo se puede detectar aproximadamente una cuarta parte del contenido total inicial de sulfuro 24 horas después de tomar muestras de la punta y el interior de las botellas de agua de ratas y ratones. Además, las ratas estuvieron expuestas a concentraciones inestables de NaHS debido a la pérdida de H₂S en la solución de NaHS, y la adición de NaHS al agua potable no afectó el peso corporal, los niveles séricos de urea y cromo en la creatina, ni el sulfuro sérico total.
En este estudio, la tasa de pérdida de H₂S de soluciones de NaHS 30 μM preparadas en agua potable fue de aproximadamente un 3 % por hora. En una solución tamponada (sulfuro de sodio 100 μM en PBS 10 mM, pH 7,4), se informó que la concentración de sulfuro disminuyó un 7 % con el tiempo durante 8 h11. Anteriormente, hemos defendido la administración intraperitoneal de NaHS al informar que la tasa de pérdida de sulfuro de una solución de NaHS 54 μM en agua potable fue de aproximadamente un 2,3 % por hora (4 %/hora en las primeras 12 h y 1,4 %/hora en las últimas 12 h después de la preparación)8. Estudios anteriores43 encontraron una pérdida constante de H₂S de las soluciones de NaHS, principalmente debido a la volatilización y la oxidación. Incluso sin la adición de burbujas, el sulfuro en la solución madre se pierde rápidamente debido a la volatilización del H₂S11. Estudios han demostrado que durante el proceso de dilución, que dura entre 30 y 60 segundos, se pierde entre un 5 % y un 10 % de H₂S por evaporación6. Para evitar la evaporación de H₂S de la solución, los investigadores han tomado varias medidas, como agitar suavemente la solución12, cubrir la solución madre con una película de plástico6 y minimizar la exposición de la solución al aire, ya que la velocidad de evaporación de H₂S depende de la interfaz aire-líquido13. La oxidación espontánea de H₂S se produce principalmente debido a los iones de metales de transición, especialmente el hierro férrico, que son impurezas del agua13. La oxidación de H₂S da lugar a la formación de polisulfuros (átomos de azufre unidos por enlaces covalentes)11. Para evitar su oxidación, se preparan soluciones que contienen H₂S en disolventes desoxigenados44,45 y luego se purgan con argón o nitrógeno durante 20-30 min para asegurar la desoxigenación.11,12,37,44,45,46 El ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) es un quelante metálico (10–4 M) que previene la autooxidación de HS- en soluciones aeróbicas. En ausencia de DTPA, la tasa de autooxidación de HS- es de aproximadamente el 50% durante aproximadamente 3 h a 25 °C37,47. Además, dado que la oxidación del 1e-sulfuro es catalizada por luz ultravioleta, la solución debe almacenarse en hielo y protegida de la luz11.
Como se muestra en la Figura 5, el NaHS se disocia en Na+ y HS-6 al disolverse en agua; esta disociación está determinada por el pK1 de la reacción, que depende de la temperatura: pK1 = 3,122 + 1132/T, donde T varía de 5 a 30 °C y se mide en grados Kelvin (K), K = °C + 273,1548. El HS- tiene un pK2 elevado (pK2 = 19), por lo que a un pH < 96,49, no se forma S2- o se forma en cantidades muy pequeñas. Por el contrario, el HS- actúa como base y acepta H+ de una molécula de H2O, mientras que el H2O actúa como ácido y se convierte en H2S y OH-.
Formación de gas H₂S disuelto en solución de NaHS (30 µM). aq, solución acuosa; g, gas; l, líquido. Todos los cálculos asumen un pH del agua de 7,0 y una temperatura de 20 °C. Creado con BioRender.com.
A pesar de la evidencia de que las soluciones de NaHS son inestables, varios estudios en animales han utilizado soluciones de NaHS en agua potable como un compuesto donante de H₂S15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 con duraciones de intervención que oscilan entre 1 y 21 semanas (Tabla 2). Durante estos estudios, la solución de NaHS se renovó cada 12 h, 15, 17, 18, 24, 25 h o 24 h, 19, 20, 21, 22, 23 h. Nuestros resultados mostraron que las ratas estuvieron expuestas a concentraciones inestables del fármaco debido a la pérdida de H₂S de la solución de NaHS, y el contenido de NaHS en el agua potable de las ratas fluctuó significativamente a lo largo de 12 o 24 h (véase la Figura 2). Dos de estos estudios informaron que los niveles de H2S en el agua permanecieron estables durante 24 h22 o que solo se observaron pérdidas de H2S del 2 al 3 % durante 12 h15, pero no proporcionaron datos de respaldo ni detalles de las mediciones. Dos estudios han demostrado que el pequeño diámetro de las botellas de agua puede minimizar la evaporación de H2S15,19. Sin embargo, nuestros resultados mostraron que esto solo puede retrasar la pérdida de H2S de una botella de agua en 2 h en lugar de 12 a 24 h. Ambos estudios señalan que asumimos que el nivel de NaHS en el agua potable no cambió porque no observamos un cambio de color en el agua; por lo tanto, la oxidación de H2S por el aire no fue significativa19,20. Sorprendentemente, este método subjetivo evalúa la estabilidad de NaHS en el agua en lugar de medir el cambio en su concentración a lo largo del tiempo.
La pérdida de H2S en una solución de NaHS está relacionada con el pH y la temperatura. Como se señaló en nuestro estudio, disolver NaHS en agua da como resultado la formación de una solución alcalina50. Cuando se disuelve NaHS en agua, la formación de gas H2S disuelto depende del valor de pH6. Cuanto menor sea el pH de la solución, mayor será la proporción de NaHS presente como moléculas de gas H2S y más sulfuro se perderá de la solución acuosa11. Ninguno de estos estudios informó el pH del agua potable utilizada como disolvente para NaHS. Según las recomendaciones de la OMS, adoptadas por la mayoría de los países, el pH del agua potable debe estar en el rango de 6,5 a 8,551. En este rango de pH, la tasa de oxidación espontánea de H2S aumenta aproximadamente diez veces13. Disolver NaHS en agua en este rango de pH dará como resultado una concentración de gas H2S disuelto de 1 a 22,5 μM, lo que enfatiza la importancia de monitorear el pH del agua antes de disolver NaHS. Además, el rango de temperatura reportado en el estudio mencionado (18-26 °C) resultaría en un cambio en la concentración de gas H₂S disuelto en la solución de aproximadamente el 10 %, ya que los cambios de temperatura alteran el pK₁, y pequeños cambios en el pK₁ pueden tener un impacto significativo en la concentración de gas H₂S disuelto48. Además, la larga duración de algunos estudios (5 meses)22, durante la cual se espera una gran variabilidad de temperatura, también agrava este problema.
Todos los estudios excepto uno21 utilizaron una solución de NaHS de 30 μM en agua potable. Para explicar la dosis utilizada (es decir, 30 μM), algunos autores señalaron que el NaHS en la fase acuosa produce exactamente la misma concentración de gas H2S y que el rango fisiológico de H2S es de 10 a 100 μM, por lo que esta dosis está dentro del rango fisiológico15,16. Otros explicaron que 30 μM de NaHS pueden mantener el nivel plasmático de H2S dentro del rango fisiológico, es decir, 5–300 μM19,20. Consideramos la concentración de NaHS en agua de 30 μM (pH = 7,0, T = 20 °C), que se utilizó en algunos estudios para estudiar los efectos del H2S. Podemos calcular que la concentración de gas H2S disuelto es de 14,7 μM, que es aproximadamente el 50% de la concentración inicial de NaHS. Este valor es similar al valor calculado por otros autores en las mismas condiciones13,48.
En nuestro estudio, la administración de NaSH no modificó el peso corporal; este resultado concuerda con los resultados de otros estudios en ratones machos22,23 y ratas macho18. Sin embargo, dos estudios informaron que el NaSH restableció el peso corporal reducido en ratas nefrectomizadas24,26, mientras que otros estudios no informaron el efecto de la administración de NaSH sobre el peso corporal15,16,17,19,20,21,25. Además, en nuestro estudio, la administración de NaSH no afectó los niveles séricos de urea y cromo en la creatina, lo cual concuerda con los resultados de otro estudio25.
El estudio encontró que la adición de NaHS al agua potable durante 2 semanas no afectó las concentraciones séricas totales de sulfuro en ratas macho y hembra. Este hallazgo es consistente con los resultados de Sen et al. (16): 8 semanas de tratamiento con 30 μM de NaHS en agua potable no afectaron los niveles plasmáticos de sulfuro en ratas de control; sin embargo, informaron que esta intervención restauró los niveles disminuidos de H₂S en plasma de ratones nefrectomizados. Li et al. (22) también informaron que el tratamiento con 30 μM de NaHS en agua potable durante 5 meses aumentó los niveles plasmáticos de sulfuro libre en ratones de edad avanzada en aproximadamente un 26%. Otros estudios no han informado cambios en el sulfuro circulante después de la adición de NaHS al agua potable.
Siete estudios informaron el uso de NaHS de Sigma15,16,19,20,21,22,23, pero no proporcionaron más detalles sobre el agua de hidratación, y cinco estudios no mencionaron la fuente de NaHS utilizada en sus métodos de preparación17,18,24,25,26. El NaHS es una molécula hidratada y su contenido de agua de hidratación puede variar, lo que afecta la cantidad de NaHS necesaria para preparar una solución de una molaridad determinada. Por ejemplo, el contenido de NaHS en nuestro estudio fue de NaHS•1.3 H₂O. Por lo tanto, las concentraciones reales de NaHS en estos estudios podrían ser inferiores a las reportadas.
“¿Cómo puede un compuesto de vida tan corta tener un efecto tan duradero?” Pozgay et al.21 se plantearon esta pregunta al evaluar los efectos del NaHS en la colitis en ratones. Esperan que estudios futuros puedan responder a esta pregunta y especulan que las soluciones de NaHS pueden contener polisulfuros más estables además del H₂S y los disulfuros que median el efecto del NaHS21. Otra posibilidad es que concentraciones muy bajas de NaHS que permanecen en solución también puedan tener un efecto beneficioso. De hecho, Olson et al. proporcionaron evidencia de que los niveles micromolares de H₂S en la sangre no son fisiológicos y deberían estar en el rango nanomolar o completamente ausentes13. El H₂S puede actuar a través de la sulfatación de proteínas, una modificación postraduccional reversible que afecta la función, estabilidad y localización de muchas proteínas52,53,54. De hecho, en condiciones fisiológicas, aproximadamente entre el 10 % y el 25 % de muchas proteínas hepáticas están sulfiladas53. Ambos estudios reconocen la rápida destrucción de NaHS19,23 pero sorprendentemente afirman que “controlamos la concentración de NaHS en el agua potable reemplazándolo diariamente”.23 Un estudio declaró accidentalmente que “NaHS es un donante estándar de H2S y se usa comúnmente en la práctica clínica para reemplazar el propio H2S”.18
La discusión anterior muestra que el NaHS se pierde de la solución a través de la volatilización, oxidación y fotólisis, y por lo tanto se hacen algunas sugerencias para reducir la pérdida de H2S de la solución. Primero, la evaporación de H2S depende de la interfaz gas-líquido13 y el pH de la solución11; por lo tanto, para minimizar la pérdida por evaporación, el cuello de la botella de agua puede hacerse lo más pequeño posible como se describió anteriormente15,19, y el pH del agua puede ajustarse a un límite superior aceptable (es decir, 6,5–8,551) para minimizar la pérdida por evaporación11. Segundo, la oxidación espontánea de H2S ocurre debido a los efectos del oxígeno y la presencia de iones de metales de transición en el agua potable13, por lo que la desoxigenación del agua potable con argón o nitrógeno44,45 y el uso de quelantes metálicos37,47 pueden reducir la oxidación de sulfuros. Tercero, para prevenir la fotodescomposición de H2S, las botellas de agua pueden envolverse con papel de aluminio; Esta práctica también se aplica a materiales fotosensibles como la estreptozotocina55. Finalmente, las sales de sulfuro inorgánico (NaHS, Na₂S y CaS) pueden administrarse por sonda en lugar de disolverse en agua potable como se informó previamente56,57,58; los estudios han demostrado que el sulfuro de sodio radiactivo administrado por sonda a ratas se absorbe bien y se distribuye a prácticamente todos los tejidos59. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios han administrado sales de sulfuro inorgánico por vía intraperitoneal; sin embargo, esta vía rara vez se utiliza en entornos clínicos60. Por otro lado, la vía oral es la vía de administración más común y preferida en humanos61. Por lo tanto, recomendamos evaluar los efectos de los donantes de H₂S en roedores por sonda oral.
Una limitación es que medimos sulfuro en solución acuosa y suero usando el método MB. Los métodos para medir sulfuro incluyen titulación de yodo, espectrofotometría, método electroquímico (potenciometría, amperometría, método coulométrico y método amperométrico) y cromatografía (cromatografía de gases y cromatografía líquida de alta resolución), entre los cuales el método más comúnmente usado es el método espectrofotométrico MB62. Una limitación del método MB para medir H2S en muestras biológicas es que mide todos los compuestos que contienen azufre y no H2S libre63 porque se realiza en condiciones ácidas, lo que resulta en la extracción de azufre de la fuente biológica64. Sin embargo, según la Asociación Americana de Salud Pública, MB es el método estándar para medir sulfuro en agua65. Por lo tanto, esta limitación no afecta nuestros resultados principales sobre la inestabilidad de soluciones que contienen NaHS. Además, en nuestro estudio, la recuperación de las mediciones de sulfuro en muestras de agua y suero que contienen NaHS fue del 91% y 93%, respectivamente. Estos valores concuerdan con los rangos reportados previamente (77-92)66, lo que indica una precisión analítica aceptable42. Cabe destacar que utilizamos ratas macho y hembra de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH) para evitar una dependencia excesiva de estudios con animales exclusivamente machos en estudios preclínicos67 y para incluir ratas macho y hembra siempre que sea posible68. Este punto ha sido enfatizado por otros69,70,71.
En conclusión, los resultados de este estudio indican que las soluciones de NaHS preparadas a partir de agua potable no pueden utilizarse para generar H₂S debido a su inestabilidad. Esta vía de administración expondría a los animales a niveles de NaHS inestables e inferiores a los esperados; por lo tanto, los hallazgos podrían no ser aplicables a los humanos.
Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles a pedido razonable del autor correspondiente.
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