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El sulfuro de hidrógeno (H2S) tiene múltiples efectos fisiológicos y patológicos en el cuerpo humano. El hidrosulfuro de sodio (NaHS) se utiliza ampliamente como herramienta farmacológica para evaluar los efectos del H2S en experimentos biológicos. Aunque la pérdida de H2S de las soluciones de NaHS solo toma unos minutos, estas soluciones se han utilizado como compuestos donantes de H2S en agua potable en algunos estudios con animales. Este estudio investigó si el agua potable con una concentración de NaHS de 30 μM preparada en botellas para ratas/ratones podría permanecer estable durante al menos 12-24 horas, como sugieren algunos autores. Prepare una solución de NaHS (30 μM) en agua potable y viértala inmediatamente en botellas de agua para ratas/ratones. Se recolectaron muestras de la punta y del interior de la botella de agua a las 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 y 24 horas para medir el contenido de sulfuro utilizando el método del azul de metileno. Además, se inyectó NaHS (30 μM) a ratas macho y hembra durante dos semanas y se midieron las concentraciones de sulfuro sérico cada dos días durante la primera semana y al final de la segunda. La solución de NaHS en la muestra obtenida de la punta de la botella de agua fue inestable; disminuyó un 72 % y un 75 % después de 12 y 24 horas, respectivamente. En las muestras obtenidas del interior de las botellas de agua, la disminución de NaHS no fue significativa en 2 horas; sin embargo, disminuyó un 47 % y un 72 % después de 12 y 24 horas, respectivamente. La inyección de NaHS no afectó el nivel de sulfuro sérico de las ratas macho y hembra. En conclusión, las soluciones de NaHS preparadas a partir de agua potable no deben usarse para la donación de H2S debido a la inestabilidad de la solución. Esta vía de administración expondrá a los animales a cantidades irregulares y menores de lo esperado de NaHS.
El sulfuro de hidrógeno (H2S) se ha utilizado como toxina desde 1700; sin embargo, su posible función como molécula de bioseñalización endógena fue descrita por Abe y Kimura en 1996. En las últimas tres décadas, se han dilucidado numerosas funciones del H2S en diversos sistemas humanos, lo que ha llevado a la conclusión de que las moléculas donantes de H2S pueden tener aplicaciones clínicas en el tratamiento o manejo de ciertas enfermedades; véase Chirino et al. para una revisión reciente.
El hidrosulfuro de sodio (NaHS) se ha utilizado ampliamente como herramienta farmacológica para evaluar los efectos del H2S en muchos estudios de cultivo celular y en animales5,6,7,8. Sin embargo, el NaHS no es un donante ideal de H2S porque se convierte rápidamente en H2S/HS- en solución, se contamina fácilmente con polisulfuros y se oxida y volatiliza fácilmente4,9. En muchos experimentos biológicos, el NaHS se disuelve en agua, lo que resulta en volatilización pasiva y pérdida de H2S10,11,12, oxidación espontánea de H2S11,12,13 y fotólisis14. El sulfuro en la solución original se pierde muy rápidamente debido a la volatilización del H2S11. En un recipiente abierto, la vida media (t1/2) del H2S es de aproximadamente 5 minutos, y su concentración disminuye en aproximadamente un 13% por minuto10. Aunque la pérdida de sulfuro de hidrógeno de las soluciones de NaHS solo tarda unos minutos, algunos estudios en animales han utilizado soluciones de NaHS como fuente de sulfuro de hidrógeno en el agua potable durante 1 a 21 semanas, reemplazando la solución que contenía NaHS cada 12 a 24 horas.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Esta práctica no es coherente con los principios de la investigación científica, ya que las dosis de los fármacos deben basarse en su uso en otras especies, especialmente en humanos.27
La investigación preclínica en biomedicina tiene como objetivo mejorar la calidad de la atención al paciente o los resultados del tratamiento. Sin embargo, los resultados de la mayoría de los estudios en animales aún no se han extrapolado a humanos28,29,30. Una de las razones de este fracaso en la traslación es la falta de atención a la calidad metodológica de los estudios en animales30. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue investigar si las soluciones de NaHS de 30 μM preparadas en botellas de agua para ratas/ratones podían permanecer estables en el agua potable durante 12 a 24 horas, como se afirma o sugiere en algunos estudios.
Todos los experimentos de este estudio se realizaron de acuerdo con las directrices publicadas para el cuidado y uso de animales de laboratorio en Irán³¹. Asimismo, todos los informes experimentales de este estudio siguieron las directrices ARRIVE³². El Comité de Ética del Instituto de Ciencias Endocrinas de la Universidad de Ciencias Médicas Shahid Beheshti aprobó todos los procedimientos experimentales de este estudio.
El acetato de zinc dihidratado (CAS: 5970-45-6) y el cloruro férrico anhidro (CAS: 7705-08-0) se adquirieron de Biochem, Chemopharma (Cosne-sur-Loire, Francia). El hidrosulfuro de sodio hidratado (CAS: 207683-19-0) y la N,N-dimetil-p-fenilendiamina (DMPD) (CAS: 535-47-0) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El isoflurano se adquirió de Piramal (Bethlehem, PA, EE. UU.). El ácido clorhídrico (HCl) se adquirió de Merck (Darmstadt, Alemania).
Prepare una solución de NaHS (30 μM) en agua potable e inmediatamente viértala en los bebederos de ratas/ratones. Esta concentración se eligió con base en numerosas publicaciones que utilizan NaHS como fuente de H2S; consulte la sección de Discusión. El NaHS es una molécula hidratada que puede contener cantidades variables de agua de hidratación (es decir, NaHS•xH2O); según el fabricante, el porcentaje de NaHS utilizado en nuestro estudio fue del 70,7 % (es decir, NaHS•1,3 H2O), y tuvimos en cuenta este valor en nuestros cálculos, donde utilizamos un peso molecular de 56,06 g/mol, que es el peso molecular del NaHS anhidro. El agua de hidratación (también llamada agua de cristalización) son las moléculas de agua que componen la estructura cristalina33. Los hidratos tienen propiedades físicas y termodinámicas diferentes en comparación con los anhidratos34.
Antes de añadir NaHS al agua potable, mida el pH y la temperatura del disolvente. Inmediatamente, vierta la solución de NaHS en el bebedero de la rata/ratón en la jaula del animal. Se tomaron muestras de la punta y del interior del bebedero a las 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 y 24 h para medir el contenido de sulfuro. Las mediciones de sulfuro se tomaron inmediatamente después de cada muestreo. Obtuvimos muestras de la punta del tubo porque algunos estudios han demostrado que el pequeño tamaño de los poros del tubo de agua puede minimizar la evaporación de H2S15,19. Este problema parece aplicarse también a la solución en el bebedero. Sin embargo, este no fue el caso para la solución en el cuello del bebedero, que tenía una tasa de evaporación más alta y se estaba autooxidando; de hecho, los animales bebieron esta agua primero.
Se utilizaron ratas Wistar macho y hembra en el estudio. Las ratas se alojaron en jaulas de polipropileno (2-3 ratas por jaula) en condiciones estándar (temperatura 21-26 °C, humedad 32-40%) con 12 h de luz (7 a. m. a 7 p. m.) y 12 h de oscuridad (7 p. m. a 7 a. m.). Las ratas tuvieron libre acceso a agua del grifo y se alimentaron con pienso estándar (Khorak Dam Pars Company, Teherán, Irán). Ratas Wistar hembra (n=10, peso corporal: 190-230 g) y macho (n=10, peso corporal: 320-370 g) de la misma edad (6 meses) se dividieron aleatoriamente en grupos control y tratados con NaHS (30 μM) (n=5 por grupo). Para determinar el tamaño de la muestra, utilizamos el enfoque KISS (Keep It Simple, Stupid), que combina la experiencia previa y el análisis de potencia35. Primero realizamos un estudio piloto en 3 ratas y determinamos el nivel medio de sulfuro total en suero y la desviación estándar (8,1 ± 0,81 μM). Luego, considerando una potencia del 80% y asumiendo un nivel de significancia bilateral del 5%, determinamos un tamaño de muestra preliminar (n = 5 basado en la literatura previa) que correspondía a un tamaño del efecto estandarizado de 2,02 con el valor predefinido sugerido por Festing para calcular el tamaño de la muestra de animales experimentales35. Después de multiplicar este valor por la DE (2,02 × 0,81), el tamaño del efecto detectable predicho (1,6 μM) fue del 20%, lo cual es aceptable. Esto significa que n = 5/grupo es suficiente para detectar un cambio medio del 20% entre grupos. Las ratas se dividieron aleatoriamente en grupos control y tratados con NaSH usando la función aleatoria del software Excel 36 (Figura suplementaria 1). El enmascaramiento se realizó a nivel de resultados, y los investigadores que realizaron las mediciones bioquímicas desconocían la asignación de los grupos.
Los grupos NaHS de ambos sexos fueron tratados con una solución de NaHS de 30 μM preparada en agua potable durante 2 semanas; se suministró solución fresca cada 24 h, tiempo durante el cual se midió el peso corporal. Se recolectaron muestras de sangre de la punta de la cola de todas las ratas bajo anestesia con isoflurano cada dos días al final de la primera y segunda semana. Las muestras de sangre se centrifugaron a 3000 g durante 10 min, se separó el suero y se almacenó a –80 °C para la posterior medición de urea sérica, creatinina (Cr) y sulfuro total. La urea sérica se determinó mediante el método enzimático de la ureasa, y la creatinina sérica mediante el método fotométrico de Jaffe utilizando kits disponibles comercialmente (Man Company, Teherán, Irán) y un analizador automático (Selectra E, número de serie 0-2124, Países Bajos). Los coeficientes de variación intra e interensayo para la urea y la Cr fueron inferiores al 2,5 %.
El método del azul de metileno (AM) se utiliza para medir el sulfuro total en agua potable y suero que contiene NaHS; el AM es el método más comúnmente utilizado para medir el sulfuro en soluciones a granel y muestras biológicas11,37. El método del AM se puede utilizar para estimar el pool total de sulfuro38 y medir sulfuros inorgánicos en forma de H2S, HS- y S2 en la fase acuosa39. En este método, el azufre se precipita como sulfuro de zinc (ZnS) en presencia de acetato de zinc11,38. La precipitación con acetato de zinc es el método más utilizado para separar sulfuros de otros cromóforos11. El ZnS se redisolvió utilizando HCl11 en condiciones fuertemente ácidas. El sulfuro reacciona con DMPD en una proporción estequiométrica de 1:2 en una reacción catalizada por cloruro férrico (Fe3+ actúa como agente oxidante) para formar el colorante AM, que se detecta espectrofotométricamente a 670 nm40,41. El límite de detección del método MB es de aproximadamente 1 μM11.
En este estudio, se añadieron 100 μL de cada muestra (solución o suero) a un tubo; luego se añadieron 200 μL de acetato de zinc (1% p/v en agua destilada), 100 μL de DMPD (20 mM en HCl 7,2 M) y 133 μL de FeCl3 (30 mM en HCl 1,2 M). La mezcla se incubó a 37 °C en la oscuridad durante 30 min. La solución se centrifugó a 10 000 g durante 10 min, y la absorbancia del sobrenadante se leyó a 670 nm utilizando un lector de microplacas (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, EE. UU.). Las concentraciones de sulfuro se determinaron utilizando una curva de calibración de NaHS (0–100 μM) en ddH2O (Figura suplementaria 2). Todas las soluciones utilizadas para las mediciones se prepararon al momento. Los coeficientes de variación intra e interensayo para las mediciones de sulfuro fueron del 2,8 % y del 3,4 %, respectivamente. También determinamos el sulfuro total recuperado de muestras de agua potable y suero que contenían tiosulfato de sodio utilizando el método de muestras fortificadas42. Las recuperaciones para las muestras de agua potable y suero que contenían tiosulfato de sodio fueron del 91 ± 1,1 % (n = 6) y del 93 ± 2,4 % (n = 6), respectivamente.
El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism versión 8.0.2 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU., www.graphpad.com). Se utilizó una prueba t pareada para comparar la temperatura y el pH del agua potable antes y después de la adición de NaHS. La pérdida de H2S en la solución que contenía NaHS se calculó como una disminución porcentual con respecto a la captación basal, y para evaluar si la pérdida era estadísticamente significativa, realizamos un ANOVA de medidas repetidas unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. El peso corporal, la urea sérica, la creatinina sérica y el sulfuro sérico total a lo largo del tiempo se compararon entre ratas control y tratadas con NaHS de diferentes sexos utilizando un ANOVA mixto bidireccional (entre-dentro) seguido de una prueba post hoc de Bonferroni. Los valores de P bilaterales < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
El pH del agua potable fue 7,60 ± 0,01 antes de la adición de NaHS y 7,71 ± 0,03 después de la adición de NaHS (n = 13, p = 0,0029). La temperatura del agua potable fue 26,5 ± 0,2 y disminuyó a 26,2 ± 0,2 después de la adición de NaHS (n = 13, p = 0,0128). Prepare una solución de NaHS 30 μM en agua potable y guárdela en una botella de agua. La solución de NaHS es inestable y su concentración disminuye con el tiempo. Al tomar muestras del cuello de la botella de agua, se observó una disminución significativa (68,0%) durante la primera hora, y el contenido de NaHS en la solución disminuyó en un 72% y un 75% después de 12 y 24 horas, respectivamente. En las muestras obtenidas de botellas de agua, la reducción de NaHS no fue significativa hasta las 2 horas, pero después de 12 y 24 horas disminuyó en un 47 % y un 72 %, respectivamente. Estos datos indican que el porcentaje de NaHS en una solución de 30 μM preparada en agua potable se redujo a aproximadamente una cuarta parte del valor inicial después de 24 horas, independientemente del lugar de muestreo (Figura 1).
Estabilidad de la solución de NaHS (30 μM) en agua potable en botellas para ratas/ratones. Tras la preparación de la solución, se tomaron muestras de la punta y del interior de la botella. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (n = 6/grupo). * y #, P < 0,05 en comparación con el tiempo 0. La fotografía de la botella muestra la punta (con la abertura) y el cuerpo de la botella. El volumen de la punta es de aproximadamente 740 μL.
La concentración de NaHS en la solución de 30 μM recién preparada fue de 30,3 ± 0,4 μM (rango: 28,7–31,9 μM, n = 12). Sin embargo, después de 24 h, la concentración de NaHS disminuyó a un valor menor (media: 3,0 ± 0,6 μM). Como se muestra en la Figura 2, las concentraciones de NaHS a las que estuvieron expuestas las ratas no fueron constantes durante el período de estudio.
El peso corporal de las ratas hembras aumentó significativamente con el tiempo (de 205,2 ± 5,2 g a 213,8 ​​± 7,0 g en el grupo de control y de 204,0 ± 8,6 g a 211,8 ± 7,5 g en el grupo tratado con NaHS); sin embargo, el tratamiento con NaHS no tuvo efecto sobre el peso corporal (Fig. 3). El peso corporal de las ratas macho aumentó significativamente con el tiempo (de 338,6 ± 8,3 g a 352,4 ± 6,0 g en el grupo de control y de 352,4 ± 5,9 g a 363,2 ± 4,3 g en el grupo tratado con NaHS); sin embargo, el tratamiento con NaHS no tuvo efecto sobre el peso corporal (Fig. 3).
Cambios en el peso corporal de ratas hembras y machos tras la administración de NaHS (30 μM). Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM) y se compararon mediante un análisis de varianza mixto bidireccional (intragrupo-intergrupos) con la prueba post hoc de Bonferroni. n = 5 de cada sexo en cada grupo.
Las concentraciones séricas de urea y fosfato de creatina fueron comparables entre las ratas control y las tratadas con NaSH a lo largo del estudio. Además, el tratamiento con NaSH no afectó las concentraciones séricas de urea y creatinacromo (Tabla 1).
Las concentraciones séricas basales de sulfuro total fueron comparables entre las ratas control y las tratadas con NaHS, tanto machos (8,1 ± 0,5 μM frente a 9,3 ± 0,2 μM) como hembras (9,1 ± 1,0 μM frente a 6,1 ± 1,1 μM). La administración de NaHS durante 14 días no tuvo efecto sobre los niveles séricos de sulfuro total en ratas macho ni hembras (Fig. 4).
Cambios en las concentraciones séricas totales de sulfuro en ratas macho y hembra tras la administración de NaHS (30 μM). Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM) y se compararon mediante un análisis de varianza mixto bidireccional (intragrupo-intragrupo) con la prueba post hoc de Bonferroni. Cada sexo, n = 5/grupo.
La principal conclusión de este estudio es que el agua potable que contiene NaHS es inestable: solo se detecta aproximadamente una cuarta parte del contenido total inicial de sulfuro 24 horas después de tomar muestras de la punta y del interior de los bebederos para ratas y ratones. Además, las ratas estuvieron expuestas a concentraciones inestables de NaHS debido a la pérdida de H2S en la solución de NaHS, y la adición de NaHS al agua potable no afectó el peso corporal, la urea sérica, el cromo de la creatina ni el sulfuro sérico total.
En este estudio, la tasa de pérdida de H2S de soluciones de NaHS de 30 μM preparadas en agua potable fue de aproximadamente un 3 % por hora. En una solución tamponada (sulfuro de sodio de 100 μM en PBS de 10 mM, pH 7,4), se informó que la concentración de sulfuro disminuyó un 7 % con el tiempo durante 8 h11. Anteriormente hemos defendido la administración intraperitoneal de NaHS al informar que la tasa de pérdida de sulfuro de una solución de NaHS de 54 μM en agua potable fue de aproximadamente un 2,3 % por hora (4 %/hora en las primeras 12 h y 1,4 %/hora en las últimas 12 h después de la preparación)8. Estudios anteriores43 encontraron una pérdida constante de H2S de las soluciones de NaHS, principalmente debido a la volatilización y oxidación. Incluso sin la adición de burbujas, el sulfuro en la solución madre se pierde rápidamente debido a la volatilización de H2S11. Los estudios han demostrado que durante el proceso de dilución, que dura entre 30 y 60 segundos, se pierde entre un 5 y un 10 % de H2S debido a la evaporación6. Para evitar la evaporación de H2S de la solución, los investigadores han tomado varias medidas, entre ellas agitar suavemente la solución12, cubrir la solución madre con una película de plástico6 y minimizar la exposición de la solución al aire, ya que la velocidad de evaporación del H2S depende de la interfaz aire-líquido.13 La oxidación espontánea del H2S se produce principalmente debido a los iones de metales de transición, especialmente el hierro férrico, que son impurezas en el agua.13 La oxidación del H2S da como resultado la formación de polisulfuros (átomos de azufre unidos por enlaces covalentes)11. Para evitar su oxidación, las soluciones que contienen H2S se preparan en disolventes desoxigenados44,45 y luego se purgan con argón o nitrógeno durante 20–30 min para asegurar la desoxigenación.11,12,37,44,45,46 El ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) es un quelante de metales (10–4 M) que previene la autooxidación de HS- en soluciones aeróbicas. En ausencia de DTPA, la tasa de autooxidación de HS- es aproximadamente del 50% en aproximadamente 3 h a 25 °C37,47. Además, dado que la oxidación del sulfuro de 1e es catalizada por luz ultravioleta, la solución debe almacenarse en hielo y protegida de la luz11.
Como se muestra en la Figura 5, el NaHS se disocia en Na+ y HS-6 cuando se disuelve en agua; esta disociación está determinada por el pK1 de la reacción, que depende de la temperatura: pK1 = 3,122 + 1132/T, donde T varía de 5 a 30 °C y se mide en grados Kelvin (K), K = °C + 273,1548. El HS- tiene un pK2 alto (pK2 = 19), por lo que a pH < 96,49, el S2- no se forma o se forma en cantidades muy pequeñas. Por el contrario, el HS- actúa como una base y acepta H+ de una molécula de H2O, y el H2O actúa como un ácido y se convierte en H2S y OH-.
Formación de gas H₂S disuelto en solución de NaHS (30 µM). aq: solución acuosa; g: gas; l: líquido. Todos los cálculos asumen un pH del agua de 7,0 y una temperatura del agua de 20 °C. Creado con BioRender.com.
A pesar de la evidencia de que las soluciones de NaHS son inestables, varios estudios en animales han utilizado soluciones de NaHS en agua potable como compuesto donante de H2S15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 con duraciones de intervención que van de 1 a 21 semanas (Tabla 2). Durante estos estudios, la solución de NaHS se renovó cada 12 h, 15, 17, 18, 24, 25 h o 24 h, 19, 20, 21, 22, 23 h. Nuestros resultados mostraron que las ratas estuvieron expuestas a concentraciones inestables del fármaco debido a la pérdida de H2S de la solución de NaHS, y el contenido de NaHS en el agua potable de las ratas fluctuó significativamente durante 12 o 24 h (véase la Figura 2). Dos de estos estudios informaron que los niveles de H2S en el agua se mantuvieron estables durante 24 h22 o que solo se observaron pérdidas de H2S del 2-3% durante 12 h15, pero no proporcionaron datos de respaldo ni detalles de medición. Dos estudios han demostrado que el pequeño diámetro de las botellas de agua puede minimizar la evaporación de H2S15,19. Sin embargo, nuestros resultados mostraron que esto puede retrasar la pérdida de H2S de una botella de agua solo 2 h en lugar de 12-24 h. Ambos estudios señalan que asumimos que el nivel de NaHS en el agua potable no cambió porque no observamos un cambio de color en el agua; por lo tanto, la oxidación de H2S por el aire no fue significativa19,20. Sorprendentemente, este método subjetivo evalúa la estabilidad del NaHS en el agua en lugar de medir el cambio en su concentración a lo largo del tiempo.
La pérdida de H2S en la solución de NaHS está relacionada con el pH y la temperatura. Como se observa en nuestro estudio, la disolución de NaHS en agua da como resultado la formación de una solución alcalina50. Cuando el NaHS se disuelve en agua, la formación de gas H2S disuelto depende del valor del pH6. Cuanto menor sea el pH de la solución, mayor será la proporción de NaHS presente como moléculas de gas H2S y mayor será la pérdida de sulfuro de la solución acuosa11. Ninguno de estos estudios informó el pH del agua potable utilizada como solvente para el NaHS. Según las recomendaciones de la OMS, adoptadas por la mayoría de los países, el pH del agua potable debe estar en el rango de 6,5 a 8,551. En este rango de pH, la tasa de oxidación espontánea del H2S aumenta aproximadamente diez veces13. La disolución de NaHS en agua en este rango de pH dará como resultado una concentración de gas H2S disuelto de 1 a 22,5 μM, lo que enfatiza la importancia de monitorear el pH del agua antes de disolver el NaHS. Además, el rango de temperatura mencionado en el estudio anterior (18–26 °C) provocaría un cambio en la concentración de gas H2S disuelto en la solución de aproximadamente un 10 %, ya que los cambios de temperatura alteran el pK1, y pequeños cambios en el pK1 pueden tener un impacto significativo en la concentración de gas H2S disuelto48. Asimismo, la larga duración de algunos estudios (5 meses)22, durante los cuales se espera una gran variabilidad de la temperatura, también agrava este problema.
Todos los estudios, excepto uno21, utilizaron una solución de NaHS de 30 μM en agua potable. Para explicar la dosis utilizada (es decir, 30 μM), algunos autores señalaron que el NaHS en fase acuosa produce exactamente la misma concentración de gas H2S y que el rango fisiológico de H2S es de 10 a 100 μM, por lo que esta dosis está dentro del rango fisiológico15,16. Otros explicaron que 30 μM de NaHS pueden mantener el nivel plasmático de H2S dentro del rango fisiológico, es decir, 5–300 μM19,20. Consideramos la concentración de NaHS en agua de 30 μM (pH = 7,0, T = 20 °C), que se utilizó en algunos estudios para estudiar los efectos del H2S. Podemos calcular que la concentración de gas H2S disuelto es de 14,7 μM, que es aproximadamente el 50 % de la concentración inicial de NaHS. Este valor es similar al valor calculado por otros autores en las mismas condiciones13,48.
En nuestro estudio, la administración de NaHS no modificó el peso corporal; este resultado es consistente con los resultados de otros estudios en ratones macho22,23 y ratas macho18; sin embargo, dos estudios informaron que el NaSH restauró el peso corporal disminuido en ratas nefrectomizadas24,26, mientras que otros estudios no informaron el efecto de la administración de NaSH sobre el peso corporal15,16,17,19,20,21,25. Además, en nuestro estudio, la administración de NaSH no afectó los niveles séricos de urea y cromo de creatina, lo cual es consistente con los resultados de otro informe25.
El estudio encontró que la adición de NaHS al agua potable durante 2 semanas no afectó las concentraciones totales de sulfuro sérico en ratas macho y hembra. Este hallazgo es consistente con los resultados de Sen et al. (16): 8 semanas de tratamiento con 30 μM de NaHS en el agua potable no afectaron los niveles de sulfuro plasmático en ratas control; sin embargo, informaron que esta intervención restauró los niveles disminuidos de H2S en el plasma de ratones nefrectomizados. Li et al. (22) también informaron que el tratamiento con 30 μM de NaHS en el agua potable durante 5 meses aumentó los niveles de sulfuro libre plasmático en ratones ancianos en aproximadamente un 26%. Otros estudios no han reportado cambios en el sulfuro circulante después de la adición de NaHS al agua potable.
Siete estudios informaron haber utilizado Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23 pero no proporcionaron más detalles sobre el agua de hidratación, y cinco estudios no mencionaron la fuente de NaHS utilizada en sus métodos de preparación17,18,24,25,26. El NaHS es una molécula hidratada y su contenido de agua de hidratación puede variar, lo que afecta la cantidad de NaHS necesaria para preparar una solución de una molaridad dada. Por ejemplo, el contenido de NaHS en nuestro estudio fue NaHS•1.3 H2O. Por lo tanto, las concentraciones reales de NaHS en estos estudios pueden ser menores que las reportadas.
“¿Cómo puede un compuesto de vida tan corta tener un efecto tan duradero?” Pozgay et al.21 se hicieron esta pregunta al evaluar los efectos del NaHS en la colitis en ratones. Esperan que estudios futuros puedan responder a esta pregunta y especulan que las soluciones de NaHS pueden contener polisulfuros más estables además del H2S y los disulfuros que median el efecto del NaHS21. Otra posibilidad es que concentraciones muy bajas de NaHS que permanecen en solución también puedan tener un efecto beneficioso. De hecho, Olson et al. proporcionaron evidencia de que los niveles micromolares de H2S en la sangre no son fisiológicos y deberían estar en el rango nanomolar o estar ausentes por completo13. El H2S puede actuar a través de la sulfatación de proteínas, una modificación postraduccional reversible que afecta la función, la estabilidad y la localización de muchas proteínas52,53,54. De hecho, en condiciones fisiológicas, aproximadamente del 10% al 25% de muchas proteínas hepáticas están sulfiladas53. Ambos estudios reconocen la rápida destrucción del NaHS19,23 pero sorprendentemente afirman que “controlamos la concentración de NaHS en el agua potable reemplazándola diariamente”.23 Un estudio afirmó accidentalmente que “el NaHS es un donante estándar de H2S y se usa comúnmente en la práctica clínica para reemplazar el propio H2S”.18
La discusión anterior muestra que el NaHS se pierde de la solución a través de volatilización, oxidación y fotólisis, y por lo tanto se hacen algunas sugerencias para reducir la pérdida de H2S de la solución. Primero, la evaporación de H2S depende de la interfaz gas-líquido13 y el pH de la solución11; por lo tanto, para minimizar la pérdida por evaporación, el cuello de la botella de agua se puede hacer lo más pequeño posible como se describió anteriormente15,19, y el pH del agua se puede ajustar a un límite superior aceptable (es decir, 6.5–8.551) para minimizar la pérdida por evaporación11. Segundo, la oxidación espontánea de H2S ocurre debido a los efectos del oxígeno y la presencia de iones de metales de transición en el agua potable13, por lo que la desoxigenación del agua potable con argón o nitrógeno44,45 y el uso de quelantes de metales37,47 pueden reducir la oxidación de sulfuros. Tercero, para prevenir la fotodescomposición de H2S, las botellas de agua se pueden envolver con papel de aluminio; Esta práctica también se aplica a materiales fotosensibles como la estreptozotocina55. Finalmente, las sales de sulfuro inorgánico (NaHS, Na2S y CaS) pueden administrarse por sonda gástrica en lugar de disueltas en agua potable como se informó anteriormente56,57,58; los estudios han demostrado que el sulfuro de sodio radiactivo administrado por sonda gástrica a ratas se absorbe bien y se distribuye a prácticamente todos los tejidos59. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios han administrado sales de sulfuro inorgánico intraperitonealmente; sin embargo, esta vía rara vez se utiliza en entornos clínicos60. Por otro lado, la vía oral es la vía de administración más común y preferida en humanos61. Por lo tanto, recomendamos evaluar los efectos de los donantes de H2S en roedores por sonda gástrica oral.
Una limitación es que medimos el sulfuro en solución acuosa y suero usando el método MB. Los métodos para medir el sulfuro incluyen titulación con yodo, espectrofotometría, método electroquímico (potenciometría, amperometría, método coulométrico y método amperométrico) y cromatografía (cromatografía de gases y cromatografía líquida de alta resolución), entre los cuales el método más comúnmente utilizado es el método espectrofotométrico MB62. Una limitación del método MB para medir H2S en muestras biológicas es que mide todos los compuestos que contienen azufre y no H2S libre63 porque se realiza en condiciones ácidas, lo que resulta en la extracción de azufre de la fuente biológica64. Sin embargo, según la Asociación Estadounidense de Salud Pública, MB es el método estándar para medir sulfuro en agua65. Por lo tanto, esta limitación no afecta nuestros resultados principales sobre la inestabilidad de soluciones que contienen NaHS. Además, en nuestro estudio, la recuperación de las mediciones de sulfuro en muestras de agua y suero que contenían NaHS fue del 91% y 93%, respectivamente. Estos valores están en línea con los rangos previamente informados (77–92)66, lo que indica una precisión analítica aceptable42. Cabe destacar que utilizamos ratas macho y hembra de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) para evitar una dependencia excesiva de estudios con animales exclusivamente machos en estudios preclínicos67 y para incluir ratas macho y hembra siempre que fuera posible68. Este punto ha sido enfatizado por otros69,70,71.
En conclusión, los resultados de este estudio indican que las soluciones de NaHS preparadas con agua potable no pueden utilizarse para generar H2S debido a su inestabilidad. Esta vía de administración expondría a los animales a niveles de NaHS inestables e inferiores a los esperados; por lo tanto, los hallazgos podrían no ser aplicables a los seres humanos.
Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles a solicitud razonable del autor correspondiente.
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