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La contaminación por cadmio (Cd) representa una amenaza potencial para la seguridad del cultivo de la planta medicinal Panax notoginseng en Yunnan. Bajo estrés por Cd exógeno, se realizaron experimentos de campo para comprender los efectos de la aplicación de cal (0, 750, 2250 y 3750 kg/h/m2) y la pulverización foliar con ácido oxálico (0, 0.1 y 0.2 mol/L) sobre la acumulación de Cd y los componentes sistémicos y medicinales antioxidantes de Panax notoginseng. Los resultados mostraron que bajo estrés por Cd, la cal y la pulverización foliar con ácido oxálico podrían aumentar el contenido de Ca2+ de Panax notoginseng y reducir la toxicidad del Cd2+. La adición de cal y ácido oxálico aumentó la actividad de las enzimas antioxidantes y cambió el metabolismo de los reguladores osmóticos. El más significativo es el aumento de la actividad de CAT en 2.77 veces. Bajo la influencia del ácido oxálico, la actividad de SOD aumentó a 1.78 veces. El contenido de MDA disminuyó en un 58,38%. Existe una correlación muy significativa con azúcares solubles, aminoácidos libres, prolina y proteína soluble. La cal y el ácido oxálico pueden aumentar el contenido de iones de calcio (Ca2+) de Panax notoginseng, reducir el contenido de Cd, mejorar la resistencia al estrés de Panax notoginseng y aumentar la producción de saponinas y flavonoides totales. El contenido de Cd es el más bajo, un 68,57% menor que el control, y corresponde al valor estándar (Cd≤0,5 mg kg-1, GB/T 19086-2008). La proporción de SPN fue del 7,73%, alcanzando el nivel más alto entre todos los tratamientos, y el contenido de flavonoides aumentó significativamente en un 21,74%, alcanzando valores médicos estándar y rendimiento óptimo.
El cadmio (Cd) es un contaminante común de los suelos cultivados, migra fácilmente y presenta una importante toxicidad biológica. El-Shafei et al.² informaron que la toxicidad del cadmio afecta la calidad y la productividad de las plantas utilizadas. En los últimos años, los niveles excesivos de cadmio en los suelos cultivados del suroeste de China se han convertido en un problema grave. La provincia de Yunnan es un referente de biodiversidad en China, con una gran diversidad de plantas medicinales. Sin embargo, Yunnan es rica en recursos minerales, y el proceso de extracción inevitablemente genera contaminación por metales pesados ​​en el suelo, lo que afecta la producción de plantas medicinales locales.
Panax notoginseng (Burkill) Chen3) es una planta medicinal herbácea perenne muy valiosa perteneciente al género Panax de la familia Araliaceae. Panax notoginseng mejora la circulación sanguínea, elimina el estancamiento de la sangre y alivia el dolor. La principal zona de producción es la prefectura de Wenshan, provincia de Yunnan5. Más del 75% del suelo en las zonas locales de cultivo de Panax notoginseng está contaminado con cadmio, con niveles que varían del 81% a más del 100% en diferentes áreas6. El efecto tóxico del Cd también reduce significativamente la producción de componentes medicinales de Panax notoginseng, especialmente saponinas y flavonoides. Las saponinas son un tipo de compuesto glucosídico cuyas agliconas son triterpenoides o espirostanos. Son los principales ingredientes activos de muchas medicinas tradicionales chinas y contienen saponinas. Algunas saponinas también tienen actividad antibacteriana o valiosas actividades biológicas como efectos antipiréticos, sedantes y anticancerígenos7. Los flavonoides generalmente se refieren a una serie de compuestos en los que dos anillos de benceno con grupos hidroxilo fenólicos están conectados a través de tres átomos de carbono centrales. El núcleo principal es la 2-fenilcromanona 8. Es un potente antioxidante que puede eliminar eficazmente los radicales libres de oxígeno en las plantas. También puede inhibir la penetración de enzimas biológicas inflamatorias, promover la cicatrización de heridas y el alivio del dolor, y reducir los niveles de colesterol. Es uno de los principales ingredientes activos del Panax notoginseng. Existe una necesidad urgente de abordar el problema de la contaminación por cadmio en los suelos de las zonas de producción de Panax ginseng y garantizar la producción de sus ingredientes medicinales esenciales.
La cal es uno de los pasivadores más utilizados para la purificación de suelos estacionarios contaminados con cadmio10. Afecta la adsorción y deposición de Cd en el suelo al reducir su biodisponibilidad mediante el aumento del pH y la modificación de la capacidad de intercambio catiónico (CIC), la saturación de sales (SS) y el potencial redox (Eh)3, 11. Además, la cal aporta una gran cantidad de Ca2+, forma antagonismo iónico con Cd2+, compite por los sitios de adsorción en las raíces, previene el transporte de Cd al suelo y presenta baja toxicidad biológica. Cuando se añadieron 50 mmol L-1 de Ca bajo estrés por Cd, se inhibió el transporte de Cd en las hojas de sésamo y se redujo la acumulación de Cd en un 80%. Se han publicado varios estudios similares en arroz (Oryza sativa L.) y otros cultivos12,13.
La pulverización foliar de cultivos para controlar la acumulación de metales pesados ​​es un método nuevo para controlar los metales pesados ​​en los últimos años. Su principio está relacionado principalmente con la reacción de quelación en las células vegetales, que resulta en la deposición de metales pesados ​​en la pared celular e inhibe la absorción de metales pesados ​​por las plantas14,15. Como agente quelante diácido estable, el ácido oxálico puede quelar directamente los iones de metales pesados ​​en las plantas, reduciendo así la toxicidad. Las investigaciones han demostrado que el ácido oxálico en la soja puede quelar Cd2+ y liberar cristales que contienen Cd a través de las células del tricoma superior, reduciendo los niveles de Cd2+ en el cuerpo16. El ácido oxálico puede regular el pH del suelo, aumentar la actividad de la superóxido dismutasa (SOD), la peroxidasa (POD) y la catalasa (CAT), y regular la penetración de azúcares solubles, proteínas solubles, aminoácidos libres y prolina. Reguladores metabólicos17,18. El ácido y el exceso de Ca2+ en la planta forman un precipitado de oxalato de calcio bajo la acción de proteínas nucleantes. Regular la concentración de Ca2+ en las plantas puede lograr eficazmente la regulación del ácido oxálico disuelto y el Ca2+ en las plantas y evitar la acumulación excesiva de ácido oxálico y Ca2+19,20.
La cantidad de cal aplicada es uno de los factores clave que influyen en el efecto de reparación. Se encontró que la dosis de cal varió de 750 a 6000 kg/m2. Para suelos ácidos con un pH de 5,0~5,5, el efecto de aplicar cal a una dosis de 3000~6000 kg/h/m es significativamente mayor que a una dosis de 750 kg/h/m221. Sin embargo, la aplicación excesiva de cal dará lugar a algunos efectos negativos en el suelo, como cambios significativos en el pH del suelo y compactación del suelo22. Por lo tanto, definimos los niveles de tratamiento de CaO como 0, 750, 2250 y 3750 kg hm-2. Cuando se aplicó ácido oxálico a Arabidopsis thaliana, se encontró que el Ca2+ se redujo significativamente a una concentración de 10 mmol L-1, y la familia de genes CRT, que afecta la señalización de Ca2+, respondió fuertemente20. La acumulación de algunos estudios previos nos permitió determinar la concentración de esta prueba y estudiar más a fondo el efecto de la interacción de suplementos exógenos sobre Ca2+ y Cd2+23,24,25. Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo explorar el mecanismo regulador de la pulverización foliar de cal y ácido oxálico exógenos sobre el contenido de Cd y la tolerancia al estrés de Panax notoginseng en suelo contaminado con Cd y explorar más a fondo formas de asegurar mejor la calidad y eficacia medicinal. Producción de Panax notoginseng. Proporciona una valiosa guía para aumentar la escala del cultivo de plantas herbáceas en suelos contaminados con cadmio y lograr la producción sostenible de alta calidad requerida por el mercado farmacéutico.
Utilizando la variedad local de ginseng Wenshan Panax notoginseng como material, se realizó un experimento de campo en Lannizhai, condado de Qiubei, prefectura de Wenshan, provincia de Yunnan (24°11′N, 104°3′E, altitud 1446 m). La temperatura media anual es de 17 °C y la precipitación media anual es de 1250 mm. Los valores de fondo del suelo estudiado fueron TN 0,57 g kg-1, TP 1,64 g kg-1, TC 16,31 g kg-1, OM 31,86 g kg-1, N hidrolizado alcalinamente 88,82 mg kg-1, fósforo libre 18,55 mg kg-1, potasio libre 100,37 mg kg-1, cadmio total 0,3 mg kg-1, pH 5,4.
El 10 de diciembre de 2017, se mezclaron 6 mg/kg de Cd2+ (CdCl2·2.5H2O) y un tratamiento con cal (0, 750, 2250 y 3750 kg/h/m2) y se aplicaron a la superficie del suelo en una capa de 0~10 cm de cada parcela. Cada tratamiento se repitió 3 veces. Las parcelas de prueba se ubicaron aleatoriamente, cada parcela cubriendo un área de ​​3 m2. Las plántulas de Panax notoginseng de un año de edad se trasplantaron después de 15 días de labranza. Cuando se utiliza una malla de sombreo, la intensidad de luz de Panax notoginseng dentro de la malla de sombreo es aproximadamente 18% de la intensidad de luz natural normal. El cultivo se lleva a cabo de acuerdo con los métodos de cultivo tradicionales locales. Antes de la etapa de maduración de Panax notoginseng en 2019, se roció ácido oxálico en forma de oxalato de sodio. Las concentraciones de ácido oxálico fueron de 0, 0,1 y 0,2 mol L⁻¹, respectivamente, y se utilizó NaOH para ajustar el pH a 5,16 y simular el pH promedio de la solución de lixiviación de la hojarasca. Rocíe las superficies superior e inferior de las hojas una vez por semana a las 8:00 a. m. Después de rociar 4 veces en la quinta semana, se cosecharon plantas de Panax notoginseng de 3 años.
En noviembre de 2019, se recolectaron plantas de Panax notoginseng de tres años del campo y se rociaron con ácido oxálico. Algunas muestras de plantas de Panax notoginseng de tres años que debían medirse para el metabolismo fisiológico y la actividad enzimática se colocaron en tubos para congelación, se congelaron rápidamente con nitrógeno líquido y luego se transfirieron a un refrigerador a -80 °C. Algunas muestras de raíz que se medirían para el Cd y el contenido de ingredientes activos en la etapa de madurez se lavaron con agua del grifo, se secaron a 105 °C durante 30 minutos, a peso constante a 75 °C y se molieron en un mortero para su almacenamiento.
Pesar 0,2 g de muestra vegetal seca, colocarla en un matraz Erlenmeyer, añadir 8 ml de HNO3 y 2 ml de HClO4 y tapar durante la noche. Al día siguiente, usar un embudo curvo colocado en un matraz Erlenmeyer para la digestión electrotérmica hasta que aparezca humo blanco y los jugos digestivos salgan transparentes. Tras enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se transfirió a un matraz volumétrico de 10 ml. El contenido de Cd se determinó mediante un espectrómetro de absorción atómica (Thermo ICE™ 3300 AAS, EE. UU.). (GB/T 23739-2009).
Pesar 0,2 g de muestra vegetal seca, colocarla en un frasco de plástico de 50 ml, añadir 1 mol L-1 de HCl en 10 ml, tapar y agitar bien durante 15 horas y filtrar. Con una pipeta, tomar la cantidad necesaria de filtrado, diluirlo adecuadamente y añadir solución de SrCl2 para alcanzar una concentración de Sr2+ de 1 g L-1. El contenido de Ca se midió mediante un espectrómetro de absorción atómica (Thermo ICE™ 3300 AAS, EE. UU.).
Método del kit de referencia para malondialdehído (MDA), superóxido dismutasa (SOD), peroxidasa (POD) y catalasa (CAT) (DNM-9602, Beijing Prong New Technology Co., Ltd., registro de producto), utilice el kit de medición correspondiente. N.°: Farmacopea de Beijing (precisa) 2013 N.° 2400147).
Pese aproximadamente 0,05 g de muestra de Panax notoginseng y añada el reactivo de antrona-ácido sulfúrico por los lados del tubo. Agite el tubo durante 2-3 segundos para mezclar bien el líquido. Coloque el tubo en un soporte para tubos y deje que se desarrolle el color durante 15 minutos. El contenido de azúcares solubles se determinó mediante espectrofotometría ultravioleta-visible (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., China) a una longitud de onda de 620 nm.
Pesar 0,5 g de una muestra fresca de Panax notoginseng, triturarla hasta obtener un homogeneizado con 5 ml de agua destilada y centrifugarla a 10 000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se diluyó a un volumen fijo. Se utilizó el método de azul brillante de Coomassie. El contenido de proteína soluble se midió mediante espectrofotometría ultravioleta-visible (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., China) a una longitud de onda de 595 nm y se calculó a partir de la curva estándar de albúmina sérica bovina.
Pesar 0,5 g de muestra fresca, añadir 5 ml de ácido acético al 10 %, moler hasta obtener un homogeneizado, filtrar y diluir hasta volumen constante. El método de desarrollo del color se realizó con una solución de ninhidrina. El contenido de aminoácidos libres se determinó mediante espectrofotometría UV-visible (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., China) a 570 nm y se calculó a partir de la curva de calibración de leucina28.
Pesar 0,5 g de una muestra fresca, añadir 5 ml de una solución al 3 % de ácido sulfosalicílico, calentar en baño de agua y agitar durante 10 minutos. Tras enfriar, la solución se filtró y se aforó a volumen constante. Se utilizó el método colorimétrico con ninhidrina ácida. El contenido de prolina se determinó mediante espectrofotometría ultravioleta-visible (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., China) a una longitud de onda de 520 nm y se calculó a partir de la curva de calibración de prolina²⁹.
El contenido de saponinas se determinó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con referencia a la Farmacopea de la República Popular China (edición de 2015). El principio básico de la HPLC consiste en utilizar un líquido a alta presión como fase móvil y aplicar la tecnología de separación de partículas ultrafinas de la cromatografía de columna de alta resolución a la fase estacionaria. La técnica operativa es la siguiente:
Condiciones de HPLC y prueba de idoneidad del sistema (Tabla 1): Utilice gel de sílice unido a octadecilsilano como relleno, acetonitrilo como fase móvil A y agua como fase móvil B. Realice la elución por gradiente como se muestra en la tabla siguiente. La longitud de onda de detección es de 203 nm. Según el pico R1 de las saponinas totales de Panax notoginseng, el número de platos teóricos debe ser de al menos 4000.
Preparación de la solución estándar: Pesar con precisión el ginsenósido Rg1, el ginsenósido Rb1 y el notoginsenósido R1 y añadir metanol para preparar una mezcla que contenga 0,4 mg de ginsenósido Rg1, 0,4 mg de ginsenósido Rb1 y 0,1 mg de notoginsenósido R1 por cada 1 ml de solución.
Preparación de la solución de prueba: Pesar 0,6 g de polvo de ginseng Panax y añadir 50 ml de metanol. La solución resultante (W1) se pesó y se dejó reposar durante la noche. A continuación, se hirvió suavemente en un baño de agua a 80 °C durante 2 horas. Tras enfriar, pesar la solución y añadir el metanol preparado a la primera masa (W1). Agitar bien y filtrar. El filtrado se reserva para su análisis.
Recoja con precisión 10 μL de la solución estándar y 10 μL del filtrado e inyéctelos en un cromatógrafo líquido de alto rendimiento (Thermo HPLC-ultimate 3000, Seymour Fisher Technology Co., Ltd.) para determinar el contenido de saponina 24.
Curva de calibración: medición de una solución estándar mixta de Rg1, Rb1 y R1. Las condiciones cromatográficas son las mismas que las descritas anteriormente. La curva de calibración se calcula representando el área del pico medida en el eje y y la concentración de saponina en la solución estándar en el eje x. La concentración de saponina se puede calcular sustituyendo el área del pico medida de la muestra en la curva de calibración.
Pesar 0,1 g de muestra de P. notogensings y añadir 50 ml de solución de CH3OH al 70%. La extracción ultrasónica se realizó durante 2 horas, seguida de centrifugación a 4000 rpm durante 10 minutos. Tomar 1 ml del sobrenadante y diluirlo 12 veces. El contenido de flavonoides se determinó mediante espectrofotometría ultravioleta-visible (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., China) a una longitud de onda de 249 nm. La quercetina es una de las sustancias comunes estándar⁸.
Los datos se organizaron con el software Excel 2010. Se utilizó el software estadístico SPSS 20 para realizar el análisis de varianza. Las gráficas se elaboraron con Origin Pro 9.1. Los valores estadísticos calculados incluyen la media ± desviación estándar. La significación estadística se basa en un valor de p < 0,05.
Con la misma concentración de ácido oxálico aplicado a las hojas, el contenido de Ca en las raíces de Panax notoginseng aumentó significativamente al incrementarse la cantidad de cal aplicada (Tabla 2). En comparación con la ausencia de cal, el contenido de Ca aumentó un 212 % al añadir 3750 kg/h/m² de cal sin aplicar ácido oxálico. Con la misma cantidad de cal aplicada, el contenido de Ca aumentó ligeramente al incrementarse la concentración de ácido oxálico.
El contenido de Cd en las raíces varía de 0,22 a 0,70 mg kg-1. Con la misma concentración de pulverización de ácido oxálico, a medida que aumenta la cantidad de cal añadida, el contenido de Cd de 2250 kg/h disminuye significativamente. En comparación con el control, el contenido de Cd en las raíces disminuyó un 68,57% después de la pulverización con 2250 kg hm-2 de cal y 0,1 mol l-1 de ácido oxálico. Cuando se aplicaron cal sin cal y 750 kg/h de cal, el contenido de Cd en las raíces de Panax notoginseng disminuyó significativamente con el aumento de la concentración de pulverización de ácido oxálico. Cuando se aplicaron 2250 kg/m2 de cal y 3750 kg/m2 de cal, el contenido de Cd en la raíz primero disminuyó y luego aumentó con el aumento de la concentración de ácido oxálico. Además, el análisis bivariado mostró que la cal tuvo un efecto significativo en el contenido de Ca de las raíces de Panax notoginseng (F = 82,84**), la cal tuvo un efecto significativo en el contenido de Cd en las raíces de Panax notoginseng (F = 74,99**) y el ácido oxálico (F = 7,72*).
A medida que aumentaba la cantidad de cal añadida y la concentración de ácido oxálico pulverizado, el contenido de MDA disminuía significativamente. No hubo diferencia significativa en el contenido de MDA en las raíces de Panax notoginseng sin la adición de cal y con la adición de 3750 kg/m2 de cal. A tasas de aplicación de 750 kg/h/m2 y 2250 kg/h/m2, el contenido de cal del tratamiento de pulverización de ácido oxálico 0,2 mol/L disminuyó en un 58,38 % y un 40,21 %, respectivamente, en comparación con el tratamiento sin pulverización de ácido oxálico. El contenido más bajo de MDA (7,57 nmol g-1) se observó al pulverizar 750 kg hm-2 de cal y 0,2 mol l-1 de ácido oxálico (Fig. 1).
Efecto de la pulverización foliar con ácido oxálico sobre el contenido de malondialdehído en raíces de Panax notoginseng bajo estrés por cadmio. Nota: La leyenda de la figura indica la concentración de ácido oxálico en la pulverización (mol L-1); las distintas letras minúsculas indican diferencias significativas entre los tratamientos de la misma aplicación de cal. Número (P < 0,05). Lo mismo a continuación.
Excepto por la aplicación de 3750 kg/h de cal, no hubo diferencia significativa en la actividad de SOD en las raíces de Panax notoginseng. Cuando se agregaron 0, 750 y 2250 kg/h/m2 de cal, la actividad de SOD cuando se trató con rociador de ácido oxálico a una concentración de 0,2 mol/l fue significativamente mayor que sin el uso de ácido oxálico, aumentando en 177,89%, 61,62% y 45,08% respectivamente. La actividad de SOD en las raíces (598,18 U g-1) fue más alta en ausencia de aplicación de cal y cuando se trató con rociador de ácido oxálico a una concentración de 0,2 mol/l. Cuando se roció ácido oxálico a la misma concentración o 0,1 mol L-1, la actividad de SOD aumentó con el aumento de la cantidad de cal agregada. Después de rociar con 0,2 mol/L de ácido oxálico, la actividad de SOD disminuyó significativamente (Fig. 2).
Efecto de la pulverización de las hojas con ácido oxálico sobre la actividad de la superóxido dismutasa, la peroxidasa y la catalasa en las raíces de Panax notoginseng bajo estrés por cadmio.
Al igual que la actividad de la SOD en las raíces, la actividad de la POD en las raíces tratadas sin cal y rociadas con ácido oxálico 0,2 mol L-1 fue la más alta (63,33 µmol g-1), lo que representa un aumento del 148,35 % con respecto al control (25,50 µmol g-1). Con el aumento de la concentración de ácido oxálico en el rociado y el tratamiento con cal a 3750 kg/m2, la actividad de la POD primero aumentó y luego disminuyó. En comparación con el tratamiento con ácido oxálico 0,1 mol L-1, la actividad de la POD cuando se trató con ácido oxálico 0,2 mol L-1 disminuyó en un 36,31 % (Fig. 2).
Con excepción de la pulverización de ácido oxálico 0,2 mol/l y la adición de cal 2250 kg/h/m2 o 3750 kg/h/m2, la actividad CAT fue significativamente mayor que el control. Cuando se pulverizó ácido oxálico 0,1 mol/l y se añadió cal 0,2250 kg/m2 o 3750 kg/h/m2, la actividad CAT aumentó en 276,08%, 276,69% ​​y 33,05%, respectivamente, en comparación con el tratamiento sin pulverización de ácido oxálico. La actividad CAT en las raíces fue más alta (803,52 μmol/g) en el tratamiento sin cal y en el tratamiento con ácido oxálico 0,2 mol/L. La actividad CAT fue la más baja (172,88 μmol/g) cuando se trató con 3750 kg/h/m de cal y ácido oxálico 0,2 mol/L (Fig. 2).
El análisis bivariado mostró que la actividad de CAT y la actividad de MDA de las raíces de Panax notoginseng se asociaron significativamente con la cantidad de ácido oxálico o cal rociada y los dos tratamientos (Tabla 3). La actividad de SOD en las raíces se relacionó significativamente con el tratamiento con cal y ácido oxálico o con la concentración de ácido oxálico rociado. La actividad de POD en la raíz dependió significativamente de la cantidad de cal aplicada o del tratamiento con cal y ácido oxálico.
El contenido de azúcares solubles en las raíces disminuyó con el aumento de la cantidad de cal aplicada y la concentración de ácido oxálico pulverizado. No hubo diferencia significativa en el contenido de azúcares solubles en las raíces de Panax notoginseng sin aplicación de cal y cuando se aplicó 750 kg/h/m de cal. Cuando se aplicó 2250 kg/m2 de cal, el contenido de azúcares solubles cuando se trató con 0,2 mol/L de ácido oxálico fue significativamente mayor que cuando se trató sin pulverizar ácido oxálico, aumentando en un 22,81%. Cuando se aplicó 3750 kg h/m2 de cal, el contenido de azúcares solubles disminuyó significativamente a medida que aumentó la concentración de ácido oxálico pulverizado. El contenido de azúcares solubles cuando se trató con 0,2 mol L-1 de ácido oxálico disminuyó en un 38,77% en comparación con el que no se pulverizó ácido oxálico. Además, el tratamiento con 0,2 mol·L-1 de ácido oxálico pulverizado tuvo el contenido de azúcares solubles más bajo, que fue de 205,80 mg·g-1 (Fig. 3).
Efecto de la pulverización foliar con ácido oxálico sobre el contenido de azúcares totales solubles y proteínas solubles en raíces de Panax notoginseng bajo estrés por cadmio.
El contenido de proteína soluble en las raíces disminuyó con el aumento de la cantidad de aplicación de cal y el tratamiento con ácido oxálico. Sin la adición de cal, el contenido de proteína soluble cuando se trató con ácido oxálico en aerosol a una concentración de 0,2 mol L-1 se redujo significativamente en un 16,20% en comparación con el control. No hubo diferencias significativas en el contenido de proteína soluble de las raíces de Panax notoginseng cuando se aplicó 750 kg/h de cal. Bajo las condiciones de aplicación de 2250 kg/h/m de cal, el contenido de proteína soluble del tratamiento con ácido oxálico en aerosol a 0,2 mol/L fue significativamente mayor que el del tratamiento sin ácido oxálico en aerosol (35,11%). Cuando se aplicó 3750 kg·h/m2 de cal, el contenido de proteína soluble disminuyó significativamente a medida que aumentó la concentración de ácido oxálico en aerosol, con el contenido de proteína soluble más bajo (269,84 μg·g-1) cuando el tratamiento con ácido oxálico en aerosol fue de 0,2 mol·L-1 (Fig. 3).
No hubo diferencias significativas en el contenido de aminoácidos libres en la raíz de Panax notoginseng en ausencia de aplicación de cal. A medida que aumentó la concentración de pulverización de ácido oxálico y la adición de 750 kg/h/m2 de cal, el contenido de aminoácidos libres primero disminuyó y luego aumentó. En comparación con el tratamiento sin pulverización de ácido oxálico, el contenido de aminoácidos libres aumentó significativamente en un 33,58% cuando se pulverizaron 2250 kg hm-2 de cal y 0,2 mol l-1 de ácido oxálico. El contenido de aminoácidos libres disminuyó significativamente con el aumento de la concentración de pulverización de ácido oxálico y la adición de 3750 kg/m2 de cal. El contenido de aminoácidos libres del tratamiento de pulverización de ácido oxálico 0,2 mol L-1 se redujo en un 49,76% en comparación con el tratamiento de pulverización sin ácido oxálico. El contenido de aminoácidos libres fue más alto sin pulverización de ácido oxálico y fue de 2,09 mg g-1. El tratamiento con aerosol de ácido oxálico 0,2 mol/L tuvo el contenido más bajo de aminoácidos libres (1,05 mg/g) (Fig. 4).
Efecto de la pulverización de las hojas con ácido oxálico sobre el contenido de aminoácidos libres y prolina en las raíces de Panax notoginseng en condiciones de estrés por cadmio.
El contenido de prolina en las raíces disminuyó con el aumento de la cantidad de cal aplicada y la cantidad de pulverización con ácido oxálico. No hubo diferencias significativas en el contenido de prolina de la raíz de Panax ginseng cuando no se aplicó cal. A medida que aumentó la concentración de pulverización de ácido oxálico y aumentó la aplicación de 750 o 2250 kg/m2 de cal, el contenido de prolina primero disminuyó y luego aumentó. El contenido de prolina del tratamiento de pulverización de ácido oxálico 0,2 mol L-1 fue significativamente mayor que el del tratamiento de pulverización de ácido oxálico 0,1 mol L-1, aumentando en un 19,52% y un 44,33%, respectivamente. Cuando se añadieron 3750 kg/m2 de cal, el contenido de prolina disminuyó significativamente a medida que aumentó la concentración de ácido oxálico pulverizado. Después de pulverizar ácido oxálico 0,2 mol L-1, el contenido de prolina disminuyó en un 54,68% en comparación con el que no se pulverizó ácido oxálico. El contenido más bajo de prolina se obtuvo al tratar con ácido oxálico 0,2 mol/l y ascendió a 11,37 μg/g (Fig. 4).
El contenido total de saponinas en Panax notoginseng es Rg1>Rb1>R1. No hubo diferencias significativas en el contenido de las tres saponinas con el aumento de la concentración de ácido oxálico en aerosol y la concentración sin aplicación de cal (Tabla 4).
El contenido de R1 después de la pulverización de ácido oxálico 0,2 mol L-1 fue significativamente menor que sin pulverizar ácido oxálico y aplicando una dosis de cal de 750 o 3750 kg/m2. Con una concentración de ácido oxálico pulverizado de 0 o 0,1 mol/L, no hubo diferencia significativa en el contenido de R1 al aumentar la cantidad de cal añadida. Con una concentración de pulverización de ácido oxálico de 0,2 mol/L, el contenido de R1 en 3750 kg/h/m2 de cal fue significativamente menor que el 43,84 % sin añadir cal (Tabla 4).
A medida que aumentaba la concentración de ácido oxálico en la pulverización y se añadían 750 kg/m2 de cal, el contenido de Rg1 primero aumentaba y luego disminuía. A tasas de aplicación de cal de 2250 y 3750 kg/h, el contenido de Rg1 disminuía con el aumento de la concentración de ácido oxálico en la pulverización. A la misma concentración de ácido oxálico pulverizado, a medida que aumenta la cantidad de cal, el contenido de Rg1 primero aumenta y luego disminuye. En comparación con el control, excepto para el contenido de Rg1 en los tratamientos de tres concentraciones de ácido oxálico y 750 kg/m2 de cal, que fue mayor que el control, el contenido de Rg1 en las raíces de Panax notoginseng en los demás tratamientos fue menor que el control. El contenido máximo de Rg1 se obtuvo al pulverizar 750 kg/h/m2 de cal y 0,1 mol/l de ácido oxálico, que fue un 11,54 % mayor que el control (Tabla 4).
A medida que aumentaba la concentración de ácido oxálico en la pulverización y la cantidad de cal aplicada a un caudal de 2250 kg/h, el contenido de Rb1 primero aumentó y luego disminuyó. Después de pulverizar ácido oxálico a 0,1 mol L-1, el contenido de Rb1 alcanzó un valor máximo de 3,46%, que fue un 74,75% superior al de no pulverizar ácido oxálico. Para otros tratamientos con cal, no hubo diferencias significativas entre las diferentes concentraciones de ácido oxálico en la pulverización. Después de pulverizar con ácido oxálico a 0,1 y 0,2 mol L-1, a medida que aumentaba la cantidad de cal, el contenido de Rb1 primero disminuyó y luego disminuyó (Tabla 4).
Con la misma concentración de pulverización con ácido oxálico, a medida que aumentaba la cantidad de cal añadida, el contenido de flavonoides primero aumentaba y luego disminuía. No se detectó ninguna diferencia significativa en el contenido de flavonoides al pulverizar diferentes concentraciones de ácido oxálico sin cal y con 3750 kg/m2 de cal. Al añadir 750 y 2250 kg/m2 de cal, a medida que aumentaba la concentración de ácido oxálico pulverizado, el contenido de flavonoides primero aumentaba y luego disminuía. Al aplicar 750 kg/m2 y pulverizar ácido oxálico a una concentración de 0,1 mol/l, el contenido de flavonoides fue máximo: 4,38 mg/g, lo que supone un 18,38 % más que cuando se añadía la misma cantidad de cal, y no fue necesario pulverizar ácido oxálico. El contenido de flavonoides cuando se trató con un aerosol de ácido oxálico de 0,1 mol L-1 aumentó en un 21,74% en comparación con el tratamiento sin ácido oxálico y el tratamiento con cal a una dosis de 2250 kg/m2 (Fig. 5).
Efecto de la pulverización de hojas con oxalato sobre el contenido de flavonoides en la raíz de Panax notoginseng bajo estrés por cadmio.
El análisis bivariado mostró que el contenido de azúcares solubles en las raíces de Panax notoginseng dependía significativamente de la cantidad de cal aplicada y de la concentración de ácido oxálico pulverizado. El contenido de proteína soluble en las raíces se correlacionó significativamente con la dosis de cal y ácido oxálico. El contenido de aminoácidos libres y prolina en las raíces se correlacionó significativamente con la cantidad de cal aplicada, la concentración de ácido oxálico pulverizado, la cal y el ácido oxálico (Tabla 5).
El contenido de R1 en las raíces de Panax notoginseng dependió significativamente de la concentración de ácido oxálico pulverizado, la cantidad de cal y la combinación de cal y ácido oxálico aplicada. El contenido de flavonoides dependió significativamente de la concentración de ácido oxálico pulverizado y la cantidad de cal añadida.
Se han utilizado muchas enmiendas para reducir los niveles de cadmio en las plantas fijando el cadmio en el suelo, como la cal y el ácido oxálico30. La cal se utiliza ampliamente como enmienda del suelo para reducir los niveles de cadmio en los cultivos31. Liang et al. 32 informaron que el ácido oxálico también se puede utilizar para remediar suelos contaminados con metales pesados. Después de agregar concentraciones variables de ácido oxálico al suelo contaminado, el contenido de materia orgánica del suelo aumentó, la capacidad de intercambio catiónico disminuyó y el pH aumentó33. El ácido oxálico también puede reaccionar con iones metálicos en el suelo. En condiciones de estrés por Cd, el contenido de Cd en Panax notoginseng aumentó significativamente en comparación con el control. Sin embargo, si se utiliza cal, se reduce significativamente. Cuando se aplicaron 750 kg/h/m de cal en este estudio, el contenido de Cd de las raíces alcanzó el estándar nacional (el límite de Cd es Cd≤0,5 mg/kg, AQSIQ, GB/T 19086-200834), y el efecto fue bueno. El mejor efecto se logra agregando 2250 kg/m2 de cal. La adición de cal crea una gran cantidad de sitios de competencia para Ca2+ y Cd2+ en el suelo, y la adición de ácido oxálico reduce el contenido de Cd en las raíces de Panax notoginseng. Después de mezclar cal y ácido oxálico, el contenido de Cd de la raíz de Panax ginseng disminuyó significativamente y alcanzó el estándar nacional. El Ca2+ en el suelo se adsorbe a la superficie de la raíz a través de un proceso de flujo masivo y puede ser absorbido por las células de la raíz a través de canales de calcio (canales Ca2+), bombas de calcio (Ca2+-AT-Pasa) y antiportadores Ca2+/H+, y luego transportado horizontalmente a las raíces. Xylem23. Hubo una correlación negativa significativa entre el contenido de Ca y Cd en las raíces (P < 0,05). El contenido de Cd disminuyó con el aumento del contenido de Ca, lo que es consistente con la idea de antagonismo entre Ca y Cd. El análisis de varianza (ANOVA) mostró que la cantidad de cal tuvo un efecto significativo en el contenido de Ca en la raíz de Panax notoginseng. Pongrack et al. 35 informaron que el Cd se une al oxalato en los cristales de oxalato de calcio y compite con el Ca. Sin embargo, el efecto regulador del ácido oxálico sobre el Ca fue insignificante. Esto demuestra que la precipitación de oxalato de calcio a partir de ácido oxálico y Ca2+ no es una precipitación simple, y el proceso de coprecipitación puede estar controlado por varias vías metabólicas.
Bajo estrés por cadmio, se forma una gran cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS) en las plantas, dañando la estructura de las membranas celulares36. El contenido de malondialdehído (MDA) puede usarse como un indicador para juzgar el nivel de ROS y el grado de daño a la membrana plasmática de las plantas37. El sistema antioxidante es un importante mecanismo de protección para eliminar las especies reactivas de oxígeno38. Las actividades de las enzimas antioxidantes (incluidas POD, SOD y CAT) se alteran típicamente por el estrés por cadmio. Los resultados mostraron que el contenido de MDA estaba correlacionado positivamente con la concentración de Cd, lo que indica que el grado de peroxidación lipídica de la membrana vegetal se profundizó con el aumento de la concentración de Cd37. Esto es consistente con los resultados del estudio de Ouyang et al.39. Este estudio muestra que el contenido de MDA está significativamente influenciado por la cal, el ácido oxálico, la cal y el ácido oxálico. Después de la nebulización de ácido oxálico 0,1 mol L-1, el contenido de MDA de Panax notoginseng disminuyó, lo que indica que el ácido oxálico podría reducir la biodisponibilidad de Cd y los niveles de ROS en Panax notoginseng. El sistema de enzimas antioxidantes es donde tiene lugar la función de desintoxicación de la planta. La SOD elimina el O2- contenido en las células vegetales y produce O2 no tóxico y H2O2 de baja toxicidad. La POD y la CAT eliminan el H2O2 de los tejidos vegetales y catalizan la descomposición del H2O2 en H2O. Con base en el análisis del proteoma iTRAQ, se encontró que los niveles de expresión de proteínas de SOD y PAL disminuyeron y el nivel de expresión de POD aumentó después de la aplicación de cal bajo estrés por Cd40. Las actividades de CAT, SOD y POD en la raíz de Panax notoginseng se vieron afectadas significativamente por la dosis de ácido oxálico y cal. El tratamiento por pulverización con ácido oxálico 0,1 mol L-1 aumentó significativamente la actividad de SOD y CAT, pero el efecto regulador sobre la actividad de POD no fue evidente. Esto muestra que el ácido oxálico acelera la descomposición de ROS bajo estrés por Cd y completa principalmente la eliminación de H2O2 regulando la actividad de CAT, lo que es similar a los resultados de la investigación de Guo et al.41 sobre las enzimas antioxidantes de Pseudospermum sibiricum. Kos. ). El efecto de agregar 750 kg/h/m2 de cal sobre la actividad de las enzimas del sistema antioxidante y el contenido de malondialdehído es similar al efecto de la pulverización con ácido oxálico. Los resultados mostraron que el tratamiento por pulverización con ácido oxálico podría mejorar más eficazmente las actividades de SOD y CAT en Panax notoginseng y mejorar la resistencia al estrés de Panax notoginseng. Las actividades de SOD y POD disminuyeron con el tratamiento con 0,2 mol L-1 de ácido oxálico y 3750 kg hm-2 de cal, lo que indica que la pulverización excesiva de altas concentraciones de ácido oxálico y Ca2+ puede causar estrés en las plantas, lo cual es consistente con el estudio de Luo y otros. Wait 42.