Previamente informamos que los niveles séricos del metabolito del triptófano derivado del intestino, el ácido indol-3-propiónico (IPA), son más bajos en pacientes con fibrosis hepática. En este estudio, investigamos el transcriptoma y el metiloma del ADN en hígados obesos en relación con los niveles séricos de IPA, así como el papel del IPA en la inducción de la inactivación fenotípica de las células estrelladas hepáticas (HSC) in vitro.
El estudio incluyó a 116 pacientes obesos sin diabetes mellitus tipo 2 (DM2) (edad 46,8 ± 9,3 años; IMC: 42,7 ± 5,0 kg/m²) que se sometieron a cirugía bariátrica en el Centro de Cirugía Bariátrica de Kuopio (KOBS). Los niveles circulantes de IPA se midieron mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), el análisis del transcriptoma hepático se realizó mediante secuenciación de ARN total y el análisis de metilación del ADN se realizó utilizando el chip Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Se utilizaron células estrelladas hepáticas humanas (LX-2) para los experimentos in vitro.
Los niveles séricos de IPA se correlacionaron con la expresión de genes implicados en las vías apoptóticas, mitofágicas y de longevidad en el hígado. El gen de la serina/treonina quinasa 1 (AKT1) fue el gen de interacción más abundante y dominante en los perfiles de transcripción y metilación del ADN hepáticos. El tratamiento con IPA indujo apoptosis, disminuyó la respiración mitocondrial y alteró la morfología celular y la dinámica mitocondrial mediante la modulación de la expresión de genes conocidos por regular la fibrosis, la apoptosis y la supervivencia de las células LX-2.
En conjunto, estos datos respaldan la idea de que el IPA tiene potenciales efectos terapéuticos y puede inducir la apoptosis y modificar el fenotipo de las células estrelladas hepáticas hacia un estado inactivo, ampliando así la posibilidad de inhibir la fibrosis hepática al interferir con la activación de las células estrelladas hepáticas y el metabolismo mitocondrial.
La prevalencia de la obesidad y el síndrome metabólico se ha asociado con una incidencia creciente de enfermedad del hígado graso asociada metabólicamente (EHGAM); la enfermedad afecta al 25% al ​​30% de la población general [1]. La principal consecuencia de la etiología de la EHGAM es la fibrosis hepática, un proceso dinámico caracterizado por la acumulación continua de matriz extracelular fibrosa (MEC) [2]. Las principales células involucradas en la fibrosis hepática son las células estrelladas hepáticas (CEH), que exhiben cuatro fenotipos conocidos: quiescente, activado, inactivado y senescente [3, 4]. Las CEH pueden activarse y transdiferenciarse de una forma quiescente a células proliferativas similares a fibroblastos con altas demandas de energía, con una mayor expresión de actina α-muscular lisa (α-SMA) y colágeno tipo I (Col-I) [5, 6]. Durante la reversión de la fibrosis hepática, las CEH activadas se eliminan mediante apoptosis o inactivación. Estos procesos incluyen la regulación negativa de genes fibrogénicos y la modulación de genes prosupervivencia (como las vías de señalización NF-κB y PI3K/Akt) [7, 8], así como cambios en la dinámica y la función mitocondrial [9].
Se ha observado que los niveles séricos del metabolito del triptófano, el ácido indol-3-propiónico (IPA), producido en el intestino, disminuyen en enfermedades metabólicas humanas, incluida la MASLD [10–13]. El IPA se asocia con la ingesta de fibra dietética, es conocido por sus efectos antioxidantes y antiinflamatorios, y atenúa el fenotipo de esteatohepatitis no alcohólica (NASH) inducida por la dieta in vivo e in vitro [11–14]. Parte de esta evidencia proviene de nuestro estudio previo, que demostró que los niveles séricos de IPA eran menores en pacientes con fibrosis hepática que en pacientes obesos sin fibrosis hepática en el Estudio de Cirugía Bariátrica de Kuopio (KOBS). Además, demostramos que el tratamiento con IPA podría reducir la expresión de genes que son marcadores clásicos de adhesión celular, migración celular y activación de células madre hematopoyéticas en un modelo de células estrelladas hepáticas humanas (LX-2) y es un metabolito hepatoprotector potencial [15]. Sin embargo, aún no está claro cómo el IPA induce la regresión de la fibrosis hepática mediante la activación de la apoptosis de las células estrelladas hepáticas y la bioenergética mitocondrial.
En este estudio, demostramos que el IPA sérico se asocia con la expresión de genes implicados en vías de apoptosis, mitofagia y longevidad en el hígado de individuos obesos sin diabetes tipo 2 (KOBS). Además, observamos que el IPA puede inducir la eliminación y degradación de células madre hematopoyéticas (CMH) activadas mediante la vía de inactivación. Estos resultados revelan una nueva función del IPA, lo que lo convierte en una posible diana terapéutica para promover la regresión de la fibrosis hepática.
Un estudio previo en la cohorte KOBS mostró que los pacientes con fibrosis hepática tenían niveles circulantes de IPA más bajos en comparación con los pacientes sin fibrosis hepática [15]. Para excluir el posible efecto de confusión de la diabetes tipo 2, reclutamos a 116 pacientes obesos sin diabetes tipo 2 (edad media ± DE: 46,8 ± 9,3 años; IMC: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (Tabla 1) del estudio KOBS en curso como población de estudio [16]. Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito y el protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital del Condado de North Savo de acuerdo con la Declaración de Helsinki (54/2005, 104/2008 y 27/2010).
Las muestras de biopsia hepática se obtuvieron durante la cirugía bariátrica y fueron evaluadas histológicamente por patólogos experimentados según criterios previamente descritos [17, 18]. Los criterios de evaluación se resumen en la Tabla Suplementaria S1 y se han descrito previamente [19].
Se analizaron muestras de suero en ayunas mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) no dirigida para el análisis metabolómico (n = 116). Las muestras se analizaron utilizando un sistema UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Alemania) como se describió previamente19. La identificación del alcohol isopropílico (IPA) se basó en el tiempo de retención y la comparación del espectro MS/MS con estándares puros. La intensidad de la señal de IPA (área del pico) se consideró en todos los análisis posteriores [20].
Se realizó la secuenciación de ARN del hígado completo utilizando Illumina HiSeq 2500 y los datos se preprocesaron como se describió anteriormente [19, 21, 22]. Realizamos un análisis de expresión diferencial dirigido de transcritos que afectan la función/biogénesis mitocondrial utilizando 1957 genes seleccionados de la base de datos MitoMiner 4.0 [23]. El análisis de metilación del ADN hepático se realizó utilizando el chip Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.) utilizando la misma metodología que se describió anteriormente [24, 25].
Las células estrelladas hepáticas humanas (LX-2) fueron amablemente proporcionadas por el Prof. Stefano Romeo y se cultivaron y mantuvieron en medio DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Para seleccionar la dosis de trabajo de IPA, las células LX-2 se trataron con diferentes concentraciones de IPA (10 μM, 100 μM y 1 mM; Sigma, 220027) en medio DMEM/F12 durante 24 h. Además, para investigar la capacidad de IPA para inactivar las HSC, las células LX-2 se trataron simultáneamente con 5 ng/ml de TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) y 1 mM de IPA en medio libre de suero durante 24 h. Para los controles del vehículo correspondientes, se utilizó HCl 4 nM que contenía 0,1 % de BSA para el tratamiento con TGF-β1 y DMSO 0,05 % para el tratamiento con IPA, y ambos se utilizaron conjuntamente para el tratamiento combinado.
La apoptosis se evaluó utilizando el kit de detección de apoptosis FITC Annexin V con 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, EE. UU., Cat# 640922) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células LX-2 (1 × 10⁵ células/pocillo) se cultivaron durante la noche en placas de 12 pocillos y luego se trataron con dosis múltiples de IPA o IPA y TGF-β1. Al día siguiente, las células flotantes y adherentes se recolectaron, se tripsinizaron, se lavaron con PBS, se resuspendieron en tampón de unión de anexina V y se incubaron con FITC-anexina V y 7-AAD durante 15 minutos.
Las mitocondrias en células vivas se tiñeron para detectar actividad oxidativa usando Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Para los ensayos de MTR, las células LX-2 se incubaron a densidades iguales con IPA y TGF-β1. Después de 24 h, las células vivas se tripsinizaron, se lavaron con PBS y luego se incubaron con 100 μM de MTR en medio libre de suero a 37 °C durante 20 min como se describió previamente [ 26 ]. Para el análisis de la morfología de las células vivas, el tamaño celular y la complejidad citoplasmática se analizaron usando los parámetros de dispersión frontal (FSC) y dispersión lateral (SSC), respectivamente.
Todos los datos (30.000 eventos) se adquirieron utilizando NovoCyte Quanteon (Agilent) y se analizaron utilizando el software NovoExpress® 1.4.1 o FlowJo V.10.
La tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) se midieron en tiempo real utilizando un analizador de flujo extracelular Seahorse (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) equipado con un Seahorse XF Cell Mito Stress según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se sembraron 2 × 10⁴ células LX-2/pocillo en placas de cultivo celular XF96. Después de la incubación nocturna, las células se trataron con isopropanol (IPA) y TGF-β1 (Métodos suplementarios 1). El análisis de datos se realizó utilizando el software Seahorse XF Wave, que incluye el generador de informes de prueba de fenotipo de energía celular Seahorse XF. A partir de esto, se calculó un índice de salud bioenergética (BHI) [27].
El ARN total se transcribió a ADNc. Para métodos específicos, consulte la referencia [15]. Los niveles de ARNm de la proteína ácida ribosomal 60S humana P0 (RPLP0) y la ciclofilina A1 (PPIA) se utilizaron como controles genéticos constitutivos. El sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 6 pro (Thermo Fisher, Landsmeer, Países Bajos) se utilizó con el kit TaqMan™ Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) o el kit Sensifast SYBR Lo-ROX (Bioline, BIO 94050), y el pliegue de expresión génica relativa se calculó utilizando parámetros de ciclo de valor Ct comparativos (ΔΔCt) y el método ∆∆Ct. Los detalles de los cebadores se proporcionan en las Tablas Suplementarias S2 y S3.
El ADN nuclear (ADNnc) y el ADN mitocondrial (ADNmt) se extrajeron utilizando el kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen), como se describió previamente [28]. La cantidad relativa de ADNmt se calculó dividiendo la proporción de cada región objetivo de ADNmt entre la media geométrica de las tres regiones de ADN nuclear (ADNmt/ADNnc), tal como se detalla en los Métodos complementarios 2. Los detalles de los cebadores para ADNmt y ADNnc se proporcionan en la Tabla complementaria S4.
Las células vivas se tiñeron con Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) para visualizar las redes mitocondriales intercelulares e intracelulares. Las células LX-2 (1 × 10⁴ células/pocillo) se cultivaron en portaobjetos de vidrio en placas de cultivo con fondo de vidrio correspondientes (Ibidi GmbH, Martinsried, Alemania). Después de 24 h, las células LX-2 vivas se incubaron con 100 μM de MTR durante 20 min a 37 °C y los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) como se describió previamente [29]. Las redes mitocondriales se visualizaron utilizando un microscopio invertido Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Alemania) equipado con un módulo confocal Zeiss LSM 800 a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO2 utilizando un objetivo de 63×NA 1.3. Adquirimos diez imágenes de la serie Z para cada tipo de muestra. Cada serie Z contiene 30 secciones, cada una con un grosor de 9,86 μm. Para cada muestra, se adquirieron imágenes de diez campos de visión diferentes utilizando el software ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Alemania), y el análisis de la morfología mitocondrial se realizó utilizando el software ImageJ (v1.54d) [30, 31] de acuerdo con los parámetros detallados en los Métodos suplementarios 3.
Las células se fijaron con glutaraldehído al 2% en tampón fosfato 0,1 M, seguido de una fijación con solución de tetróxido de osmio al 1% (Sigma Aldrich, MO, EE. UU.), se deshidrataron gradualmente con acetona (Merck, Darmstadt, Alemania) y, finalmente, se incluyeron en resina epoxi. Se prepararon secciones ultrafinas y se tiñeron con acetato de uranilo al 1% (Merck, Darmstadt, Alemania) y citrato de plomo al 1% (Merck, Darmstadt, Alemania). Las imágenes ultraestructurales se obtuvieron utilizando un microscopio electrónico de transmisión JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokio, Japón) con un voltaje de aceleración de 80 kV.
La morfología de las células LX-2 tratadas con IPA durante 24 h se analizó mediante microscopía de contraste de fases con un aumento de 50x utilizando un microscopio óptico invertido Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 y AxioCam MRm, Jena, Alemania).
Los datos clínicos se expresaron como media ± desviación estándar o mediana (rango intercuartílico: RIC). Se utilizó el análisis de varianza unidireccional (variables continuas) o la prueba χ² (variables categóricas) para comparar las diferencias entre los tres grupos de estudio. Se empleó la tasa de falsos positivos (FDR) para corregir las comparaciones múltiples, y los genes con FDR < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Se utilizó el análisis de correlación de Spearman para correlacionar la metilación del ADN CpG con la intensidad de la señal IPA, y se informaron los valores p nominales (p < 0,05).
Se realizó un análisis de vías metabólicas utilizando una herramienta de análisis de conjuntos de genes basada en la web (WebGestalt) para 268 transcripciones (p nominal < 0,01), 119 transcripciones asociadas a mitocondrias (p nominal < 0,05) y 4350 CpG de un total de 3093 transcripciones hepáticas asociadas con los niveles séricos circulantes de IPA. Se utilizó la herramienta Venny DB (versión 2.1.0), de libre acceso, para encontrar genes superpuestos, y StringDB (versión 11.5) para visualizar las interacciones proteína-proteína.
Para el experimento LX-2, se evaluó la normalidad de las muestras mediante la prueba de D'Agostino-Pearson. Los datos se obtuvieron de al menos tres réplicas biológicas y se sometieron a un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la prueba post hoc de Bonferroni. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p inferior a 0,05. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE), y el número de experimentos se indica en cada figura. Todos los análisis y gráficos se realizaron con el software estadístico GraphPad Prism 8 para Windows (GraphPad Software Inc., versión 8.4.3, San Diego, EE. UU.).
Primero, investigamos la asociación de los niveles séricos de IPA con los transcritos hepáticos, corporales y mitocondriales. En el perfil de transcritos totales, el gen más fuertemente asociado con los niveles séricos de IPA fue MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; proteína quinasa activada por mitógeno 3); en el perfil de transcritos relacionados con las mitocondrias, el gen más fuertemente asociado fue AKT1 (FDR = 0,7621; serina/treonina quinasa AKT 1) (Archivo adicional 1 y Archivo adicional 2).
Luego analizamos los transcritos globales (n = 268; p < 0,01) y los transcritos asociados a las mitocondrias (n = 119; p < 0,05), identificando finalmente la apoptosis como la vía canónica más significativa (p = 0,0089). Para los transcritos mitocondriales asociados con los niveles séricos de IPA, nos centramos en la apoptosis (FDR = 0,00001), la mitofagia (FDR = 0,00029) y las vías de señalización del TNF (FDR = 0,000006) (Figura 1A, Tabla 2 y Figuras suplementarias 1A-B).
Análisis superpuesto de transcritos globales, asociados a mitocondrias y metilación del ADN en hígado humano en asociación con los niveles séricos de IPA. A representa 268 transcritos globales, 119 transcritos asociados a mitocondrias y transcritos metilados del ADN que se mapean a 3092 sitios CpG asociados con los niveles séricos de IPA (valores p ​​< 0,01 para transcritos globales y ADN metilado, y valores p ​​< 0,05 para transcritos mitocondriales). Los principales transcritos superpuestos se muestran en el centro (AKT1 y YKT6). B El mapa de interacción de los 13 genes con la puntuación de interacción más alta (0,900) con otros genes se construyó a partir de los 56 genes superpuestos (región de línea negra) que se asociaron significativamente con los niveles séricos de IPA utilizando la herramienta en línea StringDB. Verde: Genes mapeados al componente celular de Gene Ontology (GO): mitocondrias (GO:0005739). AKT1 es la proteína con la puntuación más alta (0,900) en cuanto a interacciones con otras proteínas, según los datos (obtenidos mediante minería de texto, experimentos, bases de datos y coexpresión). Los nodos de la red representan proteínas y las aristas representan conexiones entre ellas.
Dado que los metabolitos de la microbiota intestinal pueden regular la composición epigenética a través de la metilación del ADN [32], investigamos si los niveles séricos de IPA estaban asociados con la metilación del ADN hepático. Encontramos que los dos principales sitios de metilación asociados con los niveles séricos de IPA estaban cerca de la región 3 rica en prolina-serina (C19orf55) y el miembro 6 de la familia B (pequeña) de la proteína de choque térmico (HSPB6) (Archivo adicional 3). La metilación del ADN de 4350 CpG (p < 0,01) se correlacionó con los niveles séricos de IPA y se enriqueció en vías reguladoras de la longevidad (p = 0,006) (Figura 1A, Tabla 2 y Figura suplementaria 1C).
Para comprender los mecanismos biológicos subyacentes a las asociaciones entre los niveles séricos de IPA, los transcritos globales, los transcritos asociados a las mitocondrias y la metilación del ADN en el hígado humano, realizamos un análisis de solapamiento de los genes identificados en el análisis de vías anterior (Figura 1A). Los resultados del análisis de enriquecimiento de vías de los 56 genes solapados (dentro de la línea negra en la Figura 1A) mostraron que la vía de apoptosis (p = 0,00029) destacó dos genes comunes a los tres análisis: AKT1 y YKT6 (homólogo de YKT6 v-SNARE), como se muestra en el diagrama de Venn (Figura suplementaria 2 y Figura 1A). Curiosamente, encontramos que AKT1 (cg19831386) y YKT6 (cg24161647) estaban correlacionados positivamente con los niveles séricos de IPA (Archivo adicional 3). Para identificar posibles interacciones proteicas entre productos génicos, seleccionamos 13 genes con la puntuación de región común más alta (0,900) entre 56 genes superpuestos como entrada y construimos un mapa de interacción. Según el nivel de confianza (confianza marginal), el gen AKT1 con la puntuación más alta (0,900) se encontraba en la parte superior (Figura 1B).
Basándonos en el análisis de vías, encontramos que la apoptosis era la vía principal, por lo que investigamos si el tratamiento con IPA afectaría la apoptosis de las HSC in vitro. Previamente demostramos que diferentes dosis de IPA (10 μM, 100 μM y 1 mM) no eran tóxicas para las células LX-2 [15]. Este estudio mostró que el tratamiento con IPA a 10 μM y 100 μM aumentó el número de células viables y necróticas. Sin embargo, en comparación con el grupo control, la viabilidad celular disminuyó a una concentración de 1 mM de IPA, mientras que la tasa de necrosis celular se mantuvo sin cambios (Figura 2A, B). A continuación, para encontrar la concentración óptima para inducir apoptosis en células LX-2, probamos 10 μM, 100 μM y 1 mM de IPA durante 24 h (Figura 2A-E y Figura suplementaria 3A-B). Curiosamente, IPA 10 μM y 100 μM disminuyeron la tasa de apoptosis (%), sin embargo, IPA 1 mM aumentó la apoptosis tardía y la tasa de apoptosis (%) en comparación con el control y, por lo tanto, fue elegido para experimentos posteriores (Figuras 2A–D).
El IPA induce la apoptosis de las células LX-2. Se utilizó el método de doble tinción con anexina V y 7-AAD para cuantificar la tasa de apoptosis y la morfología celular mediante citometría de flujo. Las células BA se incubaron con 10 μM, 100 μM y 1 mM de IPA durante 24 h o con F–H TGF-β1 (5 ng/ml) y 1 mM de IPA en medio libre de suero durante 24 h. A: células vivas (Anexina V -/ 7AAD-); B: células necróticas (Anexina V -/ 7AAD+); C, F: tempranas (Anexina V +/ 7AAD-); D, G: tardías (Anexina V+/7AAD+); E, H: porcentaje de células apoptóticas tempranas y tardías totales en la tasa de apoptosis (%). Los datos se expresan como media ± DE, n = 3 experimentos independientes. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Bonferroni. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Como hemos demostrado previamente, 5 ng/ml de TGF-β1 pueden inducir la activación de HSC al aumentar la expresión de genes marcadores clásicos [15]. Las células LX-2 se trataron con 5 ng/ml de TGF-β1 y 1 mM de IPA en combinación (Fig. 2E–H). El tratamiento con TGF-β1 no modificó la tasa de apoptosis; sin embargo, el tratamiento combinado con IPA aumentó la apoptosis tardía y la tasa de apoptosis (%) en comparación con el tratamiento con TGF-β1 (Fig. 2E–H). Estos resultados indican que 1 mM de IPA puede promover la apoptosis en células LX-2 independientemente de la inducción por TGF-β1.
Investigamos más a fondo el efecto del IPA sobre la respiración mitocondrial en células LX-2. Los resultados mostraron que 1 mM de IPA disminuyó los parámetros de la tasa de consumo de oxígeno (OCR): respiración no mitocondrial, respiración basal y máxima, fuga de protones y producción de ATP en comparación con el grupo de control (Figura 3A, B), mientras que el índice de salud bioenergética (BHI) no cambió.
El IPA reduce la respiración mitocondrial en células LX-2. La curva de respiración mitocondrial (CRM) se presenta como parámetros de respiración mitocondrial (respiración no mitocondrial, respiración basal, respiración máxima, fuga de protones, generación de ATP, SRC y BHI). Las células A y B se incubaron con 10 μM, 100 μM y 1 mM de IPA durante 24 h, respectivamente. Las células C y D se incubaron con TGF-β1 (5 ng/ml) y 1 mM de IPA en medio libre de suero durante 24 h, respectivamente. Todas las mediciones se normalizaron al contenido de ADN utilizando el kit CyQuant. BHI: índice de salud bioenergética; SRC: capacidad de reserva respiratoria; CRM: tasa de consumo de oxígeno. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE), n = 5 experimentos independientes. Las comparaciones estadísticas se realizaron utilizando ANOVA unidireccional y la prueba post hoc de Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; y ***p < 0,001
Para comprender mejor el efecto del IPA en el perfil bioenergético de las células LX-2 activadas por TGF-β1, analizamos la fosforilación oxidativa mitocondrial mediante OCR (Fig. 3C,D). Los resultados mostraron que el tratamiento con TGF-β1 redujo la respiración máxima, la capacidad de reserva respiratoria (SRC) y el BHI en comparación con el grupo control (Fig. 3C,D). Además, el tratamiento combinado disminuyó la respiración basal, la fuga de protones y la producción de ATP, pero la SRC y el BHI fueron significativamente mayores que en los grupos tratados con TGF-β1 (Fig. 3C,D).
También realizamos la “Prueba de Fenotipo de Energía Celular” proporcionada por el software Seahorse (Fig. suplementaria 4A–D). Como se muestra en la Fig. suplementaria 3B, los potenciales metabólicos de OCR y ECAR disminuyeron después del tratamiento con TGF-β1, sin embargo, no se observó diferencia en los grupos de tratamiento combinado e IPA en comparación con el grupo control. Además, los niveles basales y de estrés de OCR disminuyeron después del tratamiento combinado e IPA en comparación con el grupo control (Fig. suplementaria 4C). Curiosamente, se observó un patrón similar con la terapia combinada, donde no se observó ningún cambio en los niveles basales y de estrés de ECAR en comparación con el tratamiento con TGF-β1 (Fig. suplementaria 4C). En HSC, la reducción en la fosforilación oxidativa mitocondrial y la capacidad del tratamiento combinado para restaurar SCR y BHI después de la exposición al tratamiento con TGF-β1 no alteraron el potencial metabólico (OCR y ECAR). En conjunto, estos resultados indican que el IPA puede reducir la bioenergética en las HSC, lo que sugiere que el IPA puede inducir un perfil energético más bajo que desplaza el fenotipo de las HSC hacia la inactivación (Figura suplementaria 4D).
El efecto del IPA en la dinámica mitocondrial se investigó utilizando la cuantificación tridimensional de la morfología mitocondrial y las conexiones de la red, así como la tinción MTR (Figura 4 y Figura suplementaria 5). La Figura 4 muestra que, en comparación con el grupo control, el tratamiento con TGF-β1 disminuyó el área superficial media, el número de ramificaciones, la longitud total de las ramificaciones y el número de uniones de ramificaciones (Figura 4A y B) y cambió la proporción de mitocondrias de morfología esférica a intermedia (Figura 4C). Solo el tratamiento con IPA disminuyó el volumen mitocondrial medio y cambió la proporción de mitocondrias de morfología esférica a intermedia en comparación con el grupo control (Figura 4A). Por el contrario, la esfericidad, la longitud media de las ramificaciones y la actividad mitocondrial evaluada por MTR dependiente del potencial de membrana mitocondrial (Figura 4A y E) permanecieron sin cambios y estos parámetros no difirieron entre los grupos. En conjunto, estos resultados sugieren que el tratamiento con TGF-β1 e IPA parece modular la forma y el tamaño mitocondrial, así como la complejidad de la red en células LX-2 vivas.
IPA altera la dinámica mitocondrial y la abundancia de ADN mitocondrial en células LX-2. A. Imágenes confocales representativas de células LX-2 vivas incubadas con TGF-β1 (5 ng/ml) y 1 mM de IPA durante 24 h en medio libre de suero que muestran redes mitocondriales teñidas con Mitotracker™ Red CMXRos y núcleos teñidos de azul con DAPI. Todos los datos contenían al menos 15 imágenes por grupo. Adquirimos 10 imágenes de pila Z para cada tipo de muestra. Cada secuencia del eje Z contenía 30 cortes, cada uno con un grosor de 9,86 μm. Barra de escala: 10 μm. B. Objetos representativos (solo mitocondrias) identificados mediante la aplicación de umbralización adaptativa a la imagen. Se realizó un análisis cuantitativo y una comparación de las conexiones de la red morfológica mitocondrial para todas las células en cada grupo. C. Frecuencia de las proporciones de forma mitocondrial. Los valores cercanos a 0 indican formas esféricas, y los valores cercanos a 1 indican formas filamentosas. D El contenido de ADN mitocondrial (ADNmt) se determinó como se describe en Materiales y Métodos. E El análisis de Mitotracker™ Red CMXRos se realizó mediante citometría de flujo (30 000 eventos) como se describe en Materiales y Métodos. Los datos se presentan como media ± desviación estándar, n = 3 experimentos independientes. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante ANOVA unidireccional y la prueba post hoc de Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Luego analizamos el contenido de ADNmt en células LX-2 como indicador del número de mitocondrias. En comparación con el grupo control, el contenido de ADNmt aumentó en el grupo tratado con TGF-β1 (Figura 4D). En comparación con el grupo tratado con TGF-β1, el contenido de ADNmt disminuyó en el grupo de tratamiento combinado (Figura 4D), lo que sugiere que el IPA puede reducir el contenido de ADNmt y posiblemente el número de mitocondrias, así como la respiración mitocondrial (Figura 3C). Además, el IPA pareció reducir el contenido de ADNmt en el tratamiento combinado, pero no afectó la actividad mitocondrial mediada por MTR (Figuras 4A-C).
Investigamos la asociación de IPA con los niveles de ARNm de genes asociados con fibrosis, apoptosis, supervivencia y dinámica mitocondrial en células LX-2 (Figura 5A–D). En comparación con el grupo de control, el grupo tratado con TGF-β1 mostró una mayor expresión de genes como la cadena α2 del colágeno tipo I (COL1A2), la actina α del músculo liso (αSMA), la metaloproteinasa de matriz 2 (MMP2), el inhibidor tisular de la metaloproteinasa 1 (TIMP1) y el gen similar a la dinamina 1 (DRP1), lo que indica un aumento de la fibrosis y la activación. Además, en comparación con el grupo control, el tratamiento con TGF-β1 redujo los niveles de ARNm del receptor nuclear de pregnano X (PXR), caspasa 8 (CASP8), MAPKAPK3, inhibidor de células B α, potenciador del péptido ligero del gen del factor nuclear κ (NFκB1A) e inhibidor de la subunidad β de la quinasa del factor nuclear κB (IKBKB) (Figura 5A–D). En comparación con el tratamiento con TGF-β1, el tratamiento combinado con TGF-β1 e IPA redujo la expresión de COL1A2 y MMP2, pero aumentó los niveles de ARNm de PXR, TIMP1, linfoma de células B-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β e IKBKB. El tratamiento con IPA disminuyó significativamente la expresión de MMP2, proteína X asociada a Bcl-2 (BAX), AKT1, proteína de atrofia óptica 1 (OPA1) y proteína de fusión mitocondrial 2 (MFN2), mientras que la expresión de CASP8, NFκB1A, NFκB1B e IKBKB aumentó en comparación con el grupo control. Sin embargo, no se encontraron diferencias en la expresión de caspasa-3 (CASP3), factor activador de peptidasa apoptótica 1 (APAF1), proteína de fusión mitocondrial 1 (MFN1) y proteína de fisión 1 (FIS1). En conjunto, estos resultados sugieren que el tratamiento con IPA modula la expresión de genes asociados con fibrosis, apoptosis, supervivencia y dinámica mitocondrial. Nuestros datos sugieren que el tratamiento con IPA reduce la fibrosis en células LX-2; al mismo tiempo, estimula la supervivencia al cambiar el fenotipo hacia la inactivación.
El IPA modula la expresión de genes relacionados con fibroblastos, apoptosis, viabilidad y dinámica mitocondrial en células LX-2. Los histogramas muestran la expresión de ARNm en relación con el control endógeno (RPLP0 o PPIA) después de que las células LX-2 fueran inducidas con TGF-β1 e IPA en medio libre de suero durante 24 h. A indica fibroblastos, B indica células apoptóticas, C indica células supervivientes y D indica la expresión de genes relacionados con la dinámica mitocondrial. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE), n = 3 experimentos independientes. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante ANOVA unidireccional y la prueba post hoc de Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Luego, se evaluaron los cambios en el tamaño celular (FSC-H) y la complejidad citoplasmática (SSC-H) mediante citometría de flujo (Figura 6A,B), y los cambios en la morfología celular después del tratamiento con IPA se evaluaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y microscopía de contraste de fase (Figura suplementaria 6A-B). Como era de esperar, las células en el grupo tratado con TGF-β1 aumentaron de tamaño en comparación con el grupo control (Figura 6A,B), mostrando la expansión clásica del retículo endoplasmático rugoso (ER*) y los fagolisosomas (P), lo que indica la activación de las células madre hematopoyéticas (HSC) (Figura suplementaria 6A). Sin embargo, en comparación con el grupo tratado con TGF-β1, el tamaño celular, la complejidad citoplasmática (Fig. 6A,B) y el contenido de ER* disminuyeron en el grupo de tratamiento combinado con TGF-β1 e IPA (Figura suplementaria 6A). Además, el tratamiento con IPA disminuyó el tamaño celular, la complejidad citoplasmática (Figs. 6A,B), el contenido de P y ER* (Fig. suplementaria 6A) en comparación con el grupo control. Asimismo, el contenido de células apoptóticas aumentó después de 24 h de tratamiento con IPA en comparación con el grupo control (flechas blancas, Fig. suplementaria 6B). En conjunto, estos resultados sugieren que 1 mM de IPA puede estimular la apoptosis de las HSC y revertir los cambios en los parámetros morfológicos celulares inducidos por TGF-β1, regulando así el tamaño y la complejidad celular, lo que podría estar asociado con la inactivación de las HSC.
El IPA altera el tamaño celular y la complejidad citoplasmática en células LX-2. Imágenes representativas del análisis de citometría de flujo. El análisis utilizó una estrategia de compuerta específica para células LX-2: SSC-A/FSC-A para definir la población celular, FSC-H/FSC-A para identificar dobletes y SSC-H/FSC-H para el análisis del tamaño y la complejidad celular. Las células se incubaron con TGF-β1 (5 ng/ml) y 1 mM de IPA en medio libre de suero durante 24 h. Las células LX-2 se distribuyeron en el cuadrante inferior izquierdo (SSC-H-/FSC-H-), cuadrante superior izquierdo (SSC-H+/FSC-H-), cuadrante inferior derecho (SSC-H-/FSC-H+) y cuadrante superior derecho (SSC-H+/FSC-H+) para el análisis del tamaño celular y la complejidad citoplasmática. B. La morfología celular se analizó mediante citometría de flujo utilizando FSC-H (dispersión frontal, tamaño celular) y SSC-H (dispersión lateral, complejidad citoplasmática) (30 000 eventos). Los datos se presentan como media ± desviación estándar, n = 3 experimentos independientes. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante ANOVA unidireccional y la prueba post hoc de Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 y ****p < 0,0001
Los metabolitos intestinales como el IPA se han convertido en un tema de investigación de gran interés, lo que sugiere que podrían descubrirse nuevas dianas en la microbiota intestinal. Por lo tanto, resulta interesante que el IPA, un metabolito que hemos relacionado con la fibrosis hepática en humanos [15], haya demostrado ser un compuesto antifibrótico potencial en modelos animales [13, 14]. En este estudio, demostramos por primera vez una asociación entre el IPA sérico y la transcriptómica hepática global y la metilación del ADN en individuos obesos sin diabetes tipo 2 (DM2), destacando la apoptosis, la mitofagia y la longevidad, así como un posible gen candidato, AKT1, que regula la homeostasis hepática. Otra novedad de nuestro estudio es que demostramos la interacción del tratamiento con IPA con la apoptosis, la morfología celular, la bioenergética mitocondrial y la dinámica en células LX-2, lo que indica un espectro energético más bajo que desplaza el fenotipo de las HSC hacia la inactivación, convirtiendo al IPA en un candidato potencial para mejorar la fibrosis hepática.
Descubrimos que la apoptosis, la mitofagia y la longevidad fueron las vías canónicas más importantes enriquecidas en genes hepáticos asociados con IPA sérico circulante. La alteración del sistema de control de calidad mitocondrial (MQC) puede conducir a disfunción mitocondrial, mitofagia y apoptosis, promoviendo así la aparición de MASLD[33, 34]. Por lo tanto, podemos especular que el IPA puede estar involucrado en el mantenimiento de la dinámica celular y la integridad mitocondrial a través de la apoptosis, la mitofagia y la longevidad en el hígado. Nuestros datos mostraron que dos genes eran comunes en los tres ensayos: YKT6 y AKT1. Cabe destacar que YKT6 es una proteína SNARE involucrada en el proceso de fusión de la membrana celular. Juega un papel en la autofagia y la mitofagia al formar un complejo de iniciación con STX17 y SNAP29 en el autofagosoma, promoviendo así la fusión de autofagosomas y lisosomas[35]. Además, la pérdida de la función de YKT6 resulta en una mitofagia alterada[36], mientras que la sobreexpresión de YKT6 se asocia con la progresión del carcinoma hepatocelular (CHC), mostrando una mayor supervivencia celular[37]. Por otro lado, AKT1 es el gen de interacción más importante y juega un papel importante en las enfermedades hepáticas, incluyendo la vía de señalización PI3K/AKT, el ciclo celular, la migración celular, la proliferación, la adhesión focal, la función mitocondrial y la secreción de colágeno[38–40]. La vía de señalización PI3K/AKT activada puede activar las células madre hematopoyéticas (CMH), que son las células responsables de la producción de la matriz extracelular (MEC), y su desregulación puede contribuir a la aparición y progresión de la fibrosis hepática[40]. Además, AKT es uno de los factores clave de supervivencia celular que inhibe la apoptosis celular dependiente de p53, y la activación de AKT puede estar asociada con la inhibición de la apoptosis de las células hepáticas[41, 42]. Los resultados obtenidos sugieren que el IPA podría estar implicado en la apoptosis hepática asociada a las mitocondrias, al influir en la decisión de los hepatocitos entre entrar en apoptosis o sobrevivir. Estos efectos podrían estar regulados por los genes candidatos AKT y/o YKT6, fundamentales para la homeostasis hepática.
Nuestros resultados mostraron que 1 mM de IPA indujo apoptosis y disminuyó la respiración mitocondrial en células LX-2 independientemente del tratamiento con TGF-β1. Es notable que la apoptosis es una vía principal para la resolución de la fibrosis y la activación de células madre hematopoyéticas (CMH), y también es un evento clave en la respuesta fisiológica reversible de la fibrosis hepática [4, 43]. Además, la restauración de BHI en células LX-2 después del tratamiento combinado proporcionó nuevas perspectivas sobre el papel potencial de IPA en la regulación de la bioenergética mitocondrial. En condiciones de reposo e inactividad, las células hematopoyéticas normalmente utilizan la fosforilación oxidativa mitocondrial para producir ATP y tienen baja actividad metabólica. Por otro lado, la activación de las CMH aumenta la respiración y biosíntesis mitocondrial para compensar las demandas de energía al entrar en el estado glucolítico [44]. El hecho de que IPA no afectara el potencial metabólico y ECAR sugiere que la vía glucolítica tiene menor prioridad. De manera similar, otro estudio mostró que 1 mM de IPA fue capaz de modular la actividad de la cadena respiratoria mitocondrial en cardiomiocitos, la línea celular de hepatocitos humanos (Huh7) y células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC); sin embargo, no se encontró ningún efecto de IPA sobre la glucólisis en cardiomiocitos, lo que sugiere que IPA puede afectar la bioenergética de otros tipos celulares [45]. Por lo tanto, especulamos que 1 mM de IPA puede actuar como un desacoplador químico suave, ya que puede reducir significativamente la expresión de genes fibrogénicos, la morfología celular y la bioenergética mitocondrial sin cambiar la cantidad de mtDNA [46]. Los desacopladores mitocondriales pueden inhibir la fibrosis inducida por cultivo y la activación de HSC [47] y reducir la producción de ATP mitocondrial regulada o inducida por ciertas proteínas como las proteínas desacopladoras (UCP) o la translocasa de nucleótidos de adenina (ANT). Dependiendo del tipo celular, este fenómeno puede proteger a las células de la apoptosis y/o promover la apoptosis [46]. Sin embargo, se necesitan más estudios para dilucidar el papel del IPA como desacoplador mitocondrial en la inactivación de las células madre hematopoyéticas.
Luego investigamos si los cambios en la respiración mitocondrial se reflejan en la morfología mitocondrial en células LX-2 vivas. Curiosamente, el tratamiento con TGF-β1 altera la proporción mitocondrial de esférica a intermedia, con una disminución de la ramificación mitocondrial y un aumento de la expresión de DRP1, un factor clave en la fisión mitocondrial [48]. Además, la fragmentación mitocondrial está asociada con la complejidad general de la red, y la transición de fusión a fisión es crítica para la activación de las células madre hematopoyéticas (CMH), mientras que la inhibición de la fisión mitocondrial conduce a la apoptosis de las CMH [49]. Por lo tanto, nuestros resultados indican que el tratamiento con TGF-β1 puede inducir una disminución en la complejidad de la red mitocondrial con una disminución de la ramificación, que es más común en la fisión mitocondrial asociada con las células madre hematopoyéticas (CMH) activadas. Además, nuestros datos mostraron que IPA podría cambiar la proporción de mitocondrias de forma esférica a intermedia, reduciendo así la expresión de OPA1 y MFN2. Estudios han demostrado que la regulación negativa de OPA1 podría causar una disminución del potencial de membrana mitocondrial y desencadenar la apoptosis celular[50]. Se sabe que MFN2 media la fusión mitocondrial y la apoptosis[51]. Los resultados obtenidos sugieren que la inducción de células LX-2 por TGF-β1 y/o IPA parece modular la forma y el tamaño mitocondrial, así como el estado de activación y la complejidad de la red.
Nuestros resultados indican que el tratamiento combinado de TGFβ-1 e IPA podría reducir el ADNmt y los parámetros morfológicos celulares regulando la expresión de ARNm de genes relacionados con la fibrosis, la apoptosis y la supervivencia en células que evaden la apoptosis. De hecho, IPA disminuyó el nivel de expresión de ARNm de AKT1 y genes importantes de fibrosis como COL1A2 y MMP2, pero aumentó el nivel de expresión de CASP8, que está asociado con la apoptosis. Nuestros resultados mostraron que después del tratamiento con IPA, la expresión de BAX disminuyó y la expresión de ARNm de las subunidades de la familia TIMP1, BCL-2 y NF-κB aumentó, lo que sugiere que IPA podría estimular señales de supervivencia en células madre hematopoyéticas (CMH) que evaden la apoptosis. Estas moléculas pueden actuar como señales pro-supervivencia en células madre hematopoyéticas activadas, lo que puede estar asociado con una mayor expresión de proteínas antiapoptóticas (como Bcl-2), una menor expresión de BAX proapoptótico y una interacción compleja entre TIMP y NF-κB [5, 7]. El IPA ejerce sus efectos a través del PXR, y encontramos que el tratamiento combinado con TGF-β1 e IPA aumentó los niveles de expresión de ARNm de PXR, lo que indica la supresión de la activación de HSC. Se sabe que la señalización de PXR activada inhibe la activación de HSC tanto in vivo como in vitro [52, 53]. Nuestros resultados indican que el IPA puede participar en la eliminación de HSC activadas al promover la apoptosis, reducir la fibrosis y el metabolismo mitocondrial, y mejorar las señales de supervivencia, que son procesos típicos que convierten el fenotipo de HSC activada en uno inactivado. Otra posible explicación para el mecanismo potencial y el papel del IPA en la apoptosis es que elimina mitocondrias disfuncionales principalmente a través de la mitofagia (vía intrínseca) y la vía de señalización extrínseca de TNF (Tabla 1), que está directamente vinculada a la vía de señalización de supervivencia NF-κB (Figura suplementaria 7). Curiosamente, los genes enriquecidos relacionados con IPA pueden inducir señales proapoptóticas y de supervivencia en la vía apoptótica [54], lo que sugiere que IPA podría inducir la vía apoptótica o la supervivencia mediante la interacción con estos genes. Sin embargo, aún no se comprende completamente cómo IPA induce la apoptosis o la supervivencia durante la activación de las células madre hematopoyéticas ni sus mecanismos.
El IPA es un metabolito microbiano formado a partir del triptófano dietético a través de la microbiota intestinal. Los estudios han demostrado que tiene propiedades antiinflamatorias, antioxidantes y reguladoras epigenéticas en el entorno intestinal.[55] Los estudios han demostrado que el IPA puede modular la función de la barrera intestinal y reducir el estrés oxidativo, lo que puede contribuir a sus efectos fisiológicos locales.[56] De hecho, el IPA se transporta a los órganos diana a través de la circulación, y dado que el IPA comparte una estructura de metabolito principal similar con el triptófano, la serotonina y los derivados del indol, el IPA ejerce acciones metabólicas que resultan en destinos metabólicos competitivos.[52] El IPA puede competir con los metabolitos derivados del triptófano por los sitios de unión en enzimas o receptores, lo que podría alterar las vías metabólicas normales. Esto resalta la necesidad de más estudios sobre su farmacocinética y farmacodinámica para comprender mejor su ventana terapéutica.[57] Queda por ver si esto también puede ocurrir en las células madre hematopoyéticas (CMH).
Reconocemos que nuestro estudio tiene algunas limitaciones. Para examinar específicamente las asociaciones relacionadas con el IPA, excluimos a los pacientes con diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Reconocemos que esto limita la aplicabilidad general de nuestros hallazgos a pacientes con diabetes mellitus tipo 2 y enfermedad hepática avanzada. Aunque la concentración fisiológica de IPA en suero humano es de 1 a 10 μM [11, 20], se eligió una concentración de 1 mM de IPA basándose en la concentración no tóxica más alta [15] y la tasa más alta de apoptosis, sin diferencia en el porcentaje de la población de células necróticas. Aunque en este estudio se utilizaron niveles suprafisiológicos de IPA, actualmente no existe consenso sobre la dosis efectiva de IPA [52]. Aunque nuestros resultados son significativos, el destino metabólico más amplio del IPA sigue siendo un área activa de investigación. Además, nuestros hallazgos sobre la asociación entre los niveles séricos de IPA y la metilación del ADN de los transcritos hepáticos se obtuvieron no solo de células madre hematopoyéticas (CMH) sino también de tejidos hepáticos. Elegimos utilizar células humanas LX-2 basándonos en nuestros hallazgos previos del análisis del transcriptoma, que indican que el IPA está asociado con la activación de las células madre hematopoyéticas (CMH) [15], y las CMH son las principales células implicadas en la progresión de la fibrosis hepática. El hígado está compuesto por múltiples tipos celulares, por lo que se deberían considerar otros modelos celulares, como el sistema de cocultivo de hepatocitos, CMH y células inmunitarias, combinado con la activación de caspasas y la fragmentación del ADN, así como el mecanismo de acción, incluyendo el nivel de proteínas, para estudiar el papel del IPA y su interacción con otros tipos de células hepáticas.