Diferentes teorías de defensa de las plantas proporcionan una guía teórica importante para explicar los patrones del metabolismo especializado de las plantas, pero sus predicciones clave aún deben probarse. Aquí, utilizamos el análisis de espectrometría de masas en tándem (MS/MS) imparcial para explorar sistemáticamente el metaboloma de cepas atenuadas de tabaco desde plantas individuales hasta poblaciones y especies estrechamente relacionadas, y procesamos una gran cantidad de teorías de características espectrométricas de masas basadas en espectros compuestos en la información. Marco para probar las predicciones clave de las teorías de defensa óptima (OD) y objetivo móvil (MT). El componente de información de la metabolómica de las plantas es consistente con la teoría de OD, pero contradice la predicción principal de la teoría de MT sobre la dinámica metabolómica causada por los herbívoros. Desde la escala evolutiva micro a la macro, la señal de jasmonato se identificó como el principal determinante de OD, mientras que la señal de etileno proporcionó un ajuste fino de la respuesta específica de los herbívoros anotada por la red molecular MS/MS.
Los metabolitos especiales con diversas estructuras son los principales participantes en la adaptación de las plantas al entorno, especialmente en la defensa de los enemigos (1). La sorprendente diversificación del metabolismo especial encontrado en las plantas ha estimulado décadas de investigación exhaustiva sobre sus numerosos aspectos de las funciones ecológicas y ha formado una larga lista de teorías de defensa de las plantas, que son el desarrollo evolutivo y ecológico de las interacciones planta-insecto. La investigación empírica proporciona una guía importante (2). Sin embargo, estas teorías de defensa de las plantas no siguieron la vía normativa del razonamiento deductivo hipotético, en el que las predicciones clave estaban en el mismo nivel de análisis (3) y se probaron experimentalmente para avanzar al siguiente ciclo de desarrollo teórico (4). Las limitaciones técnicas restringen la recopilación de datos a categorías metabólicas específicas y excluyen el análisis exhaustivo de metabolitos especializados, lo que impide las comparaciones entre categorías que son esenciales para el desarrollo teórico (5). La falta de datos metabolómicos completos y una moneda común para comparar el flujo de trabajo de procesamiento del espacio metabólico entre diferentes grupos de plantas obstaculiza la madurez científica del campo.
Los últimos avances en el campo de la metabolómica mediante espectrometría de masas en tándem (MS/MS) permiten caracterizar exhaustivamente los cambios metabólicos dentro y entre especies de un clado de sistema determinado, y pueden combinarse con métodos computacionales para calcular la similitud estructural entre estas mezclas complejas. Conocimientos previos de química (5). La combinación de tecnologías avanzadas de análisis e informática proporciona un marco necesario para la comprobación a largo plazo de numerosas predicciones realizadas por las teorías ecológicas y evolutivas de la diversidad metabólica. Shannon (6) introdujo la teoría de la información por primera vez en su artículo seminal de 1948, sentando las bases para el análisis matemático de la información, que se ha utilizado en muchos campos además de su aplicación original. En genómica, la teoría de la información se ha aplicado con éxito para cuantificar la información conservativa de secuencias (7). En la investigación transcriptómica, la teoría de la información analiza los cambios generales en el transcriptoma (8). En investigaciones anteriores, aplicamos el marco estadístico de la teoría de la información a la metabolómica para describir la experiencia metabólica a nivel tisular en plantas (9). Aquí, combinamos el flujo de trabajo basado en MS/MS con el marco estadístico de la teoría de la información, caracterizada por la diversidad metabólica en la moneda común, para comparar las predicciones clave de la teoría de defensa de las plantas del metaboloma inducido por herbívoros.
Los marcos teóricos de la defensa de las plantas suelen ser mutuamente inclusivos y pueden dividirse en dos categorías: los que intentan explicar la distribución de metabolitos específicos de las plantas basándose en funciones de defensa, como la defensa óptima (OD) (10), el objetivo móvil (MT) (11) ) y la teoría de la apariencia (12), mientras que otros buscan explicaciones mecánicas de cómo los cambios en la disponibilidad de recursos afectan el crecimiento de las plantas y la acumulación de metabolitos especializados, como el carbono: hipótesis del balance de nutrientes (13), hipótesis de la tasa de crecimiento (14 ), y la hipótesis del equilibrio de crecimiento y diferenciación (15). Los dos conjuntos de teorías se encuentran en diferentes niveles de análisis (4). Sin embargo, dos teorías que involucran funciones defensivas a nivel funcional dominan la conversación sobre las defensas constitutivas e inducibles de las plantas: la teoría de la OD, que asume que las plantas invierten en sus costosas defensas químicas solo cuando las necesitan, por ejemplo, cuando son ingeridas. Cuando un animal herbáceo ataca, por lo tanto, de acuerdo con la posibilidad de un ataque futuro, se asigna el compuesto con una función defensiva (10); La hipótesis MT propone que no existe un eje de cambio direccional de metabolitos, sino que estos cambian aleatoriamente, lo que crea la posibilidad de obstruir el objetivo metabólico de los herbívoros atacantes. En otras palabras, estas dos teorías hacen predicciones opuestas sobre la remodelación metabólica que ocurre tras el ataque de herbívoros: la relación entre la acumulación unidireccional de metabolitos con función defensiva (OD) y los cambios metabólicos no dirigidos (MT) (11).
Las hipótesis de OD y MT involucran no solo los cambios inducidos en el metaboloma, sino también las consecuencias ecológicas y evolutivas de la acumulación de estos metabolitos, como los costos y beneficios adaptativos de estos cambios metabólicos en un entorno ecológico específico (16). Si bien ambas hipótesis reconocen la función defensiva de los metabolitos especializados, que puede ser costosa o no, la predicción clave que distingue las hipótesis de OD y MT reside en la direccionalidad de los cambios metabólicos inducidos. La predicción de la teoría de OD ha recibido la mayor atención experimental hasta la fecha. Estas pruebas incluyen el estudio de las funciones de defensa directas o indirectas de diferentes tejidos frente a compuestos específicos en invernaderos y condiciones naturales, así como cambios en la etapa de desarrollo de la planta (17-19). Sin embargo, hasta el momento, debido a la falta de un flujo de trabajo y un marco estadístico para el análisis global e integral de la diversidad metabólica de cualquier organismo, la principal predicción de la diferencia entre las dos teorías (es decir, la dirección de los cambios metabólicos) aún no se ha probado. Aquí, proporcionamos dicho análisis.
Una de las características más significativas de los metabolitos específicos de las plantas es su extrema diversidad estructural a todos los niveles, desde plantas individuales y poblaciones hasta especies similares (20). Se pueden observar numerosos cambios cuantitativos en metabolitos especializados a escala poblacional, mientras que a nivel de especie se suelen mantener fuertes diferencias cualitativas (20). Por lo tanto, la diversidad metabólica vegetal es el principal aspecto de la diversidad funcional, reflejando la adaptabilidad a diferentes nichos, especialmente aquellos con diferentes posibilidades de invasión por insectos específicos y herbívoros comunes (21). Desde el artículo pionero de Fraenkel (22) sobre las razones de la existencia de metabolitos específicos de las plantas, las interacciones con diversos insectos se han considerado importantes presiones selectivas, y se cree que estas interacciones han moldeado las plantas durante la evolución. Vía metabólica (23). Las diferencias interespecies en la diversidad de metabolitos especializados también pueden reflejar el equilibrio fisiológico asociado con la defensa constitutiva e inducible de las plantas contra las estrategias herbívoras, ya que las dos especies suelen estar correlacionadas negativamente entre sí (24). Aunque puede ser beneficioso mantener una buena defensa en todo momento, los cambios metabólicos oportunos asociados con la defensa proporcionan claros beneficios al permitir que las plantas asignen recursos valiosos a otras inversiones fisiológicas (19, 24) y eviten la necesidad de simbiosis. Daños colaterales (25). Además, estas reorganizaciones de metabolitos especializados causadas por insectos herbívoros pueden conducir a una distribución destructiva en la población (26) y pueden reflejar lecturas directas de cambios naturales sustanciales en la señal de ácido jasmónico (AJ), que puede mantenerse en la población. Las señales altas y bajas de AJ son compensaciones entre la defensa contra herbívoros y la competencia con especies específicas (27). Además, las vías biosintéticas de metabolitos especializados sufrirán una rápida pérdida y transformación durante la evolución, lo que resultará en una distribución metabólica irregular entre especies estrechamente relacionadas (28). Estos polimorfismos pueden establecerse rápidamente en respuesta a patrones cambiantes de herbívoros (29), lo que significa que la fluctuación de las comunidades herbívoras es un factor clave que impulsa la heterogeneidad metabólica.
Aquí, resolvimos específicamente los siguientes problemas. (I) ¿Cómo reconfigura el insecto herbívoro el metaboloma de la planta? (Ii) ¿Cuáles son los principales componentes de información de la plasticidad metabólica que pueden cuantificarse para probar las predicciones de la teoría de defensa a largo plazo? (Iii) Si se debe reprogramar el metaboloma de la planta de una manera única para el atacante, de ser así, ¿qué papel juega la hormona vegetal en la adaptación de una respuesta metabólica específica y qué metabolitos contribuyen a la especificidad de la especie de la defensa? (Iv) Dado que las predicciones hechas por muchas teorías de defensa pueden extenderse a todos los niveles de tejidos biológicos, nos preguntamos cuán consistente es la respuesta metabólica causada por la comparación interna a la comparación interespecies. Con este fin, hemos estudiado sistemáticamente el metaboloma de la hoja de nicotina de tabaco, que es una planta modelo ecológica con un metabolismo especializado rico y es eficaz contra las larvas de dos herbívoros nativos, Lepidoptera Datura (Ms) (Muy agresivo, principalmente comido) En Solanaceae y Spodoptera littoralis (Sl), los gusanos de la hoja de algodón son una especie de "género", con las plantas hospedantes de Solanaceae y otros hospedantes de otros géneros y familias Alimento vegetal. Analizamos el espectro metabolómico MS/MS y extrajimos descriptores estadísticos de la teoría de la información para comparar las teorías de OD y MT. Cree mapas de especificidad para revelar la identidad de los metabolitos clave. El análisis se extendió a la población nativa de N. nasi y especies de tabaco estrechamente relacionadas para analizar más a fondo la covarianza entre la señalización de la hormona vegetal y la inducción de OD.
Para capturar un mapa general sobre la plasticidad y la estructura del metaboloma de la hoja de tabaco herbívoro, utilizamos un flujo de trabajo de análisis y cálculo desarrollado previamente para recopilar y deconvolucionar exhaustivamente los espectros MS/MS independientes de datos de alta resolución de extractos de plantas (9). Este método indiferenciado (llamado MS/MS) puede construir espectros de compuestos no redundantes, que luego pueden usarse para todos los análisis a nivel de compuesto descritos aquí. Estos metabolitos vegetales deconvolucionados son de varios tipos, y consisten en cientos a miles de metabolitos (aquí alrededor de 500-1000-s/MS/MS). Aquí, consideramos la plasticidad metabólica en el marco de la teoría de la información y cuantificamos la diversidad y la profesionalidad del metaboloma con base en la entropía de Shannon de la distribución de frecuencia metabólica. Utilizando la fórmula implementada previamente (8), calculamos un conjunto de indicadores que pueden usarse para cuantificar la diversidad del metaboloma (indicador Hj), la especialización del perfil metabólico (indicador δj) y la especificidad metabólica de un solo metabolito (indicador Si). Además, aplicamos el Índice de Plasticidad de Distancia Relativa (RDPI) para cuantificar la inducibilidad del metaboloma de los herbívoros (Figura 1A) (30). Dentro de este marco estadístico, tratamos el espectro MS/MS como la unidad básica de información y procesamos la abundancia relativa de MS/MS en un mapa de distribución de frecuencia, y luego usamos la entropía de Shannon para estimar la diversidad del metaboloma a partir de él. La especialización del metaboloma se mide por la especificidad promedio de un solo espectro MS/MS. Por lo tanto, el aumento en la abundancia de algunas clases MS/MS después de la inducción de herbívoros se transforma en inducibilidad espectral, RDPI y especialización, es decir, el aumento en el índice δj, porque se producen metabolitos más especializados y se produce un alto índice de Si. La disminución del índice de diversidad Hj refleja que el número de MS/MS generados se reduce, o la distribución de frecuencia del perfil cambia en una dirección menos uniforme, al tiempo que reduce su incertidumbre general. A través del cálculo del índice Si, es posible resaltar qué MS/MS son inducidos por ciertos herbívoros, por el contrario, qué MS/MS no responde a la inducción, lo que es un indicador clave para distinguir la predicción de MT y OD.
(A) Descriptores estadísticos utilizados para la inducibilidad de datos MS/MS (RDPI) de herbívoros (H1 a Hx), diversidad (índice Hj), especialización (índice δj) y especificidad de metabolitos (índice Si). Un aumento en el grado de especialización (δj) indica que, en promedio, se producirán más metabolitos específicos de herbívoros, mientras que una disminución en la diversidad (Hj) indica una disminución en la producción de metabolitos o una distribución desigual de metabolitos en el mapa de distribución. El valor Si evalúa si el metabolito es específico de una condición dada (aquí, herbívoro) o, por el contrario, se mantiene en el mismo nivel. (B) Diagrama conceptual de la predicción de la teoría de la defensa utilizando el eje de la teoría de la información. La teoría OD predice que el ataque de herbívoros aumentará los metabolitos de defensa, aumentando así δj. Al mismo tiempo, Hj disminuye porque el perfil se reorganiza hacia la incertidumbre reducida de la información metabólica. La teoría MT predice que el ataque de herbívoros provocará cambios no direccionales en el metaboloma, aumentando así Hj como indicador de una mayor incertidumbre en la información metabólica y causando una distribución aleatoria de Si. También propusimos un modelo mixto, el mejor MT, en el que algunos metabolitos con valores defensivos más altos se verán particularmente incrementados (valor alto de Si), mientras que otros exhibirán respuestas aleatorias (valor bajo de Si).
Utilizando descriptores de la teoría de la información, interpretamos la teoría OD para predecir que los cambios en metabolitos especiales inducidos por herbívoros en un estado constitutivo no inducido conducirán a (i) un aumento en la especificidad metabólica (índice Si) que impulsa la especificidad metabonómica (índice δj) El aumento de) ciertos grupos de metabolitos especiales con mayor valor de defensa, y (ii) la disminución de la diversidad del metaboloma (índice Hj) debido al cambio de la distribución de frecuencia metabólica a una mayor distribución corporal de leptina. A nivel de un solo metabolito, se espera una distribución ordenada de Si, donde el metabolito aumentará el valor de Si de acuerdo con su valor de defensa (Figura 1B). En esta línea, explicamos la teoría MT para predecir que la excitación conducirá a (i) cambios no direccionales en los metabolitos que resultan en una disminución del índice δj, y (ii) un aumento en el índice Hj debido a un aumento en la incertidumbre metabólica. O aleatoriedad, que puede cuantificarse mediante la entropía de Shannon en forma de diversidad generalizada. En cuanto a la composición metabólica, la teoría MT predecirá la distribución aleatoria de Si. Teniendo en cuenta que ciertos metabolitos se encuentran en condiciones específicas en condiciones específicas, y otras condiciones no están en condiciones específicas, y su valor de defensa depende del entorno, también propusimos un modelo de defensa mixto, en el que δj y Hj se distribuyen en dos a lo largo del aumento de Si en todas las direcciones, solo ciertos grupos de metabolitos, que tienen valores de defensa más altos, aumentarán particularmente Si, mientras que otros tendrán una distribución aleatoria (Figura 1B).
Para probar la predicción de la teoría de defensa redefinida en el eje del descriptor de la teoría de la información, criamos larvas de herbívoros expertos (Ms) o generalistas (Sl) en las hojas de Nepenthes pallens (Figura 2A). Mediante análisis MS/MS, recuperamos 599 espectros MS/MS no redundantes (archivo de datos S1) de extractos de metanol de tejido foliar recolectados después de la alimentación de la oruga. El uso de los índices RDPI, Hj y δj para visualizar la reconfiguración del contenido de información en los archivos de configuración MS/MS revela patrones interesantes (Figura 2B). La tendencia general es que, como lo describe el descriptor de información, a medida que las orugas continúan comiendo hojas, el grado de reorganización metabólica aumenta con el tiempo: 72 horas después de que el herbívoro come, el RDPI aumenta significativamente. En comparación con el control intacto, Hj se redujo significativamente, lo que se debió al mayor grado de especialización del perfil metabólico, que se cuantificó mediante el índice δj. Esta aparente tendencia es consistente con las predicciones de la teoría OD, pero es inconsistente con las predicciones principales de la teoría MT, que cree que los cambios aleatorios (no direccionales) en los niveles de metabolitos se utilizan como camuflaje defensivo (Figura 1B). Si bien el contenido del inductor de secreción oral (OS) y el comportamiento alimentario de estos dos herbívoros son diferentes, su alimentación directa resultó en cambios similares en las direcciones de Hj y δj durante los períodos de cosecha de 24 y 72 horas. La única diferencia ocurrió a las 72 horas de RDPI. En comparación con el causado por la alimentación con Ms, el metabolismo general inducido por la alimentación con Sl fue mayor.
(A) Diseño experimental: los herbívoros de cerdo común (S1) o expertos (Ms) se alimentan con hojas desalinizadas de plantas carnívoras, mientras que para la herbivoría simulada, el OS de Ms (W + OSMs) se utiliza para manejar la punción de la herida en posiciones foliares estandarizadas. S1 (W + OSSl) larvas o agua (W + W). El control (C) es una hoja sin daños. (B) Inducibilidad (RDPI comparada con la carta de control), diversidad (índice Hj) y especialización (índice δj) índice calculado para el mapa especial de metabolitos (599 MS/MS; archivo de datos S1). Los asteriscos indican diferencias significativas entre la alimentación directa de herbívoros y el grupo control (prueba t de Student con prueba t pareada, *P<0,05 y ***P<0,001). ns, no importante. (C) Índice de resolución temporal del espectro de metabolitos principales (recuadro azul, aminoácidos, ácidos orgánicos y azúcares; archivo de datos S2) y especiales (recuadro rojo 443 MS/MS; archivo de datos S1) tras el tratamiento de herbivoría simulada. La banda de color se refiere al intervalo de confianza del 95 %. El asterisco indica la diferencia significativa entre el tratamiento y el control [análisis de varianza cuadrático (ANOVA), seguido de la diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey para comparaciones múltiples post hoc, *P < 0,05, **P < 0,01 y *** P < 0,001]. (D) Especialización de los diagramas de dispersión y los perfiles de metabolitos especiales (muestras repetidas con diferentes tratamientos).
Para explorar si la remodelación inducida por herbívoros a nivel del metaboloma se refleja en los cambios en el nivel de metabolitos individuales, primero nos centramos en los metabolitos previamente estudiados en las hojas de Nepenthes pallens con probada resistencia a herbívoros. Las amidas fenólicas son conjugados de hidroxicinamamida-poliamina que se acumulan durante el proceso de herbivoría de los insectos y se sabe que reducen el rendimiento de los insectos (32). Buscamos los precursores del MS/MS correspondiente y trazamos sus curvas cinéticas acumulativas (Figura S1). Como era de esperar, los derivados de fenol que no están directamente involucrados en la defensa contra herbívoros, como el ácido clorogénico (CGA) y la rutina, se regulan a la baja después de la herbivoría. Por el contrario, los herbívoros pueden hacer que las amidas de fenol sean muy potentes. La alimentación continua de los dos herbívoros resultó en casi el mismo espectro de excitación de fenolamidas, y este patrón fue especialmente obvio para la síntesis de novo de fenolamidas. El mismo fenómeno se observará al explorar la vía de los glicósidos diterpénicos 17-hidroxigeranil nonanediol (17-HGL-DTG), que produce una gran cantidad de diterpenos acíclicos con funciones antiherbívoras efectivas (33), de los cuales la alimentación con Sl desencadenó un perfil de expresión similar (Figura S1)).
La posible desventaja de los experimentos de alimentación directa de herbívoros es la diferencia en la tasa de consumo de hojas y el tiempo de alimentación de los herbívoros, lo que dificulta la eliminación de los efectos específicos de los herbívoros causados ​​por las heridas y los herbívoros. Para resolver mejor la especificidad de la especie herbívora de la respuesta metabólica foliar inducida, simulamos la alimentación de larvas Ms y Sl aplicando inmediatamente el OS recién recolectado (OSM y OSS1) a la punción estándar W de posiciones foliares consistentes. Este procedimiento se llama tratamiento W + OS y estandariza la inducción al cronometrar con precisión el inicio de la respuesta provocada por el herbívoro sin causar efectos de confusión de las diferencias en la tasa o cantidad de pérdida de tejido (Figura 2A) (34). Utilizando la tubería de análisis y cálculo MS/MS, recuperamos 443 espectros MS/MS (archivo de datos S1), que se superpusieron con los espectros previamente ensamblados de los experimentos de alimentación directa. El análisis de la teoría de la información de este conjunto de datos MS/MS mostró que la reprogramación de metabolomas especializados en hojas mediante la simulación de herbívoros mostró inducciones específicas de OS (Figura 2C). En particular, en comparación con el tratamiento con OSS1, OSM causó una mejora de la especialización del metaboloma a las 4 horas. Vale la pena señalar que, en comparación con el conjunto de datos experimentales de alimentación directa de herbívoros, la cinética metabólica visualizada en un espacio bidimensional utilizando Hj y δj como coordenadas y la direccionalidad de la especialización del metaboloma en respuesta al tratamiento de herbívoros simulados a lo largo del tiempo aumentan de forma consistente (Figura 2D). Al mismo tiempo, cuantificamos el contenido de aminoácidos, ácidos orgánicos y azúcares (archivo de datos S2) para investigar si este aumento dirigido en la experiencia del metaboloma se debe a la reconfiguración del metabolismo central del carbono en respuesta a herbívoros simulados (Figura S2). Para explicar mejor este patrón, monitoreamos más a fondo la cinética de acumulación metabólica de las vías de fenolamida y 17-HGL-DTG discutidas previamente. La inducción específica de herbívoros por OS se transforma en un patrón de reordenamiento diferencial dentro del metabolismo de la fenolamida (Figura S3). Las amidas fenólicas que contienen grupos cumarina y cafeoílo son inducidas preferentemente por OSS1, mientras que las OSM desencadenan una inducción específica de conjugados ferulilo. En la vía 17-HGL-DTG, se detectó una inducción diferencial de OS mediante productos de malonilación y dimalonilación posteriores (Figura S3).
A continuación, estudiamos la plasticidad del transcriptoma inducida por OS utilizando el conjunto de datos de microarrays de curso temporal, que simula el uso de OSM para tratar las hojas de las hojas de la planta roseta en herbívoros. La cinética de muestreo se superpone básicamente con la cinética utilizada en este estudio metabolómico (35). En comparación con la reconfiguración del metaboloma en la que la plasticidad metabólica aumenta particularmente con el tiempo, observamos ráfagas transitorias de transcripción en hojas inducidas por Ms, donde la inducibilidad del transcriptoma (RDPI) y la especialización (δj) están en 1 Hubo un aumento significativo en horas y diversidad (Hj) en este punto temporal, la expresión de BMP1 se redujo significativamente, seguida de la relajación de la especialización del transcriptoma (Figura S4). Las familias de genes metabólicos (como P450, glicosiltransferasa y BAHD aciltransferasa) participan en el proceso de ensamblaje de metabolitos especiales a partir de unidades estructurales derivadas del metabolismo primario, siguiendo el modelo de alta especialización temprana mencionado anteriormente. Como caso de estudio, se analizó la vía de la fenilalanina. El análisis confirmó que los genes centrales en el metabolismo de la fenolamida son altamente inducidos por OS en herbívoros en comparación con plantas no atraídas, y están estrechamente alineados en sus patrones de expresión. El factor de transcripción MYB8 y los genes estructurales PAL1, PAL2, C4H y 4CL en la parte ascendente de esta vía mostraron un inicio temprano de la transcripción. Las aciltransferasas que desempeñan un papel en el ensamblaje final de la fenolamida, como AT1, DH29 y CV86, exhiben un patrón prolongado de regulación positiva (Figura S4). Las observaciones anteriores indican que el inicio temprano de la especialización del transcriptoma y la mejora posterior de la especialización metabolómica son un modo acoplado, que puede deberse al sistema regulador sincrónico que inicia una potente respuesta de defensa.
La reconfiguración en la señalización de las hormonas vegetales actúa como una capa reguladora que integra la información herbívora para reprogramar la fisiología de las plantas. Después de la simulación herbívora, medimos la dinámica acumulativa de las categorías clave de hormonas vegetales y visualizamos la coexpresión temporal entre ellas [coeficiente de correlación de Pearson (PCC) > 0,4] (Figura 3A). Como se esperaba, las hormonas vegetales relacionadas con la biosíntesis están vinculadas dentro de la red de coexpresión de hormonas vegetales. Además, la especificidad metabólica (índice de Si) se asigna a esta red para resaltar las hormonas vegetales inducidas por diferentes tratamientos. Se dibujan dos áreas principales de respuesta específica herbívora: una está en el grupo JA, donde JA (su forma biológicamente activa JA-Ile) y otros derivados de JA muestran la puntuación de Si más alta; la otra es el etileno (ET). La giberelina mostró solo un aumento moderado en la especificidad herbívora, mientras que otras hormonas vegetales, como la citoquinina, la auxina y el ácido abscísico, tuvieron baja especificidad de inducción para los herbívoros. En comparación con el uso exclusivo de W + W, la amplificación del valor pico de los derivados de JA mediante la aplicación de SO (W + SO) puede transformarse básicamente en un potente indicador específico de JA. Sorprendentemente, se sabe que OSM y OSS1, con diferente contenido de elicitor, causan una acumulación similar de JA y JA-Ile. A diferencia de OSS1, OSM es inducida específica y fuertemente por OSM, mientras que OSS1 no amplifica la respuesta de las heridas basales (Figura 3B).
(A) Análisis de red de coexpresión basado en cálculo PCC de simulación cinética de acumulación de hormonas vegetales inducidas por herbívoros. El nodo representa una sola hormona vegetal, y el tamaño del nodo representa el índice Si específico de la hormona vegetal entre tratamientos. (B) Acumulación de JA, JA-Ile y ET en hojas causada por diferentes tratamientos indicados por diferentes colores: albaricoque, W + OSM; azul, W + OSSl; negro, W + W; gris, C (control). Los asteriscos indican diferencias significativas entre el tratamiento y el control (ANOVA de dos vías seguido de comparación múltiple post hoc Tukey HSD, *** P <0,001). Análisis de teoría de la información de (C)697 MS/MS (archivo de datos S1) en biosíntesis de JA y espectro de percepción deteriorado (irAOC e irCOI1) y (D)585 MS/MS (archivo de datos S1) en ETR1 con señal de ET deteriorada Dos tratamientos simulados con herbívoros activaron líneas de plantas y plantas de control con vehículo vacío (EV). Los asteriscos indican diferencias significativas entre el tratamiento W+OS y el control sin daños (ANOVA de dos vías seguido de comparación múltiple post hoc Tukey HSD, *P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001). (E) Gráficos dispersos de oposición dispersa a la especialización. Los colores representan diferentes cepas modificadas genéticamente; los símbolos representan diferentes métodos de tratamiento: triángulo, W + OSS1; rectángulo, W + OSM; círculo C.
A continuación, utilizamos una cepa genéticamente modificada de Nepenthes atenuada (irCOI1 y sETR1) en los pasos clave de la biosíntesis de JA y ET (irAOC e irACO) y la percepción (irCOI1 y sETR1) para analizar el metabolismo de estas dos hormonas vegetales en herbívoros La contribución relativa de la reprogramación. En consonancia con experimentos anteriores, confirmamos la inducción de herbívoro-OS en plantas portadoras vacías (EV) (Figura 3, C a D) y la disminución general en el índice Hj causado por OSM, mientras que el índice δj aumentó. La respuesta es más pronunciada que la respuesta desencadenada por OSS1. Un gráfico de dos líneas que utiliza Hj y δj como coordenadas muestra la desregulación específica (Figura 3E). La tendencia más obvia es que en cepas que carecen de señal de JA, la diversidad del metaboloma y los cambios de especialización causados ​​por los herbívoros se eliminan casi por completo (Figura 3C). Por el contrario, la percepción silenciosa de ET en plantas sETR1, aunque el efecto general sobre los cambios en el metabolismo herbívoro es mucho menor que el de la señalización JA, atenúa la diferencia en los índices Hj y δj entre las excitaciones OSM y OSS1 (Figura 3D y Figura S5). Esto indica que, además de la función principal de la transducción de señales JA, la transducción de señales ET también sirve como un ajuste fino de la respuesta metabólica específica de la especie de los herbívoros. En consonancia con esta función de ajuste fino, no hubo cambios en la inducibilidad general del metaboloma en plantas sETR1. Por otro lado, en comparación con las plantas sETR1, las plantas irACO indujeron amplitudes generales similares de cambios metabólicos causados ​​por herbívoros, pero mostraron puntuaciones Hj y δj significativamente diferentes entre los desafíos OSM y OSS1 (Figura S5).
Para identificar metabolitos especializados que tienen contribuciones importantes a la respuesta específica de especie de los herbívoros y afinar su producción a través de señales ET, utilizamos el método MS/MS estructural desarrollado previamente. Este método se basa en el método de bi-clustering para reinferir la familia metabólica a partir de fragmentos MS/MS [producto punto normalizado (NDP)] y puntaje de similitud basado en pérdida neutral (NL). El conjunto de datos MS/MS construido a través del análisis de líneas transgénicas ET produjo 585 MS/MS (archivo de datos S1), que se resolvió agrupándolos en siete módulos MS/MS principales (M) (Figura 4A). Algunos de estos módulos están densamente empaquetados con metabolitos especiales previamente caracterizados: por ejemplo, M1, M2, M3, M4 y M7 son ricos en varios derivados de fenol (M1), glicósidos flavonoides (M2), azúcares acilo (M3 y M4), y 17-HGL-DTG (M7). Además, se calcula la información metabólica específica (índice de Si) de un único metabolito en cada módulo, y su distribución de Si se puede ver intuitivamente. En resumen, los espectros MS/MS que exhiben alta herbivoría y especificidad de genotipo se caracterizan por altos valores de Si, y las estadísticas de curtosis indican la distribución del pelaje en la esquina derecha de la cola. Una de estas distribuciones coloidales delgadas se detectó en M1, en la que la amida de fenol mostró la fracción de Si más alta (Figura 4B). El 17-HGL-DTG inducible por herbívoros mencionado anteriormente en M7 mostró una puntuación de Si moderada, lo que indica un grado moderado de regulación diferencial entre los dos tipos de SO. Por el contrario, la mayoría de los metabolitos especializados producidos constitutivamente, como la rutina, el CGA y los azúcares acilados, se encuentran entre las puntuaciones de Si más bajas. Para explorar mejor la complejidad estructural y la distribución de Si entre metabolitos especiales, se construyó una red molecular para cada módulo (Figura 4B). Una predicción importante de la teoría OD (resumida en la Figura 1B) es que la reorganización de metabolitos especiales después de la herbivoría debería conducir a cambios unidireccionales en los metabolitos con alto valor de defensa, especialmente al aumentar su especificidad (en oposición a la distribución aleatoria). Modo) Metabolito defensivo predicho por la teoría MT. La mayoría de los derivados de fenol acumulados en M1 están funcionalmente relacionados con la disminución del rendimiento de los insectos (32). Al comparar los valores de Si en los metabolitos M1 entre las hojas inducidas y las hojas constituyentes de las plantas de control EV a las 24 horas, observamos que la especificidad metabólica de muchos metabolitos después de los insectos herbivoros tiene una tendencia creciente significativa (Figura 4C). El aumento específico en el valor de Si se detectó solo en las fenolamidas defensivas, pero no se detectó ningún aumento en el valor de Si en otros fenoles y metabolitos desconocidos que coexisten en este módulo. Este es un modelo especializado, que está relacionado con la teoría OD. Las principales predicciones de los cambios metabólicos causados ​​por los herbívoros son consistentes. Para comprobar si esta particularidad del espectro de fenamidas fue inducida por la ET específica de OS, graficamos el índice de Si del metabolito y obtuvimos un valor de expresión diferencial entre OSM y OSS1 en los genotipos EV y sETR1 (Figura 4D). En sETR1, la diferencia inducida por la fenamida entre OSM y OSS1 se redujo considerablemente. El método de biagrupamiento también se aplicó a los datos de MS/MS recopilados en cepas con niveles insuficientes de JA para inferir los principales módulos de MS/MS relacionados con la especialización metabólica regulada por JA (Figura S6).
(A) Los resultados de agrupamiento de 585 MS/MS basados ​​en fragmentos compartidos (similitud NDP) y pérdida neutral compartida (similitud NL) resultan en que el módulo (M) es consistente con la familia de compuestos conocida, o por composición de metabolitos desconocida o pobremente metabolizada. Junto a cada módulo, se muestra la distribución específica (Si) del metabolito (MS/MS). (B) Red molecular modular: Los nodos representan MS/MS y bordes, puntuaciones MS/MS NDP (rojo) y NL (azul) (punto de corte, > 0,6). El índice de especificidad del metabolito graduado (Si) coloreado según el módulo (izquierda) y mapeado a la red molecular (derecha). (C) Módulo M1 de planta EV en estado constitutivo (control) e inducido (herbívoro simulado) a las 24 horas: diagrama de red molecular (el valor Si es el tamaño del nodo, la fenolamida defensiva está resaltada en azul). (D) Diagrama de red molecular M1 de la línea espectral sETR1 con percepción alterada de EV y ET: el compuesto fenólico representado por el nodo del círculo verde y la diferencia significativa (valor P) entre los tratamientos W + OSM y W + OSS1 como tamaño del nodo. CP, N-cafeoil-tirosina; CS, N-cafeoil-espermidina; FP, éster de ácido N-ferúlico-ácido úrico; FS, N-ferulil-espermidina; CoP, N', N “-Coumarolil-tirosina; DCS, N', N”-dicafeoil-espermidina; CFS, N', N”-cafeoil, feruloil-espermidina; Lycium barbarum en wolfberry Son; Nick. O-AS, azúcar O-acilo.
Extendimos aún más el análisis de un solo genotipo atenuado de Nepenthes a poblaciones naturales, donde fuertes cambios intraespecíficos en los niveles de JA herbívoros y niveles de metabolitos específicos se han descrito previamente en poblaciones naturales (26). Utilice este conjunto de datos para cubrir 43 germoplasmas. Estos germoplasmas consisten en 123 especies de plantas de N. pallens. Estas plantas fueron tomadas de semillas recolectadas en diferentes hábitats nativos en Utah, Nevada, Arizona y California (Figura S7), calculamos la diversidad del metaboloma (aquí llamada nivel de población) β diversidad) y la especialización causada por OSM. En consonancia con estudios previos, observamos una amplia gama de cambios metabólicos a lo largo de los ejes Hj y δj, lo que indica que los germoplasmas tienen diferencias significativas en la plasticidad de sus respuestas metabólicas a los herbívoros (Figura S7). Esta organización recuerda observaciones previas sobre el rango dinámico de los cambios de JA causados ​​por herbívoros, y ha mantenido un valor muy alto en una sola población (26, 36). Al utilizar JA y JA-Ile para evaluar la correlación global entre Hj y δj, se observó una correlación positiva significativa entre JA y el índice de diversidad y especialización del metaboloma β (Figura S7). Esto sugiere que la heterogeneidad inducida por herbívoros en la inducción de JA detectada a nivel poblacional podría deberse a polimorfismos metabólicos clave causados ​​por la selección a partir de insectos herbívoros.
Estudios previos han demostrado que los tipos de tabaco difieren considerablemente en cuanto a su tipo y dependencia relativa de las defensas metabólicas inducidas y constitutivas. Se cree que estos cambios en la transducción de señales antiherbívoras y las capacidades de defensa están regulados por la presión poblacional de insectos, el ciclo de vida de la planta y los costos de producción de defensa en el nicho donde crece una especie determinada. Estudiamos la consistencia de la remodelación del metaboloma foliar inducida por herbívoros de seis especies de Nicotiana nativas de Norteamérica y Sudamérica. Estas especies están estrechamente relacionadas con Nepenthes North America, concretamente Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. attenuated grass, Nicotiana tabacum, tabaco lineal, tabaco (Nicotiana spegazzinii) y tabaco de hoja de tabaco (Nicotiana obtusifolia) (Figura 5A) (37). Seis de estas especies, incluida la especie bien caracterizada N. please, son plantas anuales del clado petunia, y obtusifolia N. son plantas perennes del clado hermano Trigonophyllae (38). Posteriormente, se realizó la inducción de W + W, W + OSM y W + OSS1 en estas siete especies para estudiar el reordenamiento metabólico a nivel de especie de la alimentación de los insectos.
(A) Un árbol filogenético bootstrap basado en máxima verosimilitud [para la síntesis nuclear de glutamina (38)] y la distribución geográfica de siete especies de Nicotiana estrechamente relacionadas (diferentes colores) (37). (B) Un diagrama de dispersión de diversidad especializada para los perfiles metabólicos de siete especies de Nicotiana (939 MS/MS; archivo de datos S1). A nivel de especie, la diversidad del metaboloma está correlacionada negativamente con el grado de especialización. El análisis de la correlación a nivel de especie entre la diversidad metabólica y la especialización y la acumulación de JA se muestra en la Figura 2. S9. Color, diferentes tipos; triángulo, W + OSS1; rectángulo, W + OSM; (C) La dinámica de JA y JA-Ile de Nicotiana se clasifica según la amplitud de excitación de OS (ANOVA de dos vías y comparación posterior a múltiples HSD de Tukey, * P < 0,05, ** P < 0,01 y * ** Para la comparación de W + OS y W + W, P < 0,001). Diagrama de caja de la diversidad (D) y la especialización (E) de cada especie tras simular la presencia de herbívoros y metil AJ (MeJA). El asterisco indica la diferencia significativa entre W + OS y W + W o lanolina más W (Lan + W) o Lan más MeJA (Lan + MeJa) y Lan control (análisis de varianza bidireccional, seguido de la comparación múltiple post hoc HSD de Tukey, *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001).
Utilizando el método de clúster dual, identificamos 9 módulos de 939 MS/MS (archivo de datos S1). La composición de MS/MS reconfigurada por diferentes tratamientos varía considerablemente entre los diferentes módulos entre especies (Figura S8). Visualizar Hj (denominado aquí γ-diversidad a nivel de especie) y δj revela que diferentes especies se agregan en grupos muy diferentes en el espacio metabólico, donde la división a nivel de especie suele ser más prominente que la excitación. Con la excepción de N. linear y N. obliquus, exhiben un amplio rango dinámico de efectos de inducción (Figura 5B). Por el contrario, especies como N. purpurea y N. obtusifolia tienen una respuesta metabólica menos obvia al tratamiento, pero el metaboloma es más diverso. La distribución específica de la especie de la respuesta metabólica inducida resultó en una correlación negativa significativa entre la especialización y la diversidad gamma (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). Los cambios inducidos por OS en los niveles de JAs se correlacionan positivamente con la especialización del metaboloma y negativamente con la diversidad gamma metabólica exhibida por cada especie (Figura 5B y Figura S9). Vale la pena señalar que las especies coloquialmente denominadas especies de "respuesta a la señal" en la Figura 5C, como los nematodos Nepenthes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes aguda y Nepenthes atenuada, causaron signos significativos a los 30 minutos. Los recientes brotes de JA y JA-Ile específicos de OS, mientras que otras bacterias llamadas "sin respuesta a la señal", como Nepenthes mills, Nepenthes polvorienta y N. obtusifolia solo muestran inducción de JA-Ile Edge sin ninguna especificidad de OS (Figura 5C). A nivel metabólico, como se mencionó anteriormente, para Nepenthes atenuada, las sustancias sensibles a la señal mostraron especificidad de OS y aumentaron significativamente δj, mientras que redujeron Hj. Este efecto de cebado específico del SO no se detectó en especies clasificadas como no reactivas a la señal (Figura 5, D y E). Los metabolitos específicos del SO se comparten con mayor frecuencia entre especies sensibles a la señal, y estos grupos de señales se agrupan con especies con respuestas de señal más débiles, mientras que las especies con respuestas de señal más débiles muestran menor interdependencia (Figura S8). Este resultado indica que la inducción de JA específica del SO y la reconfiguración específica del SO del metaboloma descendente están acopladas a nivel de especie.
A continuación, utilizamos una pasta de lanolina que contenía metil JA (MeJA) para tratar las plantas con el fin de investigar si estos modos de acoplamiento están restringidos por la disponibilidad de JA aplicado por JA exógeno, que estará en el citoplasma de las plantas. La desesterificación rápida es JA. Encontramos la misma tendencia del cambio gradual de especies sensibles a la señal a especies no sensibles a la señal causado por el suministro continuo de JA (Figura 5, D y E). En resumen, el tratamiento con MeJA reprogramó fuertemente los metabolomas de los nematodos lineales, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens y N. mikimotoi, lo que resultó en un aumento significativo en δj y una disminución en Hj. N. purpurea solo mostró un aumento en δj, pero no en Hj. N. obtusifolia, que previamente ha demostrado acumular niveles extremadamente bajos de JA, también responde mal al tratamiento con MeJA en términos de reconfiguración del metaboloma. Estos resultados indican que la producción de JA o la transducción de señales está fisiológicamente restringida en especies no sensibles a la señal. Para probar esta hipótesis, estudiamos las cuatro especies (N. pallens, N. mills, N. pink y N. microphylla) inducidas por el transcriptoma W + W, W + OSMs y W + OSS1 (39). En consonancia con el patrón de remodelación del metaboloma, las especies están bien separadas en el espacio del transcriptoma, entre las cuales N. atenuada mostró el RDPI inducido por OS más alto, mientras que N. gracilis tuvo el más bajo (Figura 6A). Sin embargo, se encontró que la diversidad del transcriptoma inducida por N. oblonga fue la más baja entre las cuatro especies, contrariamente a la diversidad metabonómica más alta de N. oblonga mostrada previamente en siete especies. Estudios previos han demostrado que un conjunto de genes relacionados con señales de defensa tempranas, incluyendo señales JA, explica la especificidad de las respuestas de defensa tempranas inducidas por elicitores relacionados con herbívoros en especies de Nicotiana (39). La comparación de las vías de señalización JA entre estas cuatro especies reveló un patrón interesante (Figura 6B). La mayoría de los genes de esta vía, como AOC, OPR3, ACX y COI1, mostraron niveles relativamente altos de inducción en estas cuatro especies. Sin embargo, un gen clave, JAR4, convierte el AJ en su forma biológicamente activa, los transcritos acumulados de JA-Ile, y su nivel de transcripción es muy bajo, especialmente en N. mills, Nepenthes pieris y N. microphylla. Además, solo la transcripción de otro gen, AOS, no se detectó en N. bifidum. Estos cambios en la expresión génica podrían ser responsables de los fenotipos extremos inducidos por la baja producción de AJ en especies señal-anérgicas y la inducción de N. gracilis.
(A) Análisis de la teoría de la información de la reprogramación de las respuestas transcripcionales tempranas de cuatro especies de tabaco estrechamente relacionadas, muestreadas 30 minutos después de la inducción de la herbivoría. El RDPI se calcula comparando las hojas inducidas por el herbívoro OS con el control de la herida. Los colores indican diferentes especies y los símbolos indican diferentes métodos de tratamiento. (B) Análisis de la expresión génica en las vías de señalización de JA entre cuatro especies. La vía simplificada de JA se muestra junto al diagrama de cajas. Los diferentes colores indican diferentes métodos de procesamiento. El asterisco indica que hay una diferencia significativa entre el tratamiento W + OS y el control W + W (para la prueba t de Student para diferencias por pares, *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001). OPDA, ácido 12-oxofitodienoico; OPC-8: ácido 0,3-oxo-2(2′(Z)-pentenil)-ciclopentano-1-octanoico.
En la última parte, estudiamos cómo la remodelación específica de insectos del metaboloma de diferentes especies de plantas puede ser resistente a los herbívoros. Investigaciones previas se centraron en el género Nicotiana. Su resistencia a Ms y larvas difiere considerablemente (40). Aquí, estudiamos la conexión entre este modelo y su plasticidad metabólica. Utilizando las cuatro especies de tabaco mencionadas, y probando la correlación entre la diversidad y la especialización del metaboloma causada por herbívoros y la resistencia de las plantas a Ms y Sl, encontramos que la resistencia, la diversidad y la especialización al generalista Sl están correlacionadas positivamente, mientras que la correlación entre la resistencia a damas expertas y la especialización es débil, y la correlación con la diversidad no es significativa (Figura S10). Con respecto a la resistencia a S1, tanto N. chinensis atenuada como N. gracilis, que previamente habían demostrado exhibir niveles de transducción de señales de JA y plasticidad del metaboloma, tuvieron respuestas muy diferentes a la inducción herbívora, y también mostraron una alta resistencia similar. Sexo.
En los últimos sesenta años, la teoría de la defensa de las plantas ha proporcionado un marco teórico, basado en el cual los investigadores han predicho un número considerable de la evolución y funciones de los metabolitos especializados de las plantas. La mayoría de estas teorías no siguen el procedimiento habitual de inferencias fuertes (41). Proponen predicciones clave (3) en el mismo nivel de análisis. Cuando la prueba de predicciones clave permite analizar teorías específicas, esto hará que el campo esté avanzando. Se apoya, pero se rechazan otras (42). En cambio, la nueva teoría realiza predicciones en diferentes niveles de análisis y agrega una nueva capa de consideraciones descriptivas (42). Sin embargo, las dos teorías propuestas a nivel funcional, MT y OD, pueden explicarse fácilmente como predicciones importantes de cambios metabólicos especializados causados ​​por herbívoros: la teoría OD cree que los cambios en el "espacio" metabólico especializado son altamente direccionales. La teoría MT cree que estos cambios serán no direccionales y se ubicarán aleatoriamente en el espacio metabólico, y tienden a tener metabolitos de alto valor de defensa. Exámenes previos de predicciones de OD y MT se han probado utilizando un conjunto estrecho de compuestos "defensivos" a priori. Estas pruebas centradas en metabolitos impiden la capacidad de analizar el alcance y la trayectoria de la reconfiguración del metaboloma durante la herbivoría, y no permiten realizar pruebas dentro de un marco estadístico consistente que requiera predicciones clave que puedan considerarse como un todo. Cuantifique los cambios en el metaboloma de la planta. Aquí, utilizamos la tecnología innovadora en metabolómica basada en MS computacional y realizamos un análisis de MS deconvolucional en la vigencia general de los descriptores de la teoría de la información para probar la distinción entre los dos propuestos a nivel de metabolómica global. La predicción clave de esta teoría. La teoría de la información se ha aplicado en muchos campos, especialmente en el contexto de la investigación sobre la biodiversidad y el flujo de nutrientes (43). Sin embargo, hasta donde sabemos, esta es la primera aplicación utilizada para describir el espacio de información metabólica de las plantas y resolver problemas ecológicos relacionados con los cambios metabólicos temporales en respuesta a señales ambientales. En particular, la capacidad de este método radica en su capacidad para comparar patrones dentro y entre especies de plantas para examinar cómo los herbívoros han evolucionado de diferentes especies a patrones macroevolutivos interespecies en diferentes niveles de evolución. Metabolismo.
El análisis de componentes principales (PCA) convierte un conjunto de datos multivariados en un espacio de reducción de dimensionalidad para que se pueda explicar la tendencia principal de los datos, por lo que generalmente se utiliza como una técnica exploratoria para analizar el conjunto de datos, como el metaboloma de deconvolución. Sin embargo, la reducción de dimensionalidad perderá parte del contenido de información en el conjunto de datos, y el PCA no puede proporcionar información cuantitativa sobre características que son particularmente relevantes para la teoría ecológica, como: ¿cómo los herbívoros reconfiguran la diversidad en campos especializados (por ejemplo, riqueza, distribución) y abundancia) metabolitos? ¿Qué metabolitos son predictores del estado inducido de un herbívoro dado? Desde la perspectiva de la especificidad, la diversidad y la inducibilidad, se descompone el contenido de información del perfil de metabolitos específicos de la hoja, y se descubre que la alimentación de los herbívoros puede activar un metabolismo específico. Inesperadamente, observamos que, como se describe en los indicadores de la teoría de la información implementados, la situación metabólica resultante tiene una gran superposición después de los ataques de los dos herbívoros (el generalista de alimentación nocturna Sl) y el experto en solanáceas Ms. Aunque su comportamiento alimentario y concentración son significativamente diferentes. Iniciador de conjugado de ácido graso-aminoácido (FAC) en OS (31). Al usar OS herbívoro para tratar heridas punzantes estandarizadas, el tratamiento simulado de herbívoros también mostró una tendencia similar. Este procedimiento estandarizado para simular la respuesta de las plantas a los ataques de herbívoros elimina los factores de confusión causados ​​por cambios en el comportamiento alimentario de los herbívoros, que conducen a diversos grados de daño en diferentes momentos (34). FAC, que se sabe que es la principal causa de OSM, reduce JAS y otras respuestas de hormonas vegetales en OSS1, mientras que OSS1 se reduce cientos de veces (31). Sin embargo, OSS1 causó niveles similares de acumulación de JA en comparación con OSM. Se ha demostrado previamente que la respuesta de JA en Nepenthes atenuada es muy sensible a OSM, donde FAC puede mantener su actividad incluso diluida 1:1000 con agua (44). Por lo tanto, en comparación con OSM, aunque el FAC en OSS1 es muy bajo, es suficiente para inducir un brote de JA suficiente. Estudios previos han demostrado que las proteínas similares a porinas (45) y los oligosacáridos (46) pueden usarse como pistas moleculares para desencadenar respuestas de defensa de las plantas en OSS1. Sin embargo, aún no está claro si estos elicitores en OSS1 son responsables de la acumulación de JA observada en el presente estudio.
Aunque hay pocos estudios que describen las huellas metabólicas diferenciales causadas por la aplicación de diferentes herbívoros o JA o SA exógenos (ácido salicílico) (47), nadie ha perturbado la perturbación específica de la especie herbívora en la red de la hierba de la planta y sus efectos en la información personal específica. Este análisis confirmó además que la conexión de la red hormonal interna con otras hormonas vegetales distintas de los JA da forma a la especificidad de la reorganización metabólica causada por los herbívoros. En particular, detectamos que la ET causada por OSM fue significativamente mayor que la causada por OSS1. Este modo es consistente con un mayor contenido de FAC en OSM, que es una condición necesaria y suficiente para desencadenar una explosión de ET (48). En el contexto de la interacción entre plantas y herbívoros, la función de señalización de la ET en la dinámica de metabolitos específicos de la planta todavía es esporádica y solo se dirige a un solo grupo de compuestos. Además, la mayoría de los estudios han utilizado la aplicación exógena de ET o sus precursores o varios inhibidores para estudiar la regulación de la ET, entre los cuales estas aplicaciones químicas exógenas producirán muchos efectos secundarios no específicos. Hasta donde sabemos, este estudio representa el primer examen sistemático a gran escala del papel de la ET en el uso de la ET para producir y percibir plantas transgénicas deterioradas para coordinar la dinámica del metaboloma de la planta. La inducción de ET específica de herbívoros puede, en última instancia, modular la respuesta del metaboloma. El más significativo es la manipulación transgénica de los genes de biosíntesis de ET (ACO) y percepción (ETR1) que reveló la acumulación de novo específica de herbívoros de fenolamidas. Previamente se ha demostrado que la ET puede ajustar la acumulación de nicotina inducida por JA al regular la putrescina N-metiltransferasa (49). Sin embargo, desde un punto de vista mecánico, no está claro cómo la ET ajusta la inducción de fenamida. Además de la función de transducción de señales de la ET, el flujo metabólico también puede desviarse a la S-adenosil-1-metionina para regular la inversión en poliaminofenolamidas. La S-adenosil-1-metionina es la ET y un intermediario común en la vía biosintética de las poliaminas. El mecanismo por el cual la señal de la ET regula el nivel de fenolamida requiere mayor estudio.
Durante mucho tiempo, debido a la gran cantidad de metabolitos especiales de estructura desconocida, la intensa atención a categorías metabólicas específicas no ha permitido evaluar con precisión los cambios temporales en la diversidad metabólica tras las interacciones biológicas. Actualmente, según el análisis de la teoría de la información, el principal resultado de la adquisición de espectros MS/MS basada en metabolitos no sesgados es que los herbívoros que comen o simulan herbívoros continúan reduciendo la diversidad metabólica general del metaboloma foliar, a la vez que aumentan su grado de especialización. Este aumento temporal de la especificidad del metaboloma causado por los herbívoros se asocia con un aumento sinérgico de la especificidad del transcriptoma. La característica que más contribuye a esta mayor especialización del metaboloma (con un mayor valor de Si) es el metabolito especial con la función herbívora previamente caracterizada. Este modelo es consistente con la predicción de la teoría de OD, pero la predicción de MT relacionada con la aleatoriedad de la reprogramación del metaboloma no es consistente. Sin embargo, estos datos también son consistentes con la predicción del modelo mixto (mejor MT; Figura 1B), ya que otros metabolitos no caracterizados con funciones de defensa desconocidas aún pueden seguir una distribución aleatoria de Si.
Un patrón notable capturado además por esta investigación es que desde el nivel de microevolución (población de planta única y tabaco) hasta una escala evolutiva más grande (especies de tabaco estrechamente relacionadas), los diferentes niveles de organización evolutiva están en la "mejor defensa". Hay diferencias significativas en las habilidades de los herbívoros. Moore et al. (20) y Kessler y Kalske (1) propusieron de forma independiente convertir los tres niveles funcionales de biodiversidad originalmente distinguidos por Whittaker (50) en los cambios temporales constitutivos e inducidos de la diversidad química; estos autores no resumieron Los procedimientos para la recopilación de datos del metaboloma a gran escala tampoco describen cómo calcular la diversidad metabólica a partir de estos datos. En este estudio, pequeños ajustes a la clasificación funcional de Whittaker considerarán la diversidad α-metabólica como la diversidad de espectros MS/MS en una planta dada, y la diversidad β-metabólica como el metabolismo intraespecífico básico de un grupo de poblaciones El espacio, y la diversidad γ-metabólica serán una extensión del análisis de especies similares.
La señal de JA es esencial para una amplia gama de respuestas metabólicas de herbívoros. Sin embargo, existe una falta de pruebas cuantitativas rigurosas de la contribución de la regulación intraespecífica de la biosíntesis de JA a la diversidad del metaboloma, y ​​si la señal de JA es un sitio general para la diversificación metabólica inducida por estrés en una escala macroevolutiva superior aún es difícil de alcanzar. Observamos que la naturaleza herbívora de Nepenthes herbívora induce la especialización del metaboloma y la variación de la especialización del metaboloma dentro de la población de especies de Nicotiana y entre especies de Nicotiana estrechamente relacionadas se correlaciona sistemáticamente de forma positiva con la señalización de JA. Además, cuando la señal de JA se altera, la especificidad metabólica inducida por un solo genotipo herbívoro se cancelará (Figura 3, C y E). Dado que los cambios en el espectro metabólico de las poblaciones de Nepenthes naturalmente atenuadas son principalmente cuantitativos, los cambios en la diversidad y especificidad metabólica β en este análisis pueden deberse en gran medida a la fuerte excitación de categorías de compuestos ricos en metabolitos. Estas clases de compuestos dominan parte del perfil del metaboloma y conducen a una correlación positiva con las señales de JA.
Debido a que los mecanismos bioquímicos de las especies de tabaco estrechamente relacionadas con ella son muy diferentes, los metabolitos se identifican específicamente en el aspecto cualitativo, por lo que es más analítico. El procesamiento de la teoría de la información del perfil metabólico capturado revela que la inducción herbívora exacerba el equilibrio entre la diversidad gamma metabólica y la especialización. La señal de JA desempeña un papel central en este equilibrio. El aumento en la especialización del metaboloma es consistente con la predicción principal de OD y se correlaciona positivamente con la señal de JA, mientras que la señal de JA se correlaciona negativamente con la diversidad gamma metabólica. Estos modelos indican que la capacidad de OD de las plantas está determinada principalmente por la plasticidad de JA, ya sea a escala microevolutiva o a mayor escala evolutiva. Los experimentos de aplicación de JA exógeno que evitan los defectos de la biosíntesis de JA revelan además que las especies de tabaco estrechamente relacionadas pueden distinguirse en especies sensibles a la señal y especies no sensibles a la señal, al igual que su modo de JA y la plasticidad del metaboloma inducida por los herbívoros. Las especies que no responden a señales no pueden responder debido a su incapacidad para producir AJ endógeno y, por lo tanto, están sujetas a limitaciones fisiológicas. Esto podría deberse a mutaciones en algunos genes clave de la vía de señalización de AJ (AOS y JAR4 en N. crescens). Este resultado destaca que estos patrones macroevolutivos interespecies podrían estar impulsados ​​principalmente por cambios en la percepción y la capacidad de respuesta hormonal interna.
Además de la interacción entre plantas y herbívoros, la exploración de la diversidad metabólica está relacionada con todos los avances teóricos importantes en la investigación de la adaptación biológica al medio ambiente y la evolución de rasgos fenotípicos complejos. Con el aumento de la cantidad de datos adquiridos por los instrumentos modernos de MS, la prueba de hipótesis sobre la diversidad metabólica ahora puede trascender las diferencias de metabolitos individuales/categorías y realizar análisis globales para revelar patrones inesperados. En el proceso de análisis a gran escala, una metáfora importante es la idea de concebir mapas significativos que puedan usarse para explorar datos. Por lo tanto, un resultado importante de la combinación actual de metabolómica MS/MS imparcial y teoría de la información es que proporciona una métrica simple que puede usarse para construir mapas para explorar la diversidad metabólica en diferentes escalas taxonómicas. Es el requisito básico de este método. El estudio de la micro/macro evolución y la ecología de comunidades.
A nivel macroevolutivo, el núcleo de la teoría de coevolución planta-insecto de Ehrlich y Raven (51) es predecir que la variación de la diversidad metabólica interespecie es la causa de la diversificación de los linajes de plantas. Sin embargo, en los cincuenta años desde la publicación de este trabajo seminal, esta hipótesis ha sido raramente probada (52). Esto se debe en gran parte a las características filogenéticas de las características metabólicas comparables en linajes de plantas de larga distancia. La rareza se puede utilizar para anclar los métodos de análisis de objetivos. El flujo de trabajo actual de MS/MS procesado por la teoría de la información cuantifica la similitud estructural de MS/MS de metabolitos desconocidos (sin selección previa de metabolitos) y convierte estos MS/MS en un conjunto de MS/MS, por lo tanto en el metabolismo profesional Estos modelos macroevolutivos se comparan en la escala de clasificación. Indicadores estadísticos simples. El proceso es similar al análisis filogenético, que puede utilizar la alineación de secuencias para cuantificar la tasa de diversificación o la evolución de caracteres sin predicción previa.
A nivel bioquímico, la hipótesis de cribado de Firn y Jones (53) muestra que la diversidad metabólica se mantiene a diferentes niveles para proporcionar materias primas que permitan ejercer las actividades biológicas de metabolitos previamente no relacionados o sustituidos. Los métodos de la teoría de la información proporcionan un marco en el que estas transiciones evolutivas específicas de metabolitos que ocurren durante la especialización de metabolitos pueden cuantificarse como parte del proceso de cribado evolutivo propuesto: adaptación biológicamente activa de metabolitos inhibidos de baja especificidad a alta especificidad de un entorno dado.
En resumen, en los inicios de la biología molecular, se desarrollaron importantes teorías de defensa de las plantas, y los métodos deductivos basados ​​en hipótesis se consideran ampliamente el único medio para el progreso científico. Esto se debe en gran medida a las limitaciones técnicas de la medición del metaboloma completo. Si bien los métodos basados ​​en hipótesis son particularmente útiles para identificar otros mecanismos causales, su capacidad para avanzar en nuestra comprensión de las redes bioquímicas es más limitada que la de los métodos computacionales actualmente disponibles en la ciencia contemporánea, basada en datos intensivos. Por lo tanto, las teorías que no se pueden predecir están muy fuera del alcance de los datos disponibles, por lo que el ciclo hipotético de fórmulas/pruebas para el progreso en el campo de la investigación no puede abolirse (4). Prevemos que el flujo de trabajo computacional de la metabolómica que se presenta aquí puede reavivar el interés en los problemas recientes (cómo) y finales (por qué) de la diversidad metabólica, y contribuir a una nueva era de la ciencia de datos guiada teóricamente. Esta era reexaminó las importantes teorías que inspiraron a generaciones anteriores.
La alimentación herbívora directa se realiza mediante la cría de una larva de segundo estadio o larva Sl en una sola hoja de una rosal, con 10 réplicas por planta. Las larvas del insecto se sujetaron con pinzas y el tejido foliar restante se recolectó 24 y 72 horas después de la infección, se congeló rápidamente y se extrajeron los metabolitos.
Simular un tratamiento herbívoro de forma altamente sincronizada. El método consiste en usar ruedas de tela para perforar tres filas de espinas a cada lado del nervio central de las tres hojas completamente expandidas de la planta durante la etapa de crecimiento de la guirnalda de tela, y aplicar inmediatamente Ms diluido 1:5. O bien, usar guantes para insertar S1 OS en la herida de la punción. Cosechar y procesar una hoja como se describió anteriormente. Utilizar el método descrito previamente para extraer metabolitos primarios y fitohormonas (54).
Para aplicaciones exógenas de JA, las tres hojas del peciolo de cada una de las seis plantas de rosal en flor de cada especie se tratan con 20 μl de pasta de lanolina con 150 μg de MeJA (Lan + MeJA) y 20 μl de lanolina con tratamiento para heridas (Lan + W), o se utilizan 20 μl de lanolina pura como control. Las hojas se cosecharon 72 horas después del tratamiento, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.
En nuestro grupo de investigación se han identificado cuatro líneas transgénicas de JA y ET: irAOC (36), irCOI1 (55), irACO y sETR1 (48). irAOC mostró una marcada disminución en los niveles de JA y JA-Ile, mientras que irCOI1 no fue sensible a los JA. En comparación con EV, la acumulación de JA-Ile aumentó. De igual manera, irACO reduce la producción de ET, y en comparación con EV, sETR1, insensible a ET, la aumenta.
Se utiliza un espectrómetro láser fotoacústico (sensor de ET en tiempo real Sensor Sense ETD-300) para realizar la medición de ET de forma no invasiva. Inmediatamente después del tratamiento, se cortó la mitad de las hojas y se transfirió a un vial de vidrio sellado de 4 ml, dejando que el espacio de cabeza se acumulara en un plazo de 5 horas. Durante la medición, cada vial se lavó con una corriente de 2 litros/hora de aire puro durante 8 minutos, que previamente había pasado por un catalizador proporcionado por Sensor Sense para eliminar el CO₂ y el agua.
Los datos del microarray se publicaron originalmente en (35) y se almacenaron en la Base de Datos Integral de Expresión Génica del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (número de acceso GSE30287). Para este estudio, se extrajeron los datos correspondientes a las hojas afectadas por el tratamiento con W + OSM y al control sin daños. La intensidad bruta es log². Antes del análisis estadístico, la línea base se convirtió y se normalizó a su percentil 75 mediante el programa R.
Los datos originales de secuenciación de ARN (RNA-seq) de las especies de Nicotiana se recuperaron de los Archivos de Lecturas Cortas (SRA) del NCBI, el número de proyecto es PRJNA301787, que fue informado por Zhou et al. (39) y procede como se describe en (56). Los datos sin procesar procesados ​​por W + W, W + OSM y W + OSS1 correspondientes a las especies de Nicotiana se seleccionaron para el análisis en este estudio y se procesaron de la siguiente manera: Primero, las lecturas sin procesar de RNA-seq se convirtieron al formato FASTQ. HISAT2 convierte FASTQ a SAM y SAMtools convierte los archivos SAM en archivos BAM ordenados. StringTie se utiliza para calcular la expresión génica y su método de expresión es que hay fragmentos por mil fragmentos de base por millón de fragmentos de transcripción secuenciados.
La columna cromatográfica Acclaim (150 mm x 2,1 mm; tamaño de partícula: 2,2 μm) utilizada en el análisis y la precolumna de 4 mm x 4 mm están hechas del mismo material. El sistema de cromatografía líquida de ultraalta resolución (UHPLC) Dionex UltiMate 3000 utiliza el siguiente gradiente binario: de 0 a 0,5 minutos, isocrático: 90 % A [agua desionizada, 0,1 % (v/v) de acetonitrilo y 0,05 % de ácido fórmico], 10 % B (acetonitrilo y 0,05 % de ácido fórmico); de 0,5 a 23,5 minutos, la fase de gradiente es 10 % A y 90 % B, respectivamente; de ​​23,5 a 25 minutos, isocrático: 10 % A y 90 % B. El caudal es de 400 μl/min. Para todos los análisis de MS, inyecte el eluyente de la columna en un analizador cuadrupolo y de tiempo de vuelo (qTOF) equipado con una fuente de electrospray que funciona en modo de ionización positiva (voltaje capilar, 4500 V; salida capilar 130 V; temperatura de secado 200 °C; flujo de aire de secado 10 litros/min).
Realice un análisis de fragmentos MS/MS (en adelante, MS/MS) que sea irrelevante o indistinguible de los datos para obtener información estructural sobre el perfil metabólico detectable general. El concepto del método MS/MS indiscriminado se basa en el hecho de que el cuadrupolo tiene una ventana de aislamiento de masa muy grande [por lo tanto, considere todas las señales de relación masa-carga (m/z) como fragmentos]. Por esta razón, debido a que el instrumento Impact II no pudo crear una inclinación CE, se realizaron varios análisis independientes utilizando valores aumentados de energía de colisión (CE) de disociación inducida por colisión. En resumen, primero analice la muestra mediante ionización por electrospray UHPLC/qTOF-MS utilizando un modo de espectrometría de masas simple (condiciones de baja fragmentación generadas por fragmentación en la fuente), escaneando de m/z 50 a 1500 a una frecuencia de repetición de 5 Hz. Utilice nitrógeno como gas de colisión para el análisis MS/MS y realice mediciones independientes a los siguientes cuatro voltajes de disociación inducidos por colisión: 20, 30, 40 y 50 eV. Durante todo el proceso de medición, el cuadrupolo tiene la ventana de aislamiento de masa más grande, de m/z 50 a 1500. Cuando el experimento de m/z del cuerpo frontal y ancho de aislamiento se establece en 200, el rango de masa se activa automáticamente mediante el software operativo del instrumento y 0 Da. Busque fragmentos de masa como en el modo de masa única. Utilice formiato de sodio (50 ml de isopropanol, 200 μl de ácido fórmico y 1 ml de solución acuosa de NaOH 1 M) para la calibración de masa. Utilizando el algoritmo de calibración de alta precisión de Bruker, el archivo de datos se calibra después de ejecutar el espectro promedio en un período de tiempo determinado. Utilice la función de exportación del software Data Analysis v4.0 (Brook Dalton, Bremen, Alemania) para convertir los archivos de datos sin procesar al formato NetCDF. El conjunto de datos MS/MS se ha guardado en la base de datos de metabolómica abierta MetaboLights (www.ebi.ac.uk) con el número de acceso MTBLS1471.
El ensamblaje MS/MS se puede lograr mediante el análisis de correlación entre MS1 y las señales de calidad MS/MS para energías de colisión bajas y altas, y las nuevas reglas implementadas. El script de R se utiliza para realizar el análisis de correlación de la distribución del precursor al producto, y el script de C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) para implementar las reglas.
Para reducir los errores de falsos positivos causados ​​por el ruido de fondo y la correlación falsa causada por la detección de ciertas características m/z en solo unas pocas muestras, utilizamos la función de "pico lleno" del paquete R XCMS (para corrección de ruido de fondo). Debe usarse para reemplazar la intensidad "NA" (pico no detectado). Cuando se utiliza la función de pico lleno, todavía hay muchos valores de intensidad "0" en el conjunto de datos que afectarán el cálculo de la correlación. Luego, comparamos los resultados del procesamiento de datos obtenidos cuando se utiliza la función de pico lleno y cuando no se utiliza la función de pico lleno, y calculamos el valor de ruido de fondo en función del valor estimado corregido promedio, y luego reemplazamos estos valores de intensidad 0 con el valor de fondo calculado. También solo consideramos las características cuya intensidad excedió tres veces el valor de fondo y las consideramos como "picos verdaderos". Para los cálculos de PCC, solo se consideran las señales m/z del precursor de muestra (MS1) y los conjuntos de datos de fragmentos con al menos ocho picos verdaderos.
Si la intensidad de la característica de calidad del precursor en toda la muestra se correlaciona significativamente con la intensidad reducida de la misma característica de calidad sometida a una energía de colisión baja o alta, y CAMERA no la etiqueta como pico isotópico, se puede definir con más precisión. A continuación, se realiza el análisis de correlación calculando todos los posibles pares precursor-producto en un plazo de 3 s (la ventana de tiempo de retención estimada para la retención del pico). Solo cuando el valor m/z es inferior al valor del precursor y la fragmentación MS/MS se produce en la misma ubicación de la muestra del conjunto de datos que el precursor del que se deriva, se considera un fragmento.
Con base en estas dos sencillas reglas, excluimos los fragmentos especificados con valores m/z superiores al del precursor identificado, y en función de la posición de la muestra donde aparece el precursor y del fragmento especificado. También es posible seleccionar las características de calidad generadas por numerosos fragmentos en origen generados en modo MS1 como precursores candidatos, generando así compuestos MS/MS redundantes. Para reducir esta redundancia de datos, si la similitud NDP de los espectros supera 0,6 y pertenecen al cromatograma "pcgroup" anotado por CAMERA, los fusionamos. Finalmente, fusionamos los cuatro resultados de CE asociados con el precursor y los fragmentos en el espectro compuesto deconvolucionado final, seleccionando el pico de mayor intensidad entre todos los picos candidatos con el mismo valor m/z a diferentes energías de colisión. Los pasos de procesamiento posteriores se basan en el concepto de espectro compuesto y tienen en cuenta las diferentes condiciones de CE necesarias para maximizar la probabilidad de fragmentación, ya que algunos fragmentos solo pueden detectarse bajo una energía de colisión específica.
Se utilizó el RDPI (30) para calcular la inducibilidad del perfil metabólico. La diversidad del espectro metabólico (índice Hj) se deriva de la abundancia de precursores de MS/MS mediante la entropía de Shannon de la distribución de frecuencias de MS/MS, utilizando la siguiente ecuación descrita por Martínez et al. (8): Hj = −∑i = 1mPijlog²(Pij), donde Pij corresponde a la frecuencia relativa del i-ésimo MS/MS en la j-ésima muestra (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
La especificidad metabólica (índice Si) se define como la identidad de expresión de un MS/MS dado en relación con la frecuencia entre las muestras consideradas. La especificidad MS/MS se calcula como Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi).
Utilice la siguiente fórmula para medir el índice δj específico del metaboloma de cada muestra j y el promedio de la especificidad MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
Los espectros MS/MS se alinean en pares, y la similitud se calcula con base en las dos puntuaciones. Primero, utilizando NDP estándar (también conocido como método de correlación de coseno), utilice la siguiente ecuación para puntuar la similitud de segmento entre los espectros NDP = (∑iS1 y S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 donde S1 y S2 Correspondientemente, para el espectro 1 y el espectro 2, así como WS1, i y WS2, i representa el peso basado en la intensidad de pico que la diferencia del i-ésimo pico común entre los dos espectros es menor que 0,01 Da. El peso se calcula de la siguiente manera: W = [intensidad de pico] m [calidad] n, m = 0,5, n = 2, como lo sugiere MassBank.
Se implementó un segundo método de puntuación, que consistió en analizar la NL compartida entre MS/MS. Para ello, se utilizaron conjuntamente las 52 listas de NL encontradas frecuentemente durante el proceso de fragmentación de MS, y la NL más específica (archivo de datos S1) previamente anotada para el espectro MS/MS de los metabolitos secundarios de la especie debilitada de Nepenthes (9, 26). Se creó un vector binario de 1 y 0 para cada MS/MS, correspondiente a la NL actual y la inexistente, respectivamente. Con base en la similitud de la distancia euclidiana, se calculó la puntuación de similitud de NL para cada par de vectores binarios de NL.
Para realizar la agrupación dual, utilizamos el paquete DiffCoEx de R, basado en una extensión del Análisis de Coexpresión Génica Ponderada (WGCNA). Utilizando las matrices de puntuación NDP y NL de los espectros MS/MS, utilizamos DiffCoEx para calcular la matriz de correlación comparativa. La agrupación binaria se realiza estableciendo el parámetro "cutreeDynamic" en method = "hybrid", cutHeight = 0.9999, deepSplit = T y minClusterSize = 10. El código fuente de DiffCoEx en R fue descargado del archivo adicional 1 por Tesson et al. (57); el paquete de software WGCNA de R necesario se encuentra en https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Para realizar el análisis de red molecular MS/MS, calculamos la conectividad espectral pareada en función de los tipos de similitud NDP y NL, y utilizamos el software Cytoscape para visualizar la topología de la red utilizando un diseño orgánico en la aplicación de extensión del algoritmo de diseño CyFilescape yFiles.
Utilice R versión 3.0.1 para realizar el análisis estadístico de los datos. La significancia estadística se evaluó mediante un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías, seguido de la prueba post-hoc de diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey. Para analizar la diferencia entre el tratamiento herbívoro y el control, se analizó la distribución bilateral de los dos grupos de muestras con la misma varianza mediante la prueba t de Student.
Para obtener materiales complementarios para este artículo, consulte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia Creative Commons Atribución-No Comercial, que permite su uso, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el uso final no tenga fines comerciales y se asegure la veracidad de la obra original. Referencia.
Nota: Solo te pedimos que proporciones tu dirección de correo electrónico para que la persona que recomiendes la página sepa que quieres que vea el correo y que no es spam. No recopilaremos ninguna dirección de correo electrónico.
Esta pregunta se utiliza para comprobar si usted es un visitante y evitar el envío automático de spam.
La teoría de la información proporciona una moneda universal para la comparación de metabolomas especiales y la predicción de teorías de defensa de pruebas.
La teoría de la información proporciona una moneda universal para la comparación de metabolomas especiales y la predicción de teorías de defensa de pruebas.
©2021 Asociación Estadounidense para el Avance de la Ciencia. reservados todos los derechos. AAAS es socio de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef y COUNTER. Avances científicos ISSN 2375-2548.