Diferentes teorías de defensa vegetal proporcionan una guía teórica importante para explicar los patrones del metabolismo especializado de las plantas, pero sus predicciones clave aún deben ser probadas. Aquí, utilizamos análisis de espectrometría de masas en tándem (MS/MS) imparcial para explorar sistemáticamente el metaboloma de cepas atenuadas de tabaco desde plantas individuales hasta poblaciones y especies estrechamente relacionadas, y procesamos una gran cantidad de teorías de características espectrométricas de masas basadas en espectros de compuestos en el marco de información para probar las predicciones clave de las teorías de defensa óptima (OD) y objetivo móvil (MT). El componente de información de la metabolómica vegetal es consistente con la teoría OD, pero contradice la predicción principal de la teoría MT sobre la dinámica metabolómica causada por herbívoros. Desde la escala micro a la macroevolutiva, la señal de jasmonato fue identificada como el principal determinante de OD, mientras que la señal de etileno proporcionó un ajuste fino de la respuesta específica de herbívoros anotada por la red molecular MS/MS.
Los metabolitos especiales con estructuras diversas son los principales participantes en la adaptación de las plantas al medio ambiente, especialmente en la defensa contra los enemigos (1). La asombrosa diversificación del metabolismo especial que se encuentra en las plantas ha estimulado décadas de investigación profunda sobre sus múltiples aspectos de las funciones ecológicas y ha dado lugar a una larga lista de teorías de defensa vegetal, que son el desarrollo evolutivo y ecológico de las interacciones planta-insecto. La investigación empírica proporciona una guía importante (2). Sin embargo, estas teorías de defensa vegetal no siguieron el camino normativo del razonamiento hipotético deductivo, en el que las predicciones clave estaban al mismo nivel de análisis (3) y se probaban experimentalmente para avanzar en el siguiente ciclo de desarrollo teórico (4). Las limitaciones técnicas restringen la recopilación de datos a categorías metabólicas específicas y excluyen el análisis exhaustivo de los metabolitos especializados, impidiendo así las comparaciones entre categorías que son esenciales para el desarrollo teórico (5). La falta de datos metabolómicos completos y de un estándar común para comparar el flujo de trabajo de procesamiento del espacio metabólico entre diferentes grupos de plantas obstaculiza la madurez científica del campo.
Los últimos avances en el campo de la metabolómica por espectrometría de masas en tándem (MS/MS) pueden caracterizar exhaustivamente los cambios metabólicos dentro y entre especies de un clado de sistema dado, y pueden combinarse con métodos computacionales para calcular la similitud estructural entre estas mezclas complejas. Conocimiento previo de química (5). La combinación de tecnologías avanzadas en análisis y computación proporciona un marco necesario para la prueba a largo plazo de muchas predicciones hechas por las teorías ecológicas y evolutivas de la diversidad metabólica. Shannon (6) introdujo la teoría de la información por primera vez en su artículo seminal en 1948, sentando las bases para el análisis matemático de la información, que se ha utilizado en muchos campos más allá de su aplicación original. En genómica, la teoría de la información se ha aplicado con éxito para cuantificar la información conservada de secuencias (7). En la investigación transcriptómica, la teoría de la información analiza los cambios generales en el transcriptoma (8). En investigaciones anteriores, aplicamos el marco estadístico de la teoría de la información a la metabolómica para describir la experiencia metabólica del nivel tisular en plantas (9). En este trabajo, combinamos el flujo de trabajo basado en MS/MS con el marco estadístico de la teoría de la información, caracterizado por la diversidad metabólica en la moneda común, para comparar las predicciones clave de la teoría de defensa vegetal del metaboloma inducido por herbívoros.
Los marcos teóricos de la defensa de las plantas suelen ser mutuamente inclusivos y pueden dividirse en dos categorías: aquellos que intentan explicar la distribución de metabolitos específicos de las plantas basándose en funciones de defensa, como la defensa óptima (DO) (10), el objetivo móvil (TM) (11) y la teoría de la apariencia (12), mientras que otros buscan explicaciones mecánicas de cómo los cambios en la disponibilidad de recursos afectan el crecimiento de las plantas y la acumulación de metabolitos especializados, como el carbono: hipótesis del equilibrio de nutrientes (13), hipótesis de la tasa de crecimiento (14) y la hipótesis del equilibrio de crecimiento y diferenciación (15). Los dos conjuntos de teorías están en diferentes niveles de análisis (4). Sin embargo, dos teorías que involucran funciones defensivas a nivel funcional dominan la conversación sobre las defensas constitutivas e inducibles de las plantas: la teoría DO, que supone que las plantas invierten en sus costosas defensas químicas solo cuando es necesario, por ejemplo, cuando son ingeridas. Cuando un animal de la hierba ataca, por lo tanto, de acuerdo con la posibilidad de un ataque futuro, se asigna el compuesto con una función defensiva (10); La hipótesis MT propone que no existe un eje de cambio metabólico direccional, sino que el metabolito cambia aleatoriamente, creando así la posibilidad de obstruir el “objetivo de movimiento” metabólico de los herbívoros atacantes. En otras palabras, estas dos teorías hacen predicciones opuestas sobre la remodelación metabólica que ocurre después del ataque de los herbívoros: la relación entre la acumulación unidireccional de metabolitos con función defensiva (OD) y los cambios metabólicos no dirigidos (MT) (11).
Las hipótesis OD y MT involucran no solo los cambios inducidos en el metaboloma, sino también las consecuencias ecológicas y evolutivas de la acumulación de estos metabolitos, tales como los costos y beneficios adaptativos de estos cambios metabólicos en un entorno ecológico específico (16). Aunque ambas hipótesis reconocen la función defensiva de los metabolitos especializados, que puede o no ser costosa, la predicción clave que distingue las hipótesis OD y MT radica en la direccionalidad de los cambios metabólicos inducidos. La predicción de la teoría OD ha recibido la mayor atención experimental hasta el momento. Estas pruebas incluyen el estudio de las funciones de defensa directa o indirecta de diferentes tejidos de compuestos específicos en invernaderos y condiciones naturales, así como cambios en la etapa de desarrollo de la planta (17-19). Sin embargo, hasta ahora, debido a la falta de un flujo de trabajo y un marco estadístico para el análisis global integral de la diversidad metabólica de cualquier organismo, la principal diferencia entre las dos teorías (es decir, la dirección de los cambios metabólicos) aún no se ha comprobado. Aquí, proporcionamos dicho análisis.
Una de las características más significativas de los metabolitos específicos de las plantas es su extrema diversidad estructural en todos los niveles, desde plantas individuales y poblaciones hasta especies similares (20). Muchos cambios cuantitativos en los metabolitos especializados se pueden observar a escala poblacional, mientras que las fuertes diferencias cualitativas generalmente se mantienen a nivel de especie (20). Por lo tanto, la diversidad metabólica de las plantas es el aspecto principal de la diversidad funcional, que refleja la adaptabilidad a diferentes nichos, especialmente aquellos nichos con diferentes posibilidades de invasión por insectos especiales y herbívoros comunes (21). Desde el artículo pionero de Fraenkel (22) sobre las razones de la existencia de metabolitos específicos de las plantas, las interacciones con varios insectos se han considerado presiones de selección importantes, y se cree que estas interacciones han moldeado a las plantas durante la evolución. Vía metabólica (23). Las diferencias interespecíficas en la diversidad de metabolitos especializados también pueden reflejar el equilibrio fisiológico asociado con la defensa constitutiva e inducible de las plantas contra las estrategias herbívoras, ya que las dos especies a menudo están correlacionadas negativamente entre sí (24). Aunque puede ser beneficioso mantener una buena defensa en todo momento, los cambios metabólicos oportunos asociados con la defensa brindan claros beneficios al permitir que las plantas asignen recursos valiosos a otras inversiones fisiológicas (19, 24) y eviten la necesidad de simbiosis. Daños colaterales (25). Además, estas reorganizaciones de metabolitos especializados causadas por insectos herbívoros pueden conducir a una distribución destructiva en la población (26) y pueden reflejar lecturas directas de cambios naturales sustanciales en la señal de ácido jasmónico (JA), que puede mantenerse en la población. Las señales altas y bajas de JA son compensaciones entre la defensa contra herbívoros y la competencia con especies específicas (27). Además, las vías biosintéticas de metabolitos especializados sufrirán una rápida pérdida y transformación durante la evolución, lo que resulta en una distribución metabólica irregular entre especies estrechamente relacionadas (28). Estos polimorfismos pueden establecerse rápidamente en respuesta a patrones cambiantes de herbívoros (29), lo que significa que la fluctuación de las comunidades de herbívoros es un factor clave que impulsa la heterogeneidad metabólica.
Aquí, específicamente resolvimos los siguientes problemas: (I) ¿Cómo reconfigura el insecto herbívoro el metaboloma de la planta? (II) ¿Cuáles son los principales componentes de información de la plasticidad metabólica que se pueden cuantificar para probar las predicciones de la teoría de la defensa a largo plazo? (III) Si se reprograma el metaboloma de la planta de una manera única para el atacante, ¿qué papel juega la hormona vegetal en la adaptación de una respuesta metabólica específica y qué metabolitos contribuyen a la especificidad de la defensa de la especie? (IV) Dado que las predicciones de muchas teorías de defensa se pueden extender a todos los niveles de tejidos biológicos, nos preguntamos cuán consistente es la respuesta metabólica causada entre la comparación interna y la comparación entre especies. Con este fin, hemos estudiado sistemáticamente el metaboloma de la hoja de tabaco nicotínica, que es una planta modelo ecológica con un metabolismo especializado rico, y es eficaz contra las larvas de dos herbívoros nativos, Lepidoptera Datura (Ms) (muy agresivo, principalmente comido) en Solanáceas y Spodoptera littoralis (Sl), gusanos de la hoja del algodón son una especie de “género”, con plantas hospedantes de Solanáceas y otros hospedantes de otros géneros y familias de alimentos vegetales. Analizamos el espectro metabolómico MS/MS y extrajimos descriptores estadísticos de la teoría de la información para comparar las teorías OD y MT. Creamos mapas de especificidad para revelar la identidad de metabolitos clave. El análisis se extendió a la población nativa de N. nasi y especies de tabaco estrechamente relacionadas para analizar más a fondo la covarianza entre la señalización de hormonas vegetales y la inducción OD.
Para capturar un mapa general sobre la plasticidad y estructura del metaboloma de la hoja del tabaco herbívoro, utilizamos un flujo de trabajo de análisis y cálculo desarrollado previamente para recopilar y deconvolucionar exhaustivamente datos de alta resolución espectros MS/MS independientes de extractos de plantas ( 9). Este método no diferenciado (llamado MS/MS) puede construir espectros de compuestos no redundantes, que luego pueden usarse para todos los análisis a nivel de compuesto descritos aquí. Estos metabolitos de plantas deconvolucionados son de varios tipos, que consisten en cientos a miles de metabolitos (alrededor de 500-1000-s/MS/MS aquí). Aquí, consideramos la plasticidad metabólica en el marco de la teoría de la información y cuantificamos la diversidad y profesionalismo del metaboloma basándonos en la entropía de Shannon de la distribución de frecuencia metabólica. Usando la fórmula implementada previamente (8), calculamos un conjunto de indicadores que pueden usarse para cuantificar la diversidad del metaboloma (indicador Hj), la especialización del perfil metabólico (indicador δj) y la especificidad metabólica de un solo metabolito (indicador Si) . Además, aplicamos el Índice de Plasticidad de Distancia Relativa (RDPI) para cuantificar la inducibilidad del metaboloma por herbívoros (Figura 1A) (30). Dentro de este marco estadístico, tratamos el espectro MS/MS como la unidad de información básica y procesamos la abundancia relativa de MS/MS en un mapa de distribución de frecuencia, y luego usamos la entropía de Shannon para estimar la diversidad del metaboloma a partir de él. La especialización del metaboloma se mide por la especificidad promedio de un solo espectro MS/MS. Por lo tanto, el aumento en la abundancia de algunas clases de MS/MS después de la inducción de herbívoros se transforma en inducibilidad espectral, RDPI y especialización, es decir, el aumento en el índice δj, porque se producen metabolitos más especializados y se produce un índice Si alto. La disminución del índice de diversidad Hj refleja que o bien el número de MS/MS generados se reduce, o la distribución de frecuencia del perfil cambia en una dirección menos uniforme, mientras que reduce su incertidumbre general. Mediante el cálculo del índice Si, es posible destacar qué MS/MS son inducidos por ciertos herbívoros y, por el contrario, qué MS/MS no responden a la inducción, lo cual es un indicador clave para distinguir la predicción de MT y OD.
(A) Descriptores estadísticos utilizados para la inducibilidad de datos MS/MS (RDPI), diversidad (índice Hj), especialización (índice δj) y especificidad de metabolitos (índice Si) de herbívoros (H1 a Hx). Un aumento en el grado de especialización (δj) indica que, en promedio, se producirán más metabolitos específicos de herbívoros, mientras que una disminución en la diversidad (Hj) indica una disminución en la producción de metabolitos o una distribución desigual de metabolitos en el mapa de distribución. El valor Si evalúa si el metabolito es específico de una condición dada (aquí, herbívora) o, por el contrario, se mantiene en el mismo nivel. (B) Diagrama conceptual de la predicción de la teoría de defensa utilizando el eje de la teoría de la información. La teoría OD predice que el ataque de herbívoros aumentará los metabolitos de defensa, aumentando así δj. Al mismo tiempo, Hj disminuye porque el perfil se reorganiza hacia la incertidumbre reducida de la información metabólica. La teoría MT predice que el ataque de herbívoros provocará cambios no direccionales en el metaboloma, aumentando así Hj como indicador de una mayor incertidumbre en la información metabólica y causando una distribución aleatoria de Si. También propusimos un modelo mixto, el mejor MT, en el que algunos metabolitos con valores defensivos más altos se incrementarán particularmente (valor de Si alto), mientras que otros exhibirán respuestas aleatorias (valor de Si más bajo).
Utilizando descriptores de la teoría de la información, interpretamos la teoría OD para predecir que los cambios en metabolitos especiales inducidos por herbívoros en un estado constitutivo no inducido conducirán a (i) un aumento en la especificidad metabólica (índice Si) impulsando la especificidad metabonómica (índice δj) El aumento de) ciertos grupos de metabolitos especiales con mayor valor de defensa, y (ii) la disminución de la diversidad del metaboloma (índice Hj) debido al cambio de la distribución de frecuencia metabólica hacia una distribución más de cuerpos de leptina. A nivel de un solo metabolito, se espera una distribución Si ordenada, donde el metabolito aumentará el valor Si de acuerdo con su valor de defensa (Figura 1B). En esta línea, explicamos la teoría MT para predecir que la excitación conducirá a (i) cambios no direccionales en metabolitos que resultan en una disminución en el índice δj, y (ii) un aumento en el índice Hj debido a un aumento en la incertidumbre metabólica. O aleatoriedad, que puede cuantificarse mediante la entropía de Shannon en forma de diversidad generalizada. En cuanto a la composición metabólica, la teoría MT predecirá la distribución aleatoria de Si. Teniendo en cuenta que ciertos metabolitos están bajo condiciones específicas y otros no, y que su valor de defensa depende del entorno, también propusimos un modelo de defensa mixto, en el que δj y Hj se distribuyen en dos a lo largo de Si. Aumenta en todas las direcciones, solo ciertos grupos de metabolitos, que tienen valores de defensa más altos, aumentarán particularmente Si, mientras que otros tendrán una distribución aleatoria (Figura 1B).
Para probar la predicción de la teoría de defensa redefinida en el eje del descriptor de la teoría de la información, criamos larvas herbívoras expertas (Ms) o generalistas (Sl) en hojas de Nepenthes pallens (Figura 2A). Mediante análisis MS/MS, recuperamos 599 espectros MS/MS no redundantes (archivo de datos S1) de extractos de metanol de tejido foliar recolectado después de la alimentación de las orugas. El uso de los índices RDPI, Hj y δj para visualizar la reconfiguración del contenido de información en los archivos de configuración MS/MS revela patrones interesantes (Figura 2B). La tendencia general es que, como describe el descriptor de información, a medida que las orugas continúan comiendo hojas, el grado de reorganización metabólica aumenta con el tiempo: 72 horas después de que el herbívoro come, el RDPI aumenta significativamente. En comparación con el control no dañado, Hj se redujo significativamente, lo que se debió al mayor grado de especialización del perfil metabólico, que se cuantificó mediante el índice δj. Esta tendencia aparente es consistente con las predicciones de la teoría OD, pero es inconsistente con las predicciones principales de la teoría MT, que cree que los cambios aleatorios (no direccionales) en los niveles de metabolitos se utilizan como camuflaje defensivo (Figura 1B). Aunque el contenido del elicitor de secreción oral (OS) y el comportamiento alimentario de estos dos herbívoros son diferentes, su alimentación directa resultó en cambios similares en las direcciones de Hj y δj durante los períodos de cosecha de 24 y 72 horas. La única diferencia ocurrió a las 72 horas de RDPI. Comparado con el causado por la alimentación de Ms, el metabolismo general inducido por la alimentación de Sl fue mayor.
(A) Diseño experimental: los herbívoros cerdos comunes (S1) o expertos (Ms) son alimentados con hojas desalinizadas de plantas carnívoras, mientras que para la herbivoría simulada, el OS de Ms (W + OSMs) se utiliza para manejar la punción de posiciones de hojas estandarizadas herida. S1 (W + OSSl) larvas o agua (W + W). El control (C) es una hoja sin daños. (B) Índice de inducibilidad (RDPI comparado con el gráfico de control), diversidad (índice Hj) e índice de especialización (índice δj) calculado para el mapa de metabolitos especiales (599 MS/MS; archivo de datos S1). Los asteriscos indican diferencias significativas entre la alimentación directa del herbívoro y el grupo de control (prueba t de Student con prueba t pareada, *P<0,05 y ***P<0,001). ns, no importante. (C) Índice de resolución temporal del espectro de metabolitos principales (recuadro azul, aminoácidos, ácidos orgánicos y azúcares; archivo de datos S2) y especiales (recuadro rojo 443 MS/MS; archivo de datos S1) después del tratamiento de herbivoría simulada. La banda de color se refiere al intervalo de confianza del 95%. El asterisco indica la diferencia significativa entre el tratamiento y el control [análisis de varianza cuadrático (ANOVA), seguido de la diferencia honestamente significativa de Tukey (HSD) para comparaciones múltiples post hoc, *P<0,05, **P<0,01 y *** P <0,001]. (D) Especialización de diagramas de dispersión y perfiles de metabolitos especiales (muestras repetidas con diferentes tratamientos).
Para explorar si la remodelación inducida por herbívoros a nivel del metaboloma se refleja en los cambios en el nivel de metabolitos individuales, primero nos centramos en los metabolitos previamente estudiados en las hojas de Nepenthes pallens con resistencia comprobada a los herbívoros. Las amidas fenólicas son conjugados de hidroxicinamida-poliamina que se acumulan durante el proceso de herbivoría de los insectos y se sabe que reducen el rendimiento de los insectos (32). Buscamos los precursores de los MS/MS correspondientes y trazamos sus curvas cinéticas acumulativas (Figura S1). Como era de esperar, los derivados del fenol que no están directamente involucrados en la defensa contra los herbívoros, como el ácido clorogénico (CGA) y la rutina, se regulan negativamente después de la herbivoría. Por el contrario, los herbívoros pueden hacer que las amidas fenólicas sean altamente potentes. La alimentación continua de los dos herbívoros resultó en un espectro de excitación de fenolamidas casi idéntico, y este patrón fue especialmente evidente para la síntesis de novo de fenolamidas. Se observará el mismo fenómeno al explorar la vía de los glucósidos de diterpeno 17-hidroxigeranil nonanodiol (17-HGL-DTG), que produce una gran cantidad de diterpenos acíclicos con funciones antiherbívoras efectivas (33), de los cuales Ms Feeding con Sl desencadenó un perfil de expresión similar (Figura S1)).
La posible desventaja de los experimentos de alimentación directa de herbívoros es la diferencia en la tasa de consumo de hojas y el tiempo de alimentación de los herbívoros, lo que hace que sea difícil eliminar los efectos específicos de los herbívoros causados ​​por las heridas y los herbívoros. Para resolver mejor la especificidad de la especie herbívora de la respuesta metabólica de la hoja inducida, simulamos la alimentación de larvas Ms y Sl aplicando inmediatamente el OS recién recolectado (OSM y OSS1) a la punción estándar W de posiciones de hoja consistentes. Este procedimiento se llama tratamiento W + OS, y estandariza la inducción al cronometrar con precisión el inicio de la respuesta provocada por el herbívoro sin causar efectos de confusión de diferencias en la tasa o cantidad de pérdida de tejido (Figura 2A) (34). Usando el flujo de trabajo de análisis y cálculo MS/MS, recuperamos 443 espectros MS/MS (archivo de datos S1), que se superpusieron con los espectros previamente ensamblados de experimentos de alimentación directa. El análisis de la teoría de la información de este conjunto de datos MS/MS mostró que la reprogramación de los metabolomas especializados de las hojas mediante la simulación de herbívoros mostró inducciones específicas de OS (Figura 2C). En particular, en comparación con el tratamiento OSS1, OSM causó una mejora de la especialización del metaboloma a las 4 horas. Cabe destacar que, en comparación con el conjunto de datos experimentales de alimentación directa de herbívoros, la cinética metabólica visualizada en un espacio bidimensional usando Hj y δj como coordenadas y la direccionalidad de la especialización del metaboloma en respuesta al tratamiento de herbívoros simulados a lo largo del tiempo Aumenta de forma consistente (Figura 2D). Al mismo tiempo, cuantificamos el contenido de aminoácidos, ácidos orgánicos y azúcares (archivo de datos S2) para investigar si este aumento dirigido en la experiencia del metaboloma se debe a la reconfiguración del metabolismo central del carbono en respuesta a los herbívoros simulados (Figura S2). Para explicar mejor este patrón, además monitorizamos la cinética de acumulación metabólica de las vías de fenolamida y 17-HGL-DTG previamente discutidas. La inducción específica de herbívoros por OS se transforma en un patrón de reordenamiento diferencial dentro del metabolismo de las fenolamidas (Figura S3). Las amidas fenólicas que contienen grupos cumarina y cafeoílo son inducidas preferentemente por OSS1, mientras que las OSM desencadenan una inducción específica de conjugados de ferulilo. Para la vía 17-HGL-DTG, se detectó una inducción diferencial de OS por productos de malonilación y dimalonilación posteriores (Figura S3).
A continuación, estudiamos la plasticidad del transcriptoma inducida por OS utilizando el conjunto de datos de microarrays de curso temporal, que simula el uso de OSM para tratar las hojas de las hojas de la planta roseta en herbívoros. La cinética de muestreo básicamente se superpone con la cinética utilizada en este estudio de metabolómica (35). Comparado con la reconfiguración del metaboloma en la que la plasticidad metabólica aumenta particularmente con el tiempo, observamos estallidos de transcripción transitorios en hojas inducidos por Ms, donde la inducibilidad del transcriptoma (RDPI) y la especialización (δj) están en 1 Hubo un aumento significativo en horas y diversidad (Hj) en este punto temporal, la expresión de BMP1 se redujo significativamente, seguida de la relajación de la especialización del transcriptoma (Figura S4). Las familias de genes metabólicos (como P450, glicosiltransferasa y aciltransferasa BAHD) participan en el proceso de ensamblaje de metabolitos especiales a partir de unidades estructurales derivadas del metabolismo primario, siguiendo el modelo de alta especialización temprana mencionado anteriormente. Como estudio de caso, se analizó la vía de la fenilalanina. El análisis confirmó que los genes centrales en el metabolismo de la fenolamida se inducen fuertemente por estrés oxidativo en herbívoros en comparación con plantas no atraídas, y presentan patrones de expresión estrechamente alineados. El factor de transcripción MYB8 y los genes estructurales PAL1, PAL2, C4H y 4CL, ubicados en la vía metabólica inicial, mostraron una transcripción de inicio temprano. Las aciltransferasas que participan en el ensamblaje final de la fenolamida, como AT1, DH29 y CV86, exhiben un patrón de regulación positiva prolongada (Figura S4). Estas observaciones indican que el inicio temprano de la especialización del transcriptoma y la posterior mejora de la especialización metabolómica constituyen un mecanismo acoplado, posiblemente debido al sistema regulador sincrónico que desencadena una potente respuesta de defensa.
La reconfiguración en la señalización de hormonas vegetales actúa como una capa reguladora que integra información de herbívoros para reprogramar la fisiología de las plantas. Después de la simulación de herbívoros, medimos la dinámica acumulativa de categorías clave de hormonas vegetales y visualizamos la coexpresión temporal entre ellas [coeficiente de correlación de Pearson (PCC) > 0,4] (Figura 3A). Como era de esperar, las hormonas vegetales relacionadas con la biosíntesis están vinculadas dentro de la red de coexpresión de hormonas vegetales. Además, la especificidad metabólica (índice Si) se mapea a esta red para resaltar las hormonas vegetales inducidas por diferentes tratamientos. Se trazan dos áreas principales de respuesta específica de herbívoros: una está en el clúster de JA, donde JA (su forma biológicamente activa JA-Ile) y otros derivados de JA muestran la puntuación Si más alta; la otra es el etileno (ET). La giberelina mostró solo un aumento moderado en la especificidad de herbívoros, mientras que otras hormonas vegetales, como la citoquinina, la auxina y el ácido abscísico, tuvieron una baja especificidad de inducción para herbívoros. En comparación con el uso de W + W solo, la amplificación del valor máximo de los derivados de JA mediante la aplicación de OS (W + OS) puede transformarse básicamente en un indicador específico fuerte de JA. Inesperadamente, se sabe que OSM y OSS1 con diferente contenido de elicitor causan una acumulación similar de JA y JA-Ile. A diferencia de OSS1, OSM es inducido de manera específica y fuerte por OSM, mientras que OSS1 no amplifica la respuesta de las heridas basales (Figura 3B).
(A) Análisis de red de coexpresión basado en el cálculo de PCC de la simulación de la cinética de acumulación de hormonas vegetales inducida por herbívoros. El nodo representa una sola hormona vegetal, y el tamaño del nodo representa el índice Si específico de la hormona vegetal entre tratamientos. (B) Acumulación de JA, JA-Ile y ET en hojas causada por diferentes tratamientos indicados por diferentes colores: albaricoque, W + OSM; azul, W + OSSl; negro, W + W; gris, C (control). Los asteriscos indican diferencias significativas entre el tratamiento y el control (ANOVA de dos vías seguido de la comparación múltiple post hoc HSD de Tukey, *** P <0,001). Análisis de teoría de la información de (C)697 MS/MS (archivo de datos S1) en la biosíntesis de JA y espectro de percepción alterada (irAOC e irCOI1) y (D)585 MS/MS (archivo de datos S1) en ETR1 con señal ET alterada Dos tratamientos simulados de herbívoros desencadenaron líneas de plantas y plantas de control de vehículo vacío (EV). Los asteriscos indican diferencias significativas entre el tratamiento W+OS y el control no dañado (ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple post hoc HSD de Tukey, *P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001). (E) Gráficos de dispersión de la oposición dispersa a la especialización. Los colores representan diferentes cepas genéticamente modificadas; los símbolos representan diferentes métodos de tratamiento: triángulo, W + OSS1; rectángulo, W + OSM; círculo C
A continuación, utilizamos una cepa genéticamente modificada de Nepenthes atenuada (irCOI1 y sETR1) en los pasos clave de la biosíntesis de JA y ET (irAOC e irACO) y percepción (irCOI1 y sETR1) para analizar el metabolismo de estas dos hormonas vegetales en herbívoros La contribución relativa de la reprogramación. De acuerdo con experimentos previos, confirmamos la inducción de herbívoros-OS en plantas portadoras vacías (EV) (Figura 3, C a D) y la disminución general en el índice Hj causada por OSM, mientras que el índice δj aumentó. La respuesta es más pronunciada que la respuesta desencadenada por OSS1. Un gráfico de dos líneas usando Hj y δj como coordenadas muestra la desregulación específica (Figura 3E). La tendencia más obvia es que en cepas que carecen de señal de JA, la diversidad del metaboloma y los cambios de especialización causados ​​por herbívoros se eliminan casi por completo (Figura 3C). En contraste, la percepción silenciosa de ET en plantas sETR1, aunque el efecto general sobre los cambios en el metabolismo herbívoro es mucho menor que el de la señalización de JA, atenúa la diferencia en los índices Hj y δj entre las excitaciones OSM y OSS1 (Figura 3D y Figura S5). Esto indica que, además de la función central de la transducción de señales de JA, la transducción de señales de ET también sirve como un ajuste fino de la respuesta metabólica específica de la especie de los herbívoros. De acuerdo con esta función de ajuste fino, no hubo cambios en la inducibilidad general del metaboloma en plantas sETR1. Por otro lado, en comparación con las plantas sETR1, las plantas irACO indujeron amplitudes generales similares de cambios metabólicos causados ​​por herbívoros, pero mostraron puntuaciones Hj y δj significativamente diferentes entre los desafíos OSM y OSS1 (Figura S5).
Para identificar metabolitos especializados que tienen contribuciones importantes a la respuesta específica de la especie de los herbívoros y ajustar su producción a través de señales ET, utilizamos el método estructural MS/MS desarrollado previamente. Este método se basa en el método de biclusterización para reinferir la familia metabólica a partir de fragmentos MS/MS [producto escalar normalizado (NDP)] y puntuación de similitud basada en la pérdida neutra (NL). El conjunto de datos MS/MS construido a través del análisis de líneas transgénicas ET produjo 585 MS/MS (archivo de datos S1), que se resolvió agrupándolos en siete módulos MS/MS principales (M) (Figura 4A). Algunos de estos módulos están densamente empaquetados con metabolitos especiales previamente caracterizados: por ejemplo, M1, M2, M3, M4 y M7 son ricos en varios derivados de fenol (M1), glucósidos de flavonoides (M2), azúcares acilados (M3 y M4) y 17-HGL-DTG (M7). Además, se calcula la información metabólica específica (índice Si) de un único metabolito en cada módulo, y su distribución Si puede verse intuitivamente. En resumen, los espectros MS/MS que exhiben una alta especificidad de herbivoría y genotipo se caracterizan por altos valores de Si, y las estadísticas de curtosis indican la distribución del pelaje en la esquina derecha de la cola. Una de estas distribuciones coloidales magras se detectó en M1, en la que la amida fenólica mostró la fracción Si más alta (Figura 4B). El 17-HGL-DTG inducible por herbivoría mencionado anteriormente en M7 mostró una puntuación Si moderada, lo que indica un grado moderado de regulación diferencial entre los dos tipos de OS. Por el contrario, la mayoría de los metabolitos especializados producidos constitutivamente, como la rutina, el CGA y los azúcares acilados, se encuentran entre las puntuaciones Si más bajas. Para explorar mejor la complejidad estructural y la distribución Si entre los metabolitos especiales, se construyó una red molecular para cada módulo (Figura 4B). Una predicción importante de la teoría OD (resumida en la Figura 1B) es que la reorganización de metabolitos especiales después de la herbivoría debería conducir a cambios unidireccionales en metabolitos con alto valor de defensa, especialmente al aumentar su especificidad (en contraposición a la distribución aleatoria) Modo) Metabolito defensivo predicho por la teoría MT. La mayoría de los derivados de fenol acumulados en M1 están funcionalmente relacionados con la disminución del rendimiento de los insectos (32). Al comparar los valores de Si en los metabolitos M1 entre las hojas inducidas y las hojas constituyentes de las plantas de control EV a las 24 horas, observamos que la especificidad metabólica de muchos metabolitos después de los insectos herbivores tiene una tendencia de aumento significativa (Figura 4C). El aumento específico en el valor de Si se detectó solo en las fenolamidas defensivas, pero no se detectó ningún aumento en el valor de Si en otros fenoles y metabolitos desconocidos coexistiendo en este módulo. Este es un modelo especializado, que está relacionado con la teoría OD. Las principales predicciones de los cambios metabólicos causados ​​por los herbívoros son consistentes. Para comprobar si esta particularidad del espectro de fenolamida fue inducida por ET específica de OS, representamos gráficamente el índice Si del metabolito y observamos un valor de expresión diferencial entre OSM y OSS1 en los genotipos EV y sETR1 (Figura 4D). En sETR1, la diferencia inducida por fenolamida entre OSM y OSS1 se redujo considerablemente. El método de biclusterización también se aplicó a los datos de MS/MS recopilados en cepas con JA insuficiente para inferir los principales módulos de MS/MS relacionados con la especialización metabólica regulada por JA (Figura S6).
(A) Los resultados de agrupamiento de 585 MS/MS basados ​​en el fragmento compartido (similitud NDP) y la pérdida neutra compartida (similitud NL) dan como resultado que el módulo (M) sea consistente con la familia de compuestos conocida, o por la composición de metabolitos desconocidos o poco metabolizados. Junto a cada módulo, se muestra la distribución específica (Si) del metabolito (MS/MS). (B) Red molecular modular: los nodos representan MS/MS y las aristas, puntuaciones NDP (rojo) y NL (azul) MS/MS (punto de corte, > 0,6). El índice de especificidad del metabolito graduado (Si) coloreado según el módulo (izquierda) y mapeado a la red molecular (derecha). (C) Módulo M1 de la planta EV en estado constitutivo (control) e inducido (herbívoro simulado) a las 24 horas: diagrama de red molecular (el valor Si es el tamaño del nodo, la fenolamida defensiva está resaltada en azul). (D) Diagrama de red molecular M1 de la línea espectral sETR1 con percepción EV y ET alterada: el compuesto fenólico representado por el nodo del círculo verde, y la diferencia significativa (valor P) entre los tratamientos W + OSM y W + OSS1 como tamaño del nodo. CP, N-cafeoil-tirosina; CS, N-cafeoil-espermidina; FP, éster de ácido N-ferúlico-ácido úrico; FS, N-ferulil-espermidina; CoP, N', N “-cumarolil-tirosina; DCS, N', N”-dicafeoil-espermidina; CFS, N', N”-cafeoil, feruloil-espermidina; Lycium barbarum en baya de goji Son; Nick. O-AS, azúcar O-acilo.
Ampliamos el análisis desde un único genotipo atenuado de Nepenthes a poblaciones naturales, donde previamente se han descrito fuertes cambios intraespecíficos en los niveles de JA herbívoros y niveles de metabolitos específicos en poblaciones naturales (26). Usamos este conjunto de datos para cubrir 43 germoplasmas. Estos germoplasmas consisten en 123 especies de plantas de N. pallens. Estas plantas se tomaron de semillas recolectadas en diferentes hábitats nativos en Utah, Nevada, Arizona y California (Figura S7), calculamos la diversidad del metaboloma (aquí llamada diversidad β a nivel de población) y la especialización causada por OSM. De acuerdo con estudios previos, observamos un amplio rango de cambios metabólicos a lo largo de los ejes Hj y δj, lo que indica que los germoplasmas tienen diferencias significativas en la plasticidad de sus respuestas metabólicas a los herbívoros (Figura S7). Esta organización recuerda observaciones previas sobre el rango dinámico de cambios de JA causados ​​por herbívoros, y ha mantenido un valor muy alto en una sola población (26, 36). Al utilizar JA y JA-Ile para evaluar la correlación general entre Hj y δj, observamos una correlación positiva significativa entre JA y el índice de diversidad y especialización β del metaboloma (Figura S7). Esto sugiere que la heterogeneidad en la inducción de JAs, detectada a nivel poblacional y provocada por herbívoros, podría deberse a polimorfismos metabólicos clave generados por la selección ejercida por insectos herbívoros.
Estudios previos han demostrado que los tipos de tabaco difieren enormemente en tipo y dependencia relativa de las defensas metabólicas inducidas y constitutivas. Se cree que estos cambios en la transducción de señales antiherbívoros y las capacidades de defensa están regulados por la presión de la población de insectos, el ciclo de vida de la planta y los costos de producción de defensa en el nicho donde crece una especie determinada. Estudiamos la consistencia de la remodelación del metaboloma foliar inducida por herbívoros de seis especies de Nicotiana nativas de América del Norte y América del Sur. Estas especies están estrechamente relacionadas con Nepenthes América del Norte, a saber, Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. attenuated grass, Nicotiana tabacum, linear tobacco, tobacco (Nicotiana spegazzinii) y tobacco leaf tobacco (Nicotiana obtusifolia) (Figura 5A) (37). Seis de estas especies, incluida la especie bien caracterizada N. please, son plantas anuales del clado petunia, y obtusifolia N. son perennes del clado hermano Trigonophyllae (38). Posteriormente, se realizó la inducción de W + W, W + OSM y W + OSS1 en estas siete especies para estudiar la reorganización metabólica a nivel de especie de la alimentación de los insectos.
(A) Un árbol filogenético bootstrap basado en máxima verosimilitud [para la síntesis de glutamina nuclear (38)] y la distribución geográfica de siete especies de Nicotiana estrechamente relacionadas (diferentes colores) (37). (B) Un diagrama de dispersión de la diversidad especializada para los perfiles metabólicos de siete especies de Nicotiana (939 MS/MS; archivo de datos S1). A nivel de especie, la diversidad del metaboloma está correlacionada negativamente con el grado de especialización. El análisis de la correlación a nivel de especie entre la diversidad metabólica y la especialización y la acumulación de JA se muestra en la Figura 2. S9. Color, diferentes tipos; triángulo, W + OSS1; rectángulo, W + OSM; (C) La dinámica de JA y JA-Ile de Nicotiana se clasifica según la amplitud de excitación de OS (ANOVA de dos vías y comparación múltiple posterior de Tukey HSD, * P <0,05, ** P <0,01 y * ** Para la comparación de W + OS y W + W, P <0,001). Diagrama de caja de (D) diversidad y (E) especialización de cada especie después de simular la herbivoría y el metil JA (MeJA). El asterisco indica la diferencia significativa entre W + OS y W + W o lanolina más W (Lan + W) o Lan más MeJA (Lan + MeJa) y el control Lan (análisis de varianza de dos vías, seguido de la comparación múltiple post hoc HSD de Tukey, *P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001).
Utilizando el método de clúster dual, identificamos 9 módulos de 939 MS/MS (archivo de datos S1). La composición de MS/MS reconfigurada por diferentes tratamientos varía enormemente entre los distintos módulos entre especies (Figura S8). La visualización de Hj (denominada aquí diversidad γ a nivel de especie) y δj revela que las distintas especies se agrupan en grupos muy diferentes en el espacio metabólico, donde la división a nivel de especie suele ser más prominente que la excitación. Con la excepción de N. linear y N. obliquus, exhiben un amplio rango dinámico de efectos de inducción (Figura 5B). En contraste, especies como N. purpurea y N. obtusifolia tienen una respuesta metabólica menos evidente al tratamiento, pero el metaboloma es más diverso. La distribución específica de la especie de la respuesta metabólica inducida resultó en una correlación negativa significativa entre la especialización y la diversidad gamma (PCC = -0,46, P = 4,9×10⁻⁸). Los cambios inducidos por OS en los niveles de JA están correlacionados positivamente con la especialización del metaboloma y negativamente con la diversidad gamma metabólica exhibida por cada especie (Figura 5B y Figura S9). Cabe destacar que las especies denominadas coloquialmente como especies de “respuesta a la señal” en la Figura 5C, como los nematodos Nepenthes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes agudo y Nepenthes atenuado, causaron signos significativos a los 30 minutos. Los recientes brotes de JA y JA-Ile específicos de OS, mientras que otras bacterias llamadas “no respondedoras a la señal”, como Nepenthes mills, Nepenthes powdery y N. obtusifolia, solo muestran inducción de JA-Ile Edge sin ninguna especificidad de OS (Figura 5C). A nivel metabólico, como se mencionó anteriormente, para Nepenthes atenuado, las sustancias respondedoras a la señal mostraron especificidad de OS y aumentaron significativamente δj, mientras que redujeron Hj. Este efecto de cebado específico de OS no se detectó en especies clasificadas como no reactivas a la señal (Figura 5, D y E). Los metabolitos específicos de OS se comparten con mayor frecuencia entre especies que responden a la señal, y estos grupos de señales se agrupan con especies con respuestas de señal más débiles, mientras que las especies con respuestas de señal más débiles muestran menor interdependencia (Figura S8). Este resultado indica que la inducción específica de JA por OS y la reconfiguración específica de OS del metaboloma posterior están acopladas a nivel de especie.
A continuación, utilizamos una pasta de lanolina que contenía metil JA (MeJA) para tratar plantas y así investigar si estos modos de acoplamiento están restringidos por la disponibilidad de JA aplicada por JA exógena, que estará en el citoplasma de las plantas. La desesterificación rápida es JA. Encontramos la misma tendencia del cambio gradual de especies que responden a señales a especies que no responden a señales causada por el suministro continuo de JA (Figura 5, D y E). En resumen, el tratamiento con MeJA reprogramó fuertemente los metabolomas de los nematodos lineales, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens y N. mikimotoi, lo que resultó en un aumento significativo en δj y una disminución en Hj. N. purpurea solo mostró un aumento en δj, pero no en Hj. N. obtusifolia, que previamente se ha demostrado que acumula niveles extremadamente bajos de JA, también responde mal al tratamiento con MeJA en términos de reconfiguración del metaboloma. Estos resultados indican que la producción de JA o la transducción de señales está restringida fisiológicamente en especies que no responden a señales. Para probar esta hipótesis, estudiamos las cuatro especies (N. pallens, N. mills, N. pink y N. microphylla) inducidas por W + W, W + OSMs y W + OSS1 Transcriptome (39). De acuerdo con el patrón de remodelación del metaboloma, las especies están bien separadas en el espacio del transcriptoma, entre las cuales N. attenuated mostró el RDPI inducido por OS más alto, mientras que N. gracilis tuvo el más bajo (Figura 6A). Sin embargo, se encontró que la diversidad del transcriptoma inducida por N. oblonga fue la más baja entre las cuatro especies, contrariamente a la mayor diversidad metabonómica de N. oblonga previamente mostrada en siete especies. Estudios previos han demostrado que un conjunto de genes relacionados con señales de defensa temprana, incluidas las señales de JA, explica la especificidad de las respuestas de defensa temprana inducidas por elicitores relacionados con herbívoros en especies de Nicotiana (39). Comparando las vías de señalización de JA entre estas cuatro especies reveló un patrón interesante (Figura 6B). La mayoría de los genes de esta vía, como AOC, OPR3, ACX y COI1, mostraron niveles de inducción relativamente altos en estas cuatro especies. Sin embargo, un gen clave, JAR4, convierte el JA en su forma biológicamente activa, JA-Ile, cuyos transcritos se acumulan, y su nivel de transcripción es muy bajo, especialmente en N. mills, Nepenthes pieris y N. microphylla. Además, solo el transcrito de otro gen, AOS, no se detectó en N. bifidum. Estos cambios en la expresión génica podrían ser responsables de los fenotipos extremos inducidos por la baja producción de JA en especies anérgicas de señalización y la inducción de N. gracilis.
(A) Análisis de la teoría de la información de la reprogramación de las respuestas transcripcionales tempranas de cuatro especies de tabaco estrechamente relacionadas, muestreadas 30 minutos después de la inducción por herbivoría. El RDPI se calcula comparando las hojas inducidas por el herbívoro OS con el control de heridas. Los colores indican diferentes especies y los símbolos indican diferentes métodos de tratamiento. (B) Análisis de la expresión génica en las vías de señalización de JA entre cuatro especies. La ruta de JA simplificada se muestra junto al diagrama de caja. Los diferentes colores indican diferentes métodos de procesamiento. El asterisco indica que hay una diferencia significativa entre el tratamiento W + OS y el control W + W (para la prueba t de Student para diferencias por pares, *P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001). OPDA, ácido 12-oxofitodienoico; OPC-8: ácido 0,3-oxo-2(2′(Z)-pentenil)-ciclopentano-1-octanoico.
En la última parte, estudiamos cómo la remodelación específica de especies de insectos del metaboloma de diferentes especies de plantas puede ser resistente a los herbívoros. Investigaciones previas enfatizaron el género Nicotiana. Su resistencia a Ms y larvas difiere enormemente (40). Aquí, estudiamos la conexión entre este modelo y su plasticidad metabólica. Usando las cuatro especies de tabaco mencionadas anteriormente, y probando la correlación entre la diversidad y especialización del metaboloma causada por herbívoros y la resistencia de las plantas a Ms y Sl, encontramos que la resistencia, la diversidad y la especialización al generalista Sl están correlacionadas positivamente, mientras que la correlación entre la resistencia a las damas expertas y la especialización es débil, y la correlación con la diversidad no es significativa (Figura S10). Con respecto a la resistencia a S1, tanto N. chinensis atenuada como N. gracilis, que previamente se demostró que exhiben niveles de transducción de señales de JA y plasticidad del metaboloma, tuvieron respuestas muy diferentes a la inducción de herbívoros, y también mostraron una resistencia alta similar. Sexo.
En los últimos sesenta años, la teoría de la defensa de las plantas ha proporcionado un marco teórico, basado en el cual los investigadores han predicho un número considerable de evoluciones y funciones de metabolitos especializados de las plantas. La mayoría de estas teorías no siguen el procedimiento normal de inferencias fuertes (41). Proponen predicciones clave (3) en el mismo nivel de análisis. Cuando la prueba de predicciones clave permite analizar teorías específicas, esto hará que el campo esté avanzando. Se respalde, pero se rechacen otras (42). En cambio, la nueva teoría hace predicciones en diferentes niveles de análisis y agrega una nueva capa de consideraciones descriptivas (42). Sin embargo, las dos teorías propuestas a nivel funcional, MT y OD, pueden explicarse fácilmente como predicciones importantes de cambios metabólicos especializados causados ​​por herbívoros: la teoría OD cree que los cambios en el "espacio" metabólico especializado son altamente direccionales. La teoría MT cree que estos cambios serán no direccionales y estarán ubicados aleatoriamente en el espacio metabólico, y tenderán a tener metabolitos de alto valor de defensa. Exámenes previos de las predicciones OD y MT se han probado utilizando un conjunto limitado de compuestos de "defensa" a priori. Estas pruebas centradas en metabolitos excluyen la capacidad de analizar el alcance y la trayectoria de la reconfiguración del metaboloma durante la herbivoría, y no permiten realizar pruebas dentro de un marco estadístico consistente para requerir predicciones clave que puedan considerarse como un todo Cuantificar los cambios en el metaboloma de la planta. Aquí, utilizamos la tecnología innovadora en metabolómica basada en MS computacional y realizamos análisis de MS de deconvolución en la moneda general de descriptores de la teoría de la información para probar la distinción entre los dos propuestos a nivel de metabolómica global. La predicción clave de esta teoría. La teoría de la información se ha aplicado en muchos campos, especialmente en el contexto de la investigación de la biodiversidad y el flujo de nutrientes (43). Sin embargo, hasta donde sabemos, esta es la primera aplicación utilizada para describir el espacio de información metabólica de las plantas y resolver problemas ecológicos relacionados con cambios metabólicos temporales en respuesta a señales ambientales. En particular, la capacidad de este método radica en su capacidad de comparar patrones dentro y entre especies de plantas para examinar cómo los herbívoros han evolucionado de diferentes especies a patrones macroevolutivos interespecíficos en diferentes niveles de evolución. Metabolismo.
El análisis de componentes principales (ACP) convierte un conjunto de datos multivariados en un espacio de reducción de dimensionalidad para que se pueda explicar la tendencia principal de los datos, por lo que generalmente se utiliza como una técnica exploratoria para analizar el conjunto de datos, como la deconvolución del metaboloma. Sin embargo, la reducción de dimensionalidad perderá parte del contenido de información en el conjunto de datos, y el ACP no puede proporcionar información cuantitativa sobre características que son particularmente relevantes para la teoría ecológica, tales como: ¿cómo reconfiguran los herbívoros la diversidad en campos especializados (por ejemplo, riqueza, distribución y abundancia) de metabolitos? ¿Qué metabolitos son predictores del estado inducido de un herbívoro dado? Desde la perspectiva de la especificidad, la diversidad y la inducibilidad, se descompone el contenido de información del perfil de metabolitos específicos de la hoja, y se encuentra que la alimentación de los herbívoros puede activar un metabolismo específico. Inesperadamente, observamos que, como se describe en los indicadores de la teoría de la información implementados, la situación metabólica resultante tiene una gran superposición después de los ataques de los dos herbívoros (el generalista alimentado de noche Sl) y el experto en Solanáceas Ms. Aunque su comportamiento de alimentación y concentración son significativamente diferentes. Iniciador del conjugado de ácido graso-aminoácido (FAC) en OS (31). Al usar OS de herbívoros para tratar heridas punzantes estandarizadas, el tratamiento simulado de herbívoros también mostró una tendencia similar. Este procedimiento estandarizado para simular la respuesta de las plantas a los ataques de herbívoros elimina los factores de confusión causados ​​por cambios en el comportamiento alimenticio de los herbívoros, que conducen a diferentes grados de daño en diferentes momentos (34). FAC, que se sabe que es la causa principal de OSM, reduce las respuestas de JAS y otras hormonas vegetales en OSS1, mientras que OSS1 las reduce cientos de veces (31). Sin embargo, OSS1 causó niveles similares de acumulación de JA en comparación con OSM. Se ha demostrado previamente que la respuesta de JA en Nepenthes atenuada es muy sensible a OSM, mientras que FAC puede mantener su actividad incluso si se diluye 1:1000 con agua (44). Por lo tanto, en comparación con OSM, aunque FAC en OSS1 es muy bajo, es suficiente para inducir un brote de JA suficiente. Estudios previos han demostrado que las proteínas tipo porina (45) y los oligosacáridos (46) pueden usarse como pistas moleculares para desencadenar respuestas de defensa de la planta en OSS1. Sin embargo, aún no está claro si estos elicitores en OSS1 son responsables de la acumulación de JA observada en el presente estudio.
Aunque hay pocos estudios que describan las huellas metabólicas diferenciales causadas por la aplicación de diferentes herbívoros o JA o SA (ácido salicílico) exógenos (47), nadie ha perturbado la perturbación específica de la especie herbívora en la red de plantas y pastos y sus efectos en la información personal específica. El impacto general del metabolismo se estudia sistemáticamente. Este análisis confirmó además que la conexión de la red hormonal interna con otras hormonas vegetales distintas de las JAs moldea la especificidad de la reorganización metabólica causada por los herbívoros. En particular, detectamos que la ET causada por OSM fue significativamente mayor que la causada por OSS1. Este modo es consistente con un mayor contenido de FAC en OSM, que es una condición necesaria y suficiente para desencadenar una explosión de ET (48). En el contexto de la interacción entre plantas y herbívoros, la función de señalización de la ET en la dinámica de metabolitos específicos de las plantas sigue siendo esporádica y solo apunta a un único grupo de compuestos. Además, la mayoría de los estudios han utilizado la aplicación exógena de ET o sus precursores o varios inhibidores para estudiar la regulación de ET, entre los cuales estas aplicaciones químicas exógenas producirán muchos efectos secundarios no específicos. Hasta donde sabemos, este estudio representa el primer examen sistemático a gran escala del papel de ET en el uso de ET para producir y percibir plantas transgénicas alteradas para coordinar la dinámica del metaboloma de la planta. La inducción de ET específica de herbívoros puede en última instancia modular la respuesta del metaboloma. El más significativo es la manipulación transgénica de los genes de biosíntesis (ACO) y percepción (ETR1) de ET que reveló la acumulación de novo específica de herbívoros de fenolamidas. Se ha demostrado previamente que ET puede ajustar con precisión la acumulación de nicotina inducida por JA regulando la putrescina N-metiltransferasa (49). Sin embargo, desde un punto de vista mecánico, no está claro cómo ET ajusta con precisión la inducción de fenamida. Además de la función de transducción de señales de la ET, el flujo metabólico también puede desviarse hacia la S-adenosil-1-metionina para regular la inversión en amidas de poliaminofenol. La S-adenosil-1-metionina es un intermediario común de la vía biosintética de las poliaminas y de la ET. El mecanismo por el cual la señal de la ET regula el nivel de fenolamida requiere mayor investigación.
Durante mucho tiempo, debido a la gran cantidad de metabolitos especiales de estructura desconocida, la intensa atención a categorías metabólicas específicas no ha podido evaluar con precisión los cambios temporales de la diversidad metabólica tras las interacciones biológicas. Actualmente, según el análisis de la teoría de la información, el principal resultado de la adquisición de espectros MS/MS basados ​​en metabolitos imparciales es que los herbívoros que comen o simulan herbívoros continúan reduciendo la diversidad metabólica general del metaboloma de la hoja, al tiempo que aumentan su grado de especialización. Este aumento temporal en la especificidad del metaboloma causado por los herbívoros se asocia con un aumento sinérgico en la especificidad del transcriptoma. La característica que más contribuye a esta mayor especialización del metaboloma (con un valor Si más alto) es el metabolito especial con la función herbívora previamente caracterizada. Este modelo es consistente con la predicción de la teoría OD, pero la predicción de MT relacionada con la aleatoriedad de la reprogramación del metaboloma no lo es. Sin embargo, estos datos también son consistentes con la predicción del modelo mixto (mejor MT; Figura 1B), porque otros metabolitos no caracterizados con funciones de defensa desconocidas aún pueden seguir una distribución Si aleatoria.
Un patrón notable capturado además por esta investigación es que desde el nivel de microevolución (planta individual y población de tabaco) a una escala evolutiva mayor (especies de tabaco estrechamente relacionadas), diferentes niveles de organización evolutiva están en la “mejor defensa”. Hay diferencias significativas en las capacidades de los herbívoros. Moore et al. (20) y Kessler y Kalske (1) propusieron independientemente convertir los tres niveles funcionales de biodiversidad originalmente distinguidos por Whittaker (50) en los cambios temporales constitutivos e inducidos de la diversidad química; estos autores no resumieron Los procedimientos para la recopilación de datos de metaboloma a gran escala tampoco describen cómo calcular la diversidad metabólica a partir de estos datos. En este estudio, ajustes menores a la clasificación funcional de Whittaker considerarán la diversidad α-metabólica como la diversidad de espectros MS/MS en una planta dada, y la diversidad β-metabólica como el metabolismo intraespecífico básico de un grupo de poblaciones Espacio, y la diversidad γ-metabólica será una extensión del análisis de especies similares.
La señal de JA es esencial para una amplia gama de respuestas metabólicas de los herbívoros. Sin embargo, existe una falta de pruebas cuantitativas rigurosas sobre la contribución de la regulación intraespecífica de la biosíntesis de JA a la diversidad del metaboloma, y ​​aún no se sabe si la señal de JA es un sitio general para la diversificación metabólica inducida por estrés a una escala macroevolutiva superior. Observamos que la naturaleza herbívora de Nepenthes herbivorous induce la especialización del metaboloma y la variación de la especialización del metaboloma dentro de la población de especies de Nicotiana y entre especies de Nicotiana estrechamente relacionadas está sistemáticamente correlacionada positivamente con la señalización de JA. Además, cuando la señal de JA se ve afectada, la especificidad metabólica inducida por un herbívoro de un solo genotipo se anula (Figura 3, C y E). Dado que los cambios en el espectro metabólico de las poblaciones de Nepenthes atenuadas naturalmente son principalmente cuantitativos, los cambios en la diversidad β metabólica y la especificidad en este análisis pueden deberse en gran medida a la fuerte excitación de categorías de compuestos ricos en metabolitos. Estas clases de compuestos predominan en parte del perfil del metaboloma y dan lugar a una correlación positiva con las señales de JA.
Debido a que los mecanismos bioquímicos de las especies de tabaco estrechamente relacionadas son muy diferentes, los metabolitos se identifican específicamente en el aspecto cualitativo, por lo que es más analítico. El procesamiento del perfil metabólico capturado mediante la teoría de la información revela que la inducción herbívora exacerba la compensación entre la diversidad gamma metabólica y la especialización. La señal de JA juega un papel central en esta compensación. El aumento en la especialización del metaboloma es consistente con la predicción principal de OD y está correlacionado positivamente con la señal de JA, mientras que la señal de JA está correlacionada negativamente con la diversidad gamma metabólica. Estos modelos indican que la capacidad de OD de las plantas está determinada principalmente por la plasticidad de JA, ya sea a escala microevolutiva o a una escala evolutiva mayor. Los experimentos de aplicación exógena de JA que evitan los defectos de biosíntesis de JA revelan además que las especies de tabaco estrechamente relacionadas pueden distinguirse en especies que responden a la señal y especies que no responden a la señal, al igual que su modo de JA y plasticidad del metaboloma inducidos por los herbívoros. Las especies que no responden a las señales no pueden hacerlo debido a su incapacidad para producir JA endógena y, por lo tanto, están sujetas a limitaciones fisiológicas. Esto puede deberse a mutaciones en algunos genes clave de la vía de señalización de JA (AOS y JAR4 en N. crescens). Este resultado subraya que estos patrones macroevolutivos interespecíficos podrían estar impulsados ​​principalmente por cambios en la percepción y la respuesta hormonal interna.
Además de la interacción entre plantas y herbívoros, la exploración de la diversidad metabólica está relacionada con todos los avances teóricos importantes en la investigación de la adaptación biológica al medio ambiente y la evolución de rasgos fenotípicos complejos. Con el aumento en la cantidad de datos adquiridos por los instrumentos MS modernos, la comprobación de hipótesis sobre la diversidad metabólica ahora puede trascender las diferencias de metabolitos individuales/categóricos y realizar análisis globales para revelar patrones inesperados. En el proceso de análisis a gran escala, una metáfora importante es la idea de concebir mapas significativos que puedan usarse para explorar los datos. Por lo tanto, un resultado importante de la combinación actual de metabolómica MS/MS imparcial y teoría de la información es que proporciona una métrica simple que puede usarse para construir mapas para explorar la diversidad metabólica en diferentes escalas taxonómicas. Este es el requisito básico de este método. El estudio de la micro/macro evolución y la ecología de comunidades.
A nivel macroevolutivo, el núcleo de la teoría de coevolución planta-insecto de Ehrlich y Raven (51) es predecir que la variación de la diversidad metabólica interespecífica es la causa de la diversificación de los linajes de plantas. Sin embargo, en los cincuenta años transcurridos desde la publicación de este trabajo seminal, esta hipótesis se ha probado raramente (52). Esto se debe en gran medida a las características filogenéticas de características metabólicas comparables a través de linajes de plantas de larga distancia. La rareza puede utilizarse para anclar métodos de análisis de objetivos. El flujo de trabajo actual de MS/MS procesado por la teoría de la información cuantifica la similitud estructural de MS/MS de metabolitos desconocidos (sin selección previa de metabolitos) y convierte estos MS/MS en un conjunto de MS/MS, por lo que en el metabolismo profesional Estos modelos macroevolutivos se comparan en escala de clasificación. Indicadores estadísticos simples. El proceso es similar al análisis filogenético, que puede utilizar la alineación de secuencias para cuantificar la tasa de diversificación o evolución de caracteres sin predicción previa.
A nivel bioquímico, la hipótesis de selección de Firn y Jones (53) muestra que la diversidad metabólica se mantiene en diferentes niveles para proporcionar materias primas que ejerzan las actividades biológicas de metabolitos previamente no relacionados o sustituidos. Los métodos de la teoría de la información proporcionan un marco en el que estas transiciones evolutivas específicas de metabolitos que ocurren durante la especialización de metabolitos pueden cuantificarse como parte del proceso de selección evolutiva propuesto: adaptación biológicamente activa de metabolitos inhibidos de baja especificidad a alta especificidad de un entorno dado.
En resumen, en los inicios de la biología molecular, se desarrollaron importantes teorías de defensa vegetal, y los métodos deductivos basados ​​en hipótesis se consideran ampliamente el único medio de progreso científico. Esto se debe en gran medida a las limitaciones técnicas para medir el metaboloma completo. Si bien los métodos basados ​​en hipótesis son particularmente útiles para seleccionar otros mecanismos causales, su capacidad para avanzar en nuestra comprensión de las redes bioquímicas es más limitada que la de los métodos computacionales disponibles actualmente en la ciencia contemporánea intensiva en datos. Por lo tanto, las teorías que no se pueden predecir están mucho más allá del alcance de los datos disponibles, por lo que el ciclo de fórmula/prueba hipotética del progreso en el campo de la investigación no puede abolirse (4). Prevemos que el flujo de trabajo computacional de la metabolómica que aquí se presenta puede reavivar el interés en las cuestiones recientes (cómo) y finales (por qué) de la diversidad metabólica, y contribuir a una nueva era de ciencia de datos guiada teóricamente. Esta era reexaminará las importantes teorías que inspiraron a generaciones anteriores.
La alimentación directa de herbívoros se llevó a cabo criando larvas de segundo estadio (Sl) en una sola hoja de una planta carnívora de color pálido, perteneciente a una sola planta de rosal en floración, con 10 réplicas por planta. Las larvas de los insectos se sujetaron con pinzas, y el tejido foliar restante se recolectó 24 y 72 horas después de la infección, se congeló rápidamente y se extrajeron los metabolitos.
Simular el tratamiento herbívoro de manera altamente sincronizada. El método consiste en usar ruedas de patrones de tela para perforar tres filas de espinas a cada lado del nervio central de las tres hojas completamente expandidas de la planta durante la etapa de crecimiento de la guirnalda de tela, y aplicar inmediatamente Ms diluido 1:5. O usar dedos enguantados para insertar S1 OS en la herida de punción. Cosechar y procesar una hoja como se describió anteriormente. Usar el método descrito previamente para extraer metabolitos primarios y hormonas vegetales (54).
Para las aplicaciones exógenas de JA, las tres hojas del pecíolo de cada una de las seis plantas de rosal en floración de cada especie se trataron con 20 μl de pasta de lanolina que contenía 150 μg de MeJA (Lan + MeJA), y 20 μl de lanolina más tratamiento para heridas (Lan + W), o bien se utilizaron 20 μl de lanolina pura como control. Las hojas se recolectaron 72 horas después del tratamiento, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.
En nuestro grupo de investigación se han identificado cuatro líneas transgénicas de JA y ET: irAOC (36), irCOI1 (55), irACO y sETR1 (48). La línea irAOC mostró una marcada disminución en los niveles de JA y JA-Ile, mientras que irCOI1 no fue sensible a las JA. En comparación con EV, la acumulación de JA-Ile aumentó. De manera similar, irACO reduce la producción de ET, y en comparación con EV, sETR1, que es insensible a ET, aumenta su producción.
Se utiliza un espectrómetro láser fotoacústico (sensor de ET en tiempo real Sensor Sense ETD-300) para realizar mediciones de ET de forma no invasiva. Inmediatamente después del tratamiento, se cortó la mitad de las hojas y se transfirieron a un vial de vidrio sellado de 4 ml, y se dejó que el espacio de cabeza se acumulara durante 5 horas. Durante la medición, cada vial se lavó con un flujo de 2 litros/hora de aire puro durante 8 minutos, que previamente había pasado por un catalizador proporcionado por Sensor Sense para eliminar el CO2 y el agua.
Los datos de microarrays se publicaron originalmente en (35) y se guardaron en la base de datos integral de expresión génica del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (número de acceso GSE30287). Para este estudio, se extrajeron los datos correspondientes a las hojas afectadas por el tratamiento W + OSM y al control sin daños. La intensidad bruta se expresa en log2. Antes del análisis estadístico, la línea base se convirtió y normalizó al percentil 75 utilizando el paquete de software R.
Los datos originales de secuenciación de ARN (RNA-seq) de especies de Nicotiana se recuperaron de los Archivos de Lectura Corta (SRA) del NCBI, número de proyecto PRJNA301787, que fue informado por Zhou et al. (39) y procedieron como se describe en (56). Los datos brutos procesados ​​por W + W, W + OSM y W + OSS1 correspondientes a especies de Nicotiana fueron seleccionados para el análisis en este estudio, y procesados ​​de la siguiente manera: Primero, las lecturas de RNA-seq brutas se convirtieron al formato FASTQ. HISAT2 convierte FASTQ a SAM, y SAMtools convierte los archivos SAM en archivos BAM ordenados. StringTie se utiliza para calcular la expresión génica, y su método de expresión es que hay fragmentos por mil fragmentos de base por millón de fragmentos de transcripción secuenciados.
La columna cromatográfica Acclaim (150 mm x 2,1 mm; tamaño de partícula 2,2 μm) utilizada en el análisis y la columna de protección de 4 mm x 4 mm están compuestas del mismo material. En el sistema de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UHPLC) Dionex UltiMate 3000 se utiliza el siguiente gradiente binario: de 0 a 0,5 minutos, isocrático 90 % A [agua desionizada, 0,1 % (v/v) de acetonitrilo y 0,05 % de ácido fórmico], 10 % B (acetonitrilo y 0,05 % de ácido fórmico); de 0,5 a 23,5 minutos, la fase de gradiente es 10 % A y 90 % B, respectivamente; de ​​23,5 a 25 minutos, isocrático 10 % A y 90 % B. El caudal es de 400 μl/min. Para todos los análisis de espectrometría de masas (EM), inyecte el eluyente de la columna en un analizador de cuadrupolo y tiempo de vuelo (qTOF) equipado con una fuente de electrospray que funcione en modo de ionización positiva (voltaje capilar, 4500 V; salida capilar 130 V; temperatura de secado 200 °C; flujo de aire de secado 10 litros/min).
Realizar análisis de fragmentos MS/MS (en adelante denominado MS/MS) que sea irrelevante o indistinguible de los datos para obtener información estructural sobre el perfil metabólico general detectable. El concepto del método MS/MS indiscriminado se basa en el hecho de que el cuadrupolo tiene una ventana de aislamiento de masa muy grande [por lo tanto, considerar todas las señales de relación masa-carga (m/z) como fragmentos]. Por esta razón, debido a que el instrumento Impact II no pudo crear una inclinación CE, se realizaron varios análisis independientes utilizando valores de energía de colisión de disociación inducida por colisión (CE) aumentados. En resumen, primero analizar la muestra por UHPLC-ionización por electrospray/qTOF-MS utilizando el modo de espectrometría de masas simple (condiciones de baja fragmentación generadas por fragmentación en la fuente), escaneando de m/z 50 a 1500 a una frecuencia de repetición de 5 Hz. Utilice nitrógeno como gas de colisión para el análisis MS/MS y realice mediciones independientes en los siguientes cuatro voltajes de disociación inducida por colisión diferentes: 20, 30, 40 y 50 eV. Durante todo el proceso de medición, el cuadrupolo tiene la ventana de aislamiento de masa más grande, de m/z 50 a 1500. Cuando el experimento de m/z del cuerpo frontal y ancho de aislamiento se establece en 200, el rango de masa se activa automáticamente por el software operativo del instrumento y 0 Da. Escanee para fragmentos de masa como en el modo de masa única. Utilice formiato de sodio (50 ml de isopropanol, 200 μl de ácido fórmico y 1 ml de solución acuosa de NaOH 1M) para la calibración de masa. Utilizando el algoritmo de calibración de alta precisión de Bruker, el archivo de datos se calibra después de ejecutar el espectro promedio en un período de tiempo determinado. Utilice la función de exportación del software Data Analysis v4.0 (Brook Dalton, Bremen, Alemania) para convertir los archivos de datos brutos al formato NetCDF. El conjunto de datos MS/MS se ha guardado en la base de datos abierta de metabolómica MetaboLights (www.ebi.ac.uk) con el número de acceso MTBLS1471.
El ensamblaje MS/MS se puede realizar mediante el análisis de correlación entre las señales de calidad MS1 y MS/MS para energías de colisión bajas y altas, y las reglas recientemente implementadas. Se utiliza un script de R para realizar el análisis de correlación de la distribución del precursor al producto, y un script de C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) para implementar las reglas.
Para reducir los errores de falsos positivos causados ​​por el ruido de fondo y la correlación falsa causada por la detección de ciertas características m/z en solo unas pocas muestras, utilizamos la función "fill peak" del paquete R XCMS (para la corrección del ruido de fondo). Se debe utilizar para reemplazar la intensidad "NA" (pico no detectado). Cuando se utiliza la función fill peak, todavía hay muchos valores de intensidad "0" en el conjunto de datos que afectarán el cálculo de la correlación. Luego, comparamos los resultados del procesamiento de datos obtenidos cuando se utiliza la función fill peak y cuando no se utiliza, y calculamos el valor del ruido de fondo basándonos en el valor estimado promedio corregido, y luego reemplazamos estos valores de intensidad 0 con el valor de fondo calculado. También solo consideramos las características cuya intensidad excedía tres veces el valor de fondo y las consideramos "picos verdaderos". Para los cálculos de PCC, solo se consideran las señales m/z del precursor de la muestra (MS1) y los conjuntos de datos de fragmentos con al menos ocho picos verdaderos.
Si la intensidad de la característica de calidad del precursor en toda la muestra está significativamente correlacionada con la intensidad reducida de la misma característica de calidad que está sujeta a energía de colisión baja o alta, y la característica no está etiquetada como un pico isotópico por CAMERA, se puede definir con mayor precisión. Luego, calculando todos los pares precursor-producto posibles dentro de 3 s (la ventana de tiempo de retención estimada para la retención del pico), se realiza el análisis de correlación. Solo cuando el valor m/z es menor que el valor del precursor y la fragmentación MS/MS ocurre en la misma ubicación de la muestra en el conjunto de datos que el precursor del que se deriva, se considera un fragmento.
Basándonos en estas dos reglas simples, excluimos los fragmentos especificados con valores m/z mayores que el m/z del precursor identificado, y en función de la posición de la muestra donde aparece el precursor y el fragmento especificado. También es posible seleccionar las características de calidad generadas por muchos fragmentos en la fuente generados en modo MS1 como precursores candidatos, generando así compuestos MS/MS redundantes. Para reducir esta redundancia de datos, si la similitud NDP de los espectros supera 0,6 y pertenecen al cromatograma “pcgroup” anotado por CAMERA, los fusionaremos. Finalmente, fusionamos los cuatro resultados de CE asociados con el precursor y los fragmentos en el espectro compuesto deconvolucionado final seleccionando el pico de mayor intensidad entre todos los picos candidatos con el mismo valor m/z a diferentes energías de colisión. Los pasos de procesamiento subsiguientes se basan en el concepto de espectro compuesto y tienen en cuenta las diferentes condiciones de CE necesarias para maximizar la probabilidad de fragmentación, ya que algunos fragmentos solo pueden detectarse bajo una energía de colisión específica.
Se utilizó RDPI (30) para calcular la inducibilidad del perfil metabólico. La diversidad del espectro metabólico (índice Hj) se deriva de la abundancia de precursores MS/MS utilizando la entropía de Shannon de la distribución de frecuencia MS/MS mediante la siguiente ecuación descrita por Martínez et al. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) donde Pij corresponde a la frecuencia relativa del i-ésimo MS/MS en la j-ésima muestra (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
La especificidad metabólica (índice Si) se define como la identidad de expresión de un MS/MS dado en relación con la frecuencia entre las muestras consideradas. La especificidad del MS/MS se calcula como Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Utilice la siguiente fórmula para medir el índice δj específico del metaboloma de cada muestra j, y el promedio de la especificidad MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
Los espectros MS/MS se alinean en pares y la similitud se calcula en función de las dos puntuaciones. Primero, utilizando el método NDP estándar (también conocido como método de correlación coseno), utilice la siguiente ecuación para puntuar la similitud de segmento entre espectros NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 donde S1 y S2 Correspondientemente, para el espectro 1 y el espectro 2, así como WS1, i y WS2, i representa el peso basado en la intensidad del pico de modo que la diferencia del i-ésimo pico común entre los dos espectros sea menor que 0,01 Da. El peso se calcula de la siguiente manera: W = [intensidad del pico] m [calidad] n, m = 0,5, n = 2, como sugiere MassBank.
Se implementó un segundo método de puntuación, que implicó analizar la NL compartida entre MS/MS. Para ello, utilizamos las 52 listas de NL que se encuentran frecuentemente durante el proceso de fragmentación de MS en tándem, y la NL más específica (archivo de datos S1) que se ha anotado previamente para el espectro MS/MS de los metabolitos secundarios de la especie debilitada de Nepenthes (9, 26). Se crea un vector binario de 1 y 0 para cada MS/MS, que corresponde a la presencia y ausencia de alguna NL respectivamente. Con base en la similitud de distancia euclidiana, se calcula la puntuación de similitud de NL para cada par de vectores binarios de NL.
Para realizar el agrupamiento dual, utilizamos el paquete R DiffCoEx, que se basa en una extensión del análisis de coexpresión génica ponderada (WGCNA). Utilizando las matrices de puntuación NDP y NL de los espectros MS/MS, utilizamos DiffCoEx para calcular la matriz de correlación comparativa. El agrupamiento binario se realiza configurando el parámetro “cutreeDynamic” en method = “hybrid”, cutHeight = 0.9999, deepSplit = T y minClusterSize = 10. El código fuente de R de DiffCoEx se descargó del archivo adicional 1 de Tesson et al. (57); el paquete de software R WGCNA necesario se puede encontrar en https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Para realizar el análisis de redes moleculares MS/MS, calculamos la conectividad espectral emparejada basándonos en los tipos de similitud NDP y NL, y utilizamos el software Cytoscape para visualizar la topología de la red mediante el diseño orgánico en la aplicación de extensión del algoritmo de diseño CyFilescape yFiles.
Se utilizó R versión 3.0.1 para realizar el análisis estadístico de los datos. La significación estadística se evaluó mediante un análisis de varianza bidireccional (ANOVA), seguido de la prueba post-hoc de diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey. Para analizar la diferencia entre el tratamiento con herbívoros y el control, se analizó la distribución bilateral de los dos grupos de muestras con la misma varianza mediante la prueba t de Student.
Para consultar los materiales complementarios de este artículo, visite http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
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La teoría de la información proporciona una moneda universal para la comparación de metabolomas especiales y la predicción de teorías de defensa de pruebas.
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