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Las tormentas de polvo representan una seria amenaza para muchos países del mundo debido a su impacto destructivo en la agricultura, la salud humana, las redes de transporte y la infraestructura. Como resultado, la erosión eólica se considera un problema global. Uno de los enfoques ecológicos para frenar la erosión eólica es el uso de la precipitación de carbonato inducida por microorganismos (MICP). Sin embargo, los subproductos de la MICP basada en la degradación de urea, como el amoníaco, no son ideales cuando se producen en grandes cantidades. Este estudio presenta dos formulaciones de bacterias de formiato de calcio para la degradación de MICP sin producir urea y compara exhaustivamente su rendimiento con dos formulaciones de bacterias de acetato de calcio que no producen amoníaco. Las bacterias consideradas son Bacillus subtilis y Bacillus amyloliquefaciens. Primero, se determinaron los valores optimizados de los factores que controlan la formación de CaCO3. Luego se realizaron pruebas en túnel de viento en muestras de dunas de arena tratadas con las formulaciones optimizadas, y se midieron la resistencia a la erosión eólica, la velocidad umbral de desprendimiento y la resistencia al bombardeo de arena. Se evaluaron los alomorfos de carbonato de calcio (CaCO3) mediante microscopía óptica, microscopía electrónica de barrido (MEB) y análisis de difracción de rayos X. Las formulaciones a base de formiato de calcio mostraron un rendimiento significativamente superior al de las formulaciones a base de acetato en cuanto a la formación de carbonato de calcio. Además, B. subtilis produjo más carbonato de calcio que B. amyloliquefaciens. Las micrografías de MEB mostraron claramente la unión e impronta de bacterias activas e inactivas en el carbonato de calcio causada por la sedimentación. Todas las formulaciones redujeron significativamente la erosión eólica.
La erosión eólica se ha reconocido desde hace tiempo como un problema importante que afecta a las regiones áridas y semiáridas, como el suroeste de Estados Unidos, el oeste de China, el África subsahariana y gran parte de Oriente Medio¹. Las escasas precipitaciones en climas áridos e hiperáridos han transformado gran parte de estas regiones en desiertos, dunas de arena y tierras sin cultivar. La continua erosión eólica supone una amenaza ambiental para infraestructuras como las redes de transporte, las tierras agrícolas y las zonas industriales, lo que conlleva malas condiciones de vida y elevados costes de desarrollo urbano en estas regiones²,³,⁴. Es importante destacar que la erosión eólica no solo afecta al lugar donde se produce, sino que también causa problemas de salud y económicos en comunidades remotas, ya que transporta partículas por el viento a zonas alejadas de su origen⁵,⁶.
El control de la erosión eólica sigue siendo un problema global. Se utilizan diversos métodos de estabilización del suelo para controlarla. Estos incluyen materiales como la aplicación de agua7, acolchados de aceite8, biopolímeros5, precipitación de carbonato inducida por microorganismos (MICP)9,10,11,12 y precipitación de carbonato inducida por enzimas (EICP)1. La humectación del suelo es un método estándar para la supresión del polvo en el campo. Sin embargo, su rápida evaporación limita su eficacia en regiones áridas y semiáridas1. La aplicación de compuestos de acolchado de aceite aumenta la cohesión de la arena y la fricción entre partículas. Su propiedad cohesiva une los granos de arena; sin embargo, los acolchados de aceite también presentan otros problemas: su color oscuro aumenta la absorción de calor y provoca la muerte de plantas y microorganismos. Su olor y vapores pueden causar problemas respiratorios y, sobre todo, su elevado coste es otro obstáculo. Los biopolímeros son uno de los métodos ecológicos propuestos recientemente para mitigar la erosión eólica; se extraen de fuentes naturales como plantas, animales y bacterias. La goma xantana, la goma guar, el quitosano y la goma gellan son los biopolímeros más utilizados en aplicaciones de ingeniería⁵. Sin embargo, los biopolímeros solubles en agua pueden perder resistencia y lixiviarse del suelo al exponerse al agua¹³,¹⁴. Se ha demostrado que el EICP es un método eficaz para la supresión de polvo en diversas aplicaciones, como caminos sin pavimentar, estanques de relaves y obras de construcción. Si bien sus resultados son alentadores, deben considerarse algunos inconvenientes potenciales, como el costo y la falta de sitios de nucleación (lo que acelera la formación y precipitación de cristales de CaCO₃¹⁵,¹⁶).
La MICP fue descrita por primera vez a finales del siglo XIX por Murray e Irwin (1890) y Steinmann (1901) en su estudio de la degradación de la urea por microorganismos marinos17. La MICP es un proceso biológico natural que involucra una variedad de actividades microbianas y procesos químicos en los que el carbonato de calcio se precipita por la reacción de iones carbonato de metabolitos microbianos con iones calcio en el medio ambiente18,19. La MICP que involucra el ciclo del nitrógeno de degradación de la urea (MICP de degradación de la urea) es el tipo más común de precipitación de carbonato inducida por microorganismos, en la que la ureasa producida por bacterias cataliza la hidrólisis de la urea20,21,22,23,24,25,26,27 de la siguiente manera:
En el MICP que involucra el ciclo del carbono de la oxidación de sales orgánicas (MICP sin degradación de urea), las bacterias heterótrofas utilizan sales orgánicas como acetato, lactato, citrato, succinato, oxalato, malato y glioxilato como fuentes de energía para producir minerales carbonatados28. En presencia de lactato de calcio como fuente de carbono e iones de calcio, la reacción química de formación de carbonato de calcio se muestra en la ecuación (5).
En el proceso MICP, las células bacterianas proporcionan sitios de nucleación que son particularmente importantes para la precipitación de carbonato de calcio; la superficie de la célula bacteriana tiene carga negativa y puede actuar como adsorbente de cationes divalentes como los iones de calcio. Al adsorber iones de calcio en las células bacterianas, cuando la concentración de iones carbonato es suficiente, los cationes de calcio y los aniones carbonato reaccionan y el carbonato de calcio se precipita en la superficie bacteriana29,30. El proceso se puede resumir de la siguiente manera31,32:
Los cristales de carbonato de calcio biogenerados se pueden dividir en tres tipos: calcita, vaterita y aragonita. Entre ellos, la calcita y la vaterita son los alomorfos de carbonato de calcio inducidos por bacterias más comunes33,34. La calcita es el alomorfo de carbonato de calcio termodinámicamente más estable35. Aunque se ha informado que la vaterita es metaestable, eventualmente se transforma en calcita36,37. La vaterita es el más denso de estos cristales. Es un cristal hexagonal que tiene una mejor capacidad de llenado de poros que otros cristales de carbonato de calcio debido a su mayor tamaño38. Tanto el MICP degradado por urea como el no degradado por urea pueden conducir a la precipitación de vaterita13,39,40,41.
Aunque MICP ha mostrado un potencial prometedor en la estabilización de suelos problemáticos y suelos susceptibles a la erosión eólica42,43,44,45,46,47,48, uno de los subproductos de la hidrólisis de la urea es el amoníaco, que puede causar problemas de salud de leves a graves dependiendo del nivel de exposición49. Este efecto secundario hace que el uso de esta tecnología en particular sea controvertido, especialmente cuando se necesitan tratar grandes áreas, como para la supresión de polvo. Además, el olor a amoníaco es intolerable cuando el proceso se lleva a cabo a altas tasas de aplicación y grandes volúmenes, lo que puede afectar su aplicabilidad práctica. Aunque estudios recientes han demostrado que los iones de amonio pueden reducirse convirtiéndolos en otros productos como la estruvita, estos métodos no eliminan completamente los iones de amonio50. Por lo tanto, todavía existe la necesidad de explorar soluciones alternativas que no generen iones de amonio. El uso de vías de degradación no urea para MICP puede proporcionar una solución potencial que ha sido poco explorada en el contexto de la mitigación de la erosión eólica. Fattahi et al. Se investigó la degradación de MICP sin urea utilizando acetato de calcio y Bacillus megaterium41, mientras que Mohebbi et al. utilizaron acetato de calcio y Bacillus amyloliquefaciens9. Sin embargo, su estudio no se comparó con otras fuentes de calcio ni con bacterias heterótrofas que podrían mejorar la resistencia a la erosión eólica. Asimismo, existe una falta de bibliografía que compare las vías de degradación sin urea con las vías de degradación con urea en la mitigación de la erosión eólica.
Además, la mayoría de los estudios sobre erosión eólica y control del polvo se han realizado en muestras de suelo con superficies planas.^1,51,52,53 Sin embargo, las superficies planas son menos comunes en la naturaleza que las colinas y depresiones. Por eso, las dunas de arena son el rasgo paisajístico más común en las regiones desérticas.
Para superar las deficiencias mencionadas, este estudio tuvo como objetivo introducir un nuevo conjunto de agentes bacterianos que no producen amoníaco. Para ello, consideramos vías de MICP que no degradan urea. Se investigó la eficiencia de dos fuentes de calcio (formiato de calcio y acetato de calcio). Hasta donde saben los autores, la precipitación de carbonato utilizando dos combinaciones de fuentes de calcio y bacterias (es decir, formiato de calcio-Bacillus subtilis y formiato de calcio-Bacillus amyloliquefaciens) no se ha investigado en estudios previos. La elección de estas bacterias se basó en las enzimas que producen, las cuales catalizan la oxidación del formiato de calcio y el acetato de calcio para formar precipitación microbiana de carbonato. Diseñamos un estudio experimental exhaustivo para encontrar los factores óptimos, tales como el pH, los tipos de bacterias y fuentes de calcio y sus concentraciones, la proporción de bacterias con respecto a la solución de fuente de calcio y el tiempo de curado. Finalmente, se investigó la eficacia de este conjunto de agentes bacterianos para suprimir la erosión eólica mediante la precipitación de carbonato de calcio, realizando una serie de pruebas en túnel de viento sobre dunas de arena para determinar la magnitud de la erosión eólica, la velocidad de desprendimiento umbral y la resistencia al bombardeo del viento de la arena. También se realizaron mediciones con penetrómetro y estudios microestructurales (por ejemplo, análisis de difracción de rayos X (DRX) y microscopía electrónica de barrido (MEB)).
La producción de carbonato de calcio requiere iones de calcio e iones de carbonato. Los iones de calcio se pueden obtener de diversas fuentes, como cloruro de calcio, hidróxido de calcio y leche desnatada en polvo.^54,55 Los iones de carbonato se pueden producir mediante diversos métodos microbianos, como la hidrólisis de urea y la oxidación aeróbica o anaeróbica de materia orgánica.⁵⁶ En este estudio, los iones de carbonato se obtuvieron mediante la reacción de oxidación de formiato y acetato. Además, utilizamos sales de calcio de formiato y acetato para producir carbonato de calcio puro, obteniéndose así únicamente CO₂ y H_2O como subproductos. En este proceso, una sola sustancia actúa como fuente de calcio y de carbonato, sin producirse amoníaco. Estas características hacen que el método de producción de carbonato y de la fuente de calcio que consideramos sea muy prometedor.
Las reacciones correspondientes del formiato de calcio y el acetato de calcio para formar carbonato de calcio se muestran en las fórmulas (7)-(14). Las fórmulas (7)-(11) muestran que el formiato de calcio se disuelve en agua para formar ácido fórmico o formiato. La solución es, por lo tanto, una fuente de iones de calcio e hidróxido libres (fórmulas 8 y 9). Como resultado de la oxidación del ácido fórmico, los átomos de carbono del ácido fórmico se convierten en dióxido de carbono (fórmula 10). Finalmente, se forma carbonato de calcio (fórmulas 11 y 12).
De manera similar, el carbonato de calcio se forma a partir del acetato de calcio (ecuaciones 13-15), excepto que se forma ácido acético o acetato en lugar de ácido fórmico.
Sin la presencia de enzimas, el acetato y el formato no pueden oxidarse a temperatura ambiente. La FDH (formato deshidrogenasa) y la CoA (coenzima A) catalizan la oxidación del formato y el acetato para formar dióxido de carbono, respectivamente (Ecs. 16, 17) 57, 58, 59. Varias bacterias son capaces de producir estas enzimas, y en este estudio se utilizaron bacterias heterótrofas, a saber, Bacillus subtilis (PTCC #1204 (Persian Type Culture Collection), también conocido como NCIMB #13061 (International Collection of Bacteria, Yeast, Phage, Plásmidos, Semillas de Plantas y Cultivos de Tejidos Celulares Vegetales)) y Bacillus amyloliquefaciens (PTCC #1732, NCIMB #12077). Estas bacterias se cultivaron en un medio que contenía peptona de carne (5 g/L) y extracto de carne (3 g/L), llamado caldo nutritivo (NBR) (105443 Merck).
Así, se prepararon cuatro formulaciones para inducir la precipitación de carbonato de calcio utilizando dos fuentes de calcio y dos bacterias: formiato de calcio y Bacillus subtilis (FS), formiato de calcio y Bacillus amyloliquefaciens (FA), acetato de calcio y Bacillus subtilis (AS), y acetato de calcio y Bacillus amyloliquefaciens (AA).
En la primera parte del diseño experimental, se realizaron pruebas para determinar la combinación óptima que permitiera alcanzar la máxima producción de carbonato de calcio. Dado que las muestras de suelo contenían carbonato de calcio, se diseñó un conjunto de pruebas de evaluación preliminar para medir con precisión el CaCO3 producido por las diferentes combinaciones, y se evaluaron mezclas de medio de cultivo y soluciones de fuente de calcio. Para cada combinación de fuente de calcio y solución bacteriana definida anteriormente (FS, FA, AS y AA), se derivaron factores de optimización (concentración de la fuente de calcio, tiempo de curado, concentración de la solución bacteriana medida por la densidad óptica de la solución (DO), relación fuente de calcio/solución bacteriana y pH) y se utilizaron en las pruebas de túnel de viento para el tratamiento de dunas de arena descritas en las siguientes secciones.
Para cada combinación, se realizaron 150 experimentos para estudiar el efecto de la precipitación de CaCO3 y evaluar diversos factores, como la concentración de la fuente de calcio, el tiempo de curado, el valor de DO bacteriana, la relación entre la fuente de calcio y la solución bacteriana, y el pH durante la oxidación aeróbica de la materia orgánica (Tabla 1). El rango de pH para el proceso optimizado se seleccionó en función de las curvas de crecimiento de Bacillus subtilis y Bacillus amyloliquefaciens para obtener un crecimiento más rápido. Esto se explica con más detalle en la sección de Resultados.
Se siguieron los siguientes pasos para preparar las muestras para la fase de optimización. Primero, se preparó la solución MICP ajustando el pH inicial del medio de cultivo y luego se esterilizó en autoclave a 121 °C durante 15 min. A continuación, se inoculó la cepa en una cabina de flujo laminar y se mantuvo en una incubadora con agitación a 30 °C y 180 rpm. Una vez que la DO de las bacterias alcanzó el nivel deseado, se mezcló con la solución de fuente de calcio en la proporción deseada (Figura 1a). Se dejó reaccionar y solidificar la solución MICP en una incubadora con agitación a 220 rpm y 30 °C durante un tiempo que alcanzó el valor objetivo. El CaCO3 precipitado se separó después de la centrifugación a 6000 g durante 5 min y luego se secó a 40 °C para preparar las muestras para la prueba del calcímetro (Figura 1b). La precipitación de CaCO3 se midió utilizando un calcímetro Bernard, donde el polvo de CaCO3 reacciona con HCl 1,0 N (ASTM-D4373-02) para producir CO2, y el volumen de este gas es una medida del contenido de CaCO3 (Figura 1c). Para convertir el volumen de CO2 a contenido de CaCO3, se generó una curva de calibración lavando polvo de CaCO3 puro con HCl 1 N y graficando el resultado frente al CO2 liberado. La morfología y pureza del polvo de CaCO3 precipitado se investigaron mediante imágenes SEM y análisis XRD. Se utilizó un microscopio óptico con un aumento de 1000 para estudiar la formación de carbonato de calcio alrededor de las bacterias, la fase del carbonato de calcio formado y la actividad de las bacterias.
La cuenca de Dejegh es una región muy erosionada, bien conocida en la provincia suroccidental de Fars, Irán. Los investigadores recolectaron muestras de suelo erosionado por el viento en la zona. Las muestras se tomaron de la superficie del suelo para el estudio. Los análisis de indicadores en las muestras de suelo mostraron que se trataba de un suelo arenoso mal clasificado con limo, clasificado como SP-SM según el Sistema Unificado de Clasificación de Suelos (USC) (Figura 2a). El análisis de difracción de rayos X (DRX) mostró que el suelo de Dejegh estaba compuesto principalmente de calcita y cuarzo (Figura 2b). Además, el análisis de espectroscopia de energía dispersiva de rayos X (EDX) mostró que otros elementos como Al, K y Fe también estaban presentes en proporciones menores.
Para preparar las dunas de laboratorio para las pruebas de erosión eólica, el suelo se trituró desde una altura de 170 mm a través de un embudo de 10 mm de diámetro hasta una superficie firme, obteniéndose una duna típica de 60 mm de altura y 210 mm de diámetro. En la naturaleza, las dunas de arena de menor densidad se forman por procesos eólicos. De manera similar, la muestra preparada mediante el procedimiento anterior presentó la menor densidad relativa, γ = 14,14 kN/m³, formando un cono de arena depositado sobre una superficie horizontal con un ángulo de reposo de aproximadamente 29,7°.
La solución MICP óptima obtenida en la sección anterior se pulverizó sobre la pendiente de la duna a tasas de aplicación de 1, 2 y 3 lm-2 y luego las muestras se almacenaron en una incubadora a 30 °C (Fig. 3) durante 9 días (es decir, el tiempo de curado óptimo) y luego se sacaron para realizar pruebas en el túnel de viento.
Para cada tratamiento, se prepararon cuatro especímenes, uno para medir el contenido de carbonato de calcio y la resistencia superficial usando un penetrómetro, y los tres especímenes restantes se usaron para pruebas de erosión a tres velocidades diferentes. En las pruebas del túnel de viento, la cantidad de erosión se determinó a diferentes velocidades del viento, y luego la velocidad de ruptura umbral para cada espécimen de tratamiento se determinó usando una gráfica de cantidad de erosión versus velocidad del viento. Además de las pruebas de erosión del viento, los especímenes tratados fueron sometidos a bombardeo de arena (es decir, experimentos de salto). Se prepararon dos especímenes adicionales para este propósito a tasas de aplicación de 2 y 3 L m−2. La prueba de bombardeo de arena duró 15 min con un flujo de 120 gm−1, que está dentro del rango de valores seleccionados en estudios previos60,61,62. La distancia horizontal entre la boquilla abrasiva y la base de la duna fue de 800 mm, ubicada 100 mm por encima del fondo del túnel. Esta posición se estableció de manera que casi todas las partículas de arena saltantes cayeran sobre la duna.
La prueba en el túnel de viento se realizó en un túnel abierto de 8 m de largo, 0,4 m de ancho y 1 m de alto (Figura 4a). El túnel está construido con láminas de acero galvanizado y puede generar una velocidad del viento de hasta 25 m/s. Además, se utiliza un convertidor de frecuencia para ajustar la frecuencia del ventilador y aumentarla gradualmente hasta alcanzar la velocidad del viento deseada. La Figura 4b muestra el diagrama esquemático de las dunas de arena erosionadas por el viento y el perfil de velocidad del viento medido en el túnel.
Finalmente, para comparar los resultados de la formulación MICP no urealítica propuesta en este estudio con los resultados de la prueba de control MICP urealítica, también se prepararon muestras de dunas y se trataron con una solución biológica que contenía urea, cloruro de calcio y Sporosarcina pasteurii (ya que Sporosarcina pasteurii tiene una capacidad significativa para producir ureasa63). La densidad óptica de la solución bacteriana fue de 1,5, y las concentraciones de urea y cloruro de calcio fueron de 1 M (seleccionadas con base en los valores recomendados en estudios previos36,64,65). El medio de cultivo consistió en caldo nutritivo (8 g/L) y urea (20 g/L). La solución bacteriana se roció sobre la superficie de la duna y se dejó durante 24 horas para la adhesión bacteriana. Después de 24 horas de adhesión, se roció una solución cementante (cloruro de calcio y urea). La prueba de control MICP urealítica se denomina en adelante UMC. El contenido de carbonato de calcio de las muestras de suelo tratadas urealíticamente y no urealíticamente se obtuvo mediante lavado según el procedimiento propuesto por Choi et al.66
La figura 5 muestra las curvas de crecimiento de Bacillus amyloliquefaciens y Bacillus subtilis en el medio de cultivo (solución nutritiva) con un rango de pH inicial de 5 a 10. Como se observa en la figura, Bacillus amyloliquefaciens y Bacillus subtilis crecieron más rápido a pH 6-8 y 7-9, respectivamente. Por lo tanto, este rango de pH se adoptó en la etapa de optimización.
Curvas de crecimiento de (a) Bacillus amyloliquefaciens y (b) Bacillus subtilis a diferentes valores de pH iniciales del medio nutritivo.
La Figura 6 muestra la cantidad de dióxido de carbono producido en el medidor de cal Bernard, que representa el carbonato de calcio precipitado (CaCO3). Dado que un factor se mantuvo fijo en cada combinación y los demás se variaron, cada punto en estos gráficos corresponde al volumen máximo de dióxido de carbono en ese conjunto de experimentos. Como se muestra en la figura, a medida que aumentaba la concentración de la fuente de calcio, aumentaba la producción de carbonato de calcio. Por lo tanto, la concentración de la fuente de calcio afecta directamente la producción de carbonato de calcio. Dado que la fuente de calcio y la fuente de carbono son las mismas (es decir, formiato de calcio y acetato de calcio), cuantos más iones de calcio se liberan, más carbonato de calcio se forma (Figura 6a). En las formulaciones AS y AA, la producción de carbonato de calcio continuó aumentando con el tiempo de curado hasta que la cantidad de precipitado se mantuvo prácticamente sin cambios después de 9 días. En la formulación FA, la tasa de formación de carbonato de calcio disminuyó cuando el tiempo de curado superó los 6 días. En comparación con otras formulaciones, la formulación FS mostró una tasa de formación de carbonato de calcio relativamente baja después de 3 días (Figura 6b). En las formulaciones FA y FS, se obtuvo el 70 % y el 87 % de la producción total de carbonato de calcio después de tres días, mientras que en las formulaciones AA y AS, esta proporción fue de solo alrededor del 46 % y el 45 %, respectivamente. Esto indica que la formulación a base de ácido fórmico tiene una mayor tasa de formación de CaCO3 en la etapa inicial en comparación con la formulación a base de acetato. Sin embargo, la tasa de formación disminuye con el aumento del tiempo de curado. De la Figura 6c se puede concluir que, incluso a concentraciones bacterianas superiores a OD1, no existe una contribución significativa a la formación de carbonato de calcio.
Cambio en el volumen de CO2 (y el contenido correspondiente de CaCO3) medido por el calcímetro de Bernard en función de (a) la concentración de la fuente de calcio, (b) el tiempo de fraguado, (c) la DO, (d) el pH inicial, (e) la relación entre la fuente de calcio y la solución bacteriana (para cada formulación); y (f) la cantidad máxima de carbonato de calcio producida para cada combinación de fuente de calcio y bacterias.
En cuanto al efecto del pH inicial del medio, la Figura 6d muestra que para FA y FS, la producción de CaCO3 alcanzó un valor máximo a pH 7. Esta observación es consistente con estudios previos que indican que las enzimas FDH son más estables a pH 7-6,7. Sin embargo, para AA y AS, la precipitación de CaCO3 aumentó cuando el pH superó 7. Estudios previos también mostraron que el rango de pH óptimo para la actividad de la enzima CoA es de 8 a 9,2-6,8. Considerando que los rangos de pH óptimos para la actividad de la enzima CoA y el crecimiento de B. amyloliquefaciens son (8-9,2) y (6-8), respectivamente (Figura 5a), se espera que el pH óptimo de la formulación AA sea 8, y los dos rangos de pH se superponen. Este hecho fue confirmado por experimentos, como se muestra en la Figura 6d. Dado que el pH óptimo para el crecimiento de B. subtilis es 7-9 (Figura 5b) y el pH óptimo para la actividad de la enzima CoA es 8-9.2, se espera que el rendimiento máximo de precipitación de CaCO3 esté en el rango de pH de 8-9, lo cual se confirma en la Figura 6d (es decir, el pH óptimo de precipitación es 9). Los resultados mostrados en la Figura 6e indican que la proporción óptima de solución de fuente de calcio a solución bacteriana es 1 tanto para soluciones de acetato como de formato. Para comparar, el rendimiento de diferentes formulaciones (es decir, AA, AS, FA y FS) se evaluó en función de la producción máxima de CaCO3 bajo diferentes condiciones (es decir, concentración de fuente de calcio, tiempo de curado, OD, proporción de fuente de calcio a solución bacteriana y pH inicial). Entre las formulaciones estudiadas, la formulación FS tuvo la mayor producción de CaCO3, que fue aproximadamente tres veces mayor que la de la formulación AA (Figura 6f). Se realizaron cuatro experimentos de control sin bacterias para ambas fuentes de calcio y no se observó precipitación de CaCO3 después de 30 días.
Las imágenes de microscopía óptica de todas las formulaciones mostraron que la vaterita era la fase principal en la que se formaba el carbonato de calcio (Figura 7). Los cristales de vaterita eran esféricos69,70,71. Se encontró que el carbonato de calcio precipitaba sobre las células bacterianas porque la superficie de las células bacterianas estaba cargada negativamente y podía actuar como adsorbente de cationes divalentes. Tomando como ejemplo la formulación FS en este estudio, después de 24 horas, el carbonato de calcio comenzó a formarse sobre algunas células bacterianas (Figura 7a), y después de 48 horas, el número de células bacterianas recubiertas con carbonato de calcio aumentó significativamente. Además, como se muestra en la Figura 7b, también se pudieron detectar partículas de vaterita. Finalmente, después de 72 horas, una gran cantidad de bacterias parecía estar unida a los cristales de vaterita, y el número de partículas de vaterita aumentó significativamente (Figura 7c).
Observaciones mediante microscopía óptica de la precipitación de CaCO3 en composiciones FS a lo largo del tiempo: (a) 24, (b) 48 y (c) 72 h.
Para investigar más a fondo la morfología de la fase precipitada, se realizaron análisis de difracción de rayos X (DRX) y microscopía electrónica de barrido (MEB) de los polvos. Los espectros de DRX (Fig. 8a) y las micrografías de MEB (Fig. 8b, c) confirmaron la presencia de cristales de vaterita, ya que presentaban una forma similar a la de una lechuga y se observó una correspondencia entre los picos de la vaterita y los picos del precipitado.
(a) Comparación de los espectros de difracción de rayos X del CaCO3 formado y la vaterita. Micrografías SEM de la vaterita con una magnificación de (b) 1 kHz y (c) 5,27 kHz, respectivamente.
Los resultados de las pruebas en el túnel de viento se muestran en la Figura 9a, b. En la Figura 9a se observa que la velocidad umbral de erosión (VUE) de la arena sin tratar es de aproximadamente 4,32 m/s. Con una tasa de aplicación de 1 l/m² (Figura 9a), las pendientes de las líneas de tasa de pérdida de suelo para las fracciones FA, FS, AA y UMC son aproximadamente iguales a las de la duna sin tratar. Esto indica que el tratamiento con esta tasa de aplicación es ineficaz y que, tan pronto como la velocidad del viento supera la VUE, la fina costra del suelo desaparece y la tasa de erosión de la duna es la misma que la de la duna sin tratar. La pendiente de erosión de la fracción AS también es menor que la de las otras fracciones con abscisas más bajas (es decir, VUE) (Figura 9a). Las flechas en la Figura 9b indican que, a la velocidad máxima del viento de 25 m/s, no se produjo erosión en las dunas tratadas con tasas de aplicación de 2 y 3 l/m². En otras palabras, para FS, FA, AS y UMC, las dunas fueron más resistentes a la erosión eólica causada por la deposición de CaCO³ a tasas de aplicación de 2 y 3 l/m² que a la velocidad máxima del viento (es decir, 25 m/s). Por lo tanto, el valor de TDV de 25 m/s obtenido en estos ensayos es el límite inferior para las tasas de aplicación que se muestran en la Figura 9b, excepto en el caso de AA, donde el TDV es casi igual a la velocidad máxima del túnel de viento.
Ensayo de erosión eólica (a) Pérdida de peso frente a la velocidad del viento (tasa de aplicación 1 l/m2), (b) Velocidad umbral de desprendimiento frente a la tasa de aplicación y la formulación (CA para acetato de calcio, CF para formiato de calcio).
La Figura 10 muestra la erosión superficial de dunas de arena tratadas con diferentes formulaciones y tasas de aplicación después de la prueba de bombardeo de arena y los resultados cuantitativos se muestran en la Figura 11. El caso sin tratamiento no se muestra porque no mostró resistencia y se erosionó completamente (pérdida total de masa) durante la prueba de bombardeo de arena. Es evidente en la Figura 11 que la muestra tratada con biocomposición AA perdió el 83,5% de su peso a una tasa de aplicación de 2 l/m2, mientras que todas las demás muestras mostraron menos del 30% de erosión durante el proceso de bombardeo de arena. Cuando la tasa de aplicación se incrementó a 3 l/m2, todas las muestras tratadas perdieron menos del 25% de su peso. En ambas tasas de aplicación, el compuesto FS mostró la mejor resistencia al bombardeo de arena. La resistencia máxima y mínima al bombardeo en las muestras tratadas con FS y AA puede atribuirse a su precipitación máxima y mínima de CaCO3 (Figura 6f).
Resultados del bombardeo de dunas de arena de diferente composición a caudales de 2 y 3 l/m2 (las flechas indican la dirección del viento, las cruces indican la dirección del viento perpendicular al plano del dibujo).
Como se muestra en la Figura 12, el contenido de carbonato de calcio de todas las fórmulas aumentó a medida que la tasa de aplicación se incrementó de 1 L/m² a 3 L/m². Además, en todas las tasas de aplicación, la fórmula con mayor contenido de carbonato de calcio fue FS, seguida de FA y UMC. Esto sugiere que estas fórmulas podrían tener mayor resistencia superficial.
La figura 13a muestra el cambio en la resistencia superficial de muestras de suelo sin tratar, de control y tratadas, medido mediante la prueba del permeámetro. En esta figura, es evidente que la resistencia superficial de las formulaciones UMC, AS, FA y FS aumentó significativamente con el incremento de la tasa de aplicación. Sin embargo, el aumento en la resistencia superficial fue relativamente pequeño en la formulación AA. Como se muestra en la figura, las formulaciones FA y FS de MICP no degradado con urea tienen una mejor permeabilidad superficial en comparación con el MICP degradado con urea. La figura 13b muestra el cambio en la TDV con la resistencia superficial del suelo. En esta figura, es claramente evidente que para dunas con una resistencia superficial mayor de 100 kPa, la velocidad de desprendimiento umbral superará los 25 m/s. Dado que la resistencia superficial in situ se puede medir fácilmente con un permeámetro, este conocimiento puede ayudar a estimar la TDV en ausencia de pruebas en túnel de viento, sirviendo así como un indicador de control de calidad para aplicaciones de campo.
Los resultados de SEM se muestran en la Figura 14. Las Figuras 14a-b muestran las partículas ampliadas de la muestra de suelo sin tratar, lo que indica claramente que es cohesiva y no tiene unión natural ni cementación. La Figura 14c muestra la micrografía SEM de la muestra de control tratada con MICP degradado con urea. Esta imagen muestra la presencia de precipitados de CaCO3 como polimorfos de calcita. Como se muestra en las Figuras 14d-o, el CaCO3 precipitado une las partículas; también se pueden identificar cristales esféricos de vaterita en las micrografías SEM. Los resultados de este estudio y de estudios previos indican que los enlaces de CaCO3 formados como polimorfos de vaterita también pueden proporcionar una resistencia mecánica razonable; nuestros resultados muestran que la resistencia superficial aumenta a 350 kPa y la velocidad de separación umbral aumenta de 4,32 a más de 25 m/s. Este resultado es consistente con los resultados de estudios previos que indican que la matriz de CaCO3 precipitado por MICP es vaterita, que tiene una resistencia mecánica y una resistencia a la erosión eólica razonables13,40 y puede mantener una resistencia a la erosión eólica razonable incluso después de 180 días de exposición a condiciones ambientales de campo13.
(a, b) Micrografías SEM de suelo sin tratar, (c) control de degradación de urea MICP, (df) muestras tratadas con AA, (gi) muestras tratadas con AS, (jl) muestras tratadas con FA y (mo) muestras tratadas con FS a una tasa de aplicación de 3 L/m2 a diferentes aumentos.
Las figuras 14d-f muestran que, tras el tratamiento con compuestos AA, se precipitó carbonato de calcio en la superficie y entre los granos de arena, observándose también algunos granos sin recubrimiento. En el caso de los componentes AS, si bien la cantidad de CaCO3 formada no aumentó significativamente (Fig. 6f), la cantidad de contactos entre los granos de arena causados ​​por el CaCO3 aumentó significativamente en comparación con los compuestos AA (Fig. 14g-i).
De las figuras 14j-l y 14m-o se desprende que el uso de formiato de calcio como fuente de calcio conlleva un aumento adicional en la precipitación de CaCO3 en comparación con el compuesto AS, lo cual concuerda con las mediciones del medidor de calcio en la figura 6f. Este CaCO3 adicional parece depositarse principalmente en las partículas de arena y no necesariamente mejora la calidad del contacto. Esto confirma el comportamiento observado previamente: a pesar de las diferencias en la cantidad de precipitación de CaCO3 (figura 6f), las tres formulaciones (AS, FA y FS) no difieren significativamente en términos de rendimiento antieólico (viento) (figura 11) y resistencia superficial (figura 13a).
Para visualizar mejor las células bacterianas recubiertas de CaCO3 y la impronta bacteriana en los cristales precipitados, se tomaron micrografías SEM de alta magnificación y los resultados se muestran en la Figura 15. Como se observa, el carbonato de calcio precipita sobre las células bacterianas y proporciona los núcleos necesarios para la precipitación. La figura también muestra los enlaces activos e inactivos inducidos por el CaCO3. Se puede concluir que cualquier aumento en los enlaces inactivos no necesariamente conduce a una mayor mejora en el comportamiento mecánico. Por lo tanto, aumentar la precipitación de CaCO3 no necesariamente conduce a una mayor resistencia mecánica y el patrón de precipitación juega un papel importante. Este punto también se ha estudiado en los trabajos de Terzis y Laloui72 y Soghi y Al-Kabani45,73. Para explorar más a fondo la relación entre el patrón de precipitación y la resistencia mecánica, se recomiendan estudios de MICP utilizando imágenes µCT, lo cual está fuera del alcance de este estudio (es decir, introducir diferentes combinaciones de fuente de calcio y bacterias para MICP sin amoníaco).
El CaCO3 indujo enlaces activos e inactivos en muestras tratadas con (a) composición AS y (b) composición FS y dejó una huella de células bacterianas en el sedimento.
Como se muestra en las figuras 14j-o y 15b, se observa una película de CaCO₃ (según el análisis EDX, la composición porcentual de cada elemento en la película es de 11 % de carbono, 46,62 % de oxígeno y 42,39 % de calcio, valores muy similares a los de la figura 16). Esta película recubre los cristales de vaterita y las partículas del suelo, contribuyendo a mantener la integridad del sistema suelo-sedimento. La presencia de esta película se observó únicamente en las muestras tratadas con la formulación a base de formiato.
La Tabla 2 compara la resistencia superficial, la velocidad de desprendimiento umbral y el contenido de CaCO3 bioinducido de suelos tratados con vías MICP de degradación de urea y no degradación de urea en estudios previos y en este estudio. Los estudios sobre la resistencia a la erosión eólica de muestras de dunas tratadas con MICP son limitados. Meng et al. investigaron la resistencia a la erosión eólica de muestras de dunas de degradación de urea tratadas con MICP utilizando un soplador de hojas,13 mientras que en este estudio, las muestras de dunas no degradantes de urea (así como los controles de degradación de urea) se probaron en un túnel de viento y se trataron con cuatro combinaciones diferentes de bacterias y sustancias.
Como se puede observar, algunos estudios previos han considerado altas tasas de aplicación que superan los 4 L/m213,41,74. Cabe destacar que las altas tasas de aplicación pueden no ser fácilmente aplicables en el campo desde un punto de vista económico debido a los costos asociados con el suministro de agua, el transporte y la aplicación de grandes volúmenes de agua. Tasas de aplicación más bajas, como 1,62-2 L/m2, también lograron resistencias superficiales bastante buenas de hasta 190 kPa y TDV que superan los 25 m/s. En el presente estudio, las dunas tratadas con MICP a base de formato sin degradación de urea lograron altas resistencias superficiales que fueron comparables a las obtenidas con la vía de degradación de urea en el mismo rango de tasas de aplicación (es decir, las muestras tratadas con MICP a base de formato sin degradación de urea también pudieron lograr el mismo rango de valores de resistencia superficial que reportaron Meng et al., 13, Figura 13a) a tasas de aplicación más altas. También se puede observar que, con una tasa de aplicación de 2 L/m2, el rendimiento de carbonato de calcio para la mitigación de la erosión eólica a una velocidad del viento de 25 m/s fue del 2,25 % para el MICP a base de formato sin degradación de urea, lo que está muy cerca de la cantidad requerida de CaCO3 (es decir, 2,41 %) en comparación con las dunas tratadas con el MICP de control con degradación de urea a la misma tasa de aplicación y a la misma velocidad del viento (25 m/s).
Por lo tanto, se puede concluir de esta tabla que tanto la vía de degradación de urea como la vía de degradación sin urea pueden proporcionar un rendimiento bastante aceptable en términos de resistencia superficial y TDV. La principal diferencia es que la vía de degradación sin urea no contiene amoníaco y, por lo tanto, tiene un menor impacto ambiental. Además, el método MICP basado en formato sin degradación de urea propuesto en este estudio parece tener un mejor rendimiento que el método MICP basado en acetato sin degradación de urea. Aunque Mohebbi et al. estudiaron el método MICP basado en acetato sin degradación de urea, su estudio incluyó muestras en superficies planas9. Debido al mayor grado de erosión causado por la formación de remolinos alrededor de las muestras de dunas y el cizallamiento resultante, que da como resultado un TDV más bajo, se espera que la erosión eólica de las muestras de dunas sea más evidente que la de las superficies planas a la misma velocidad.