El artículo forma parte del tema de investigación “Mejora de la resistencia de las leguminosas a patógenos y plagas”, ver los 5 artículos
El agente causal de la necrosis fúngica de las plantas, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, utiliza una estrategia de múltiples niveles para infectar diferentes plantas hospedantes. Este estudio propone el uso de la diamina L-ornitina, un aminoácido no proteico que estimula la síntesis de otros aminoácidos esenciales, como una estrategia de manejo alternativa para mejorar las respuestas moleculares, fisiológicas y bioquímicas de Phaseolus vulgaris L. al moho blanco causado por Pseudomonas sclerotiorum. Los experimentos in vitro mostraron que la L-ornitina inhibió significativamente el crecimiento micelial de S. pyrenoidosa de manera dosis-dependiente. Además, podría reducir significativamente la severidad del moho blanco bajo condiciones de invernadero. Además, la L-ornitina estimuló el crecimiento de las plantas tratadas, lo que indica que las concentraciones probadas de L-ornitina no fueron fitotóxicas para las plantas tratadas. Además, la L-ornitina mejoró la expresión de antioxidantes no enzimáticos (fenólicos solubles totales y flavonoides) y antioxidantes enzimáticos (catalasa (CAT), peroxidasa (POX) y polifenol oxidasa (PPO)), y aumentó la expresión de tres genes relacionados con antioxidantes (PvCAT1, PvSOD y PvGR). Además, el análisis in silico reveló la presencia de una proteína putativa oxaloacetato acetilhidrolasa (SsOAH) en el genoma de S. sclerotiorum, que era muy similar a las proteínas oxaloacetato acetilhidrolasa (SsOAH) de Aspergillus fijiensis (AfOAH) y Penicillium sp. (PlOAH) en términos de análisis funcional, dominios conservados y topología. Curiosamente, la adición de L-ornitina al medio de caldo de papa dextrosa (PDB) disminuyó significativamente la expresión del gen SsOAH en el micelio de S. sclerotiorum. De igual manera, la aplicación exógena de L-ornitina disminuyó significativamente la expresión del gen SsOAH en el micelio fúngico recolectado de plantas tratadas. Finalmente, la aplicación de L-ornitina disminuyó significativamente la secreción de ácido oxálico tanto en el medio PDB como en las hojas infectadas. En conclusión, la L-ornitina desempeña un papel clave en el mantenimiento del estado redox, así como en la mejora de la respuesta de defensa de las plantas infectadas. Los resultados de este estudio pueden ayudar al desarrollo de métodos innovadores y respetuosos con el medio ambiente para controlar el moho blanco y mitigar su impacto en la producción de frijol y otros cultivos.
El moho blanco, causado por el hongo necrotrófico Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, es una enfermedad devastadora que reduce el rendimiento y representa una seria amenaza para la producción mundial de frijol (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum es uno de los patógenos fúngicos transmitidos por el suelo más difíciles de controlar, con una amplia gama de huéspedes de más de 600 especies de plantas y la capacidad de macerar rápidamente los tejidos del huésped de una manera no específica (Liang y Rollins, 2018). En condiciones desfavorables, atraviesa una fase crítica de su ciclo de vida, permaneciendo latente durante largos períodos de tiempo como estructuras negras, duras y similares a semillas llamadas 'esclerocios' en el suelo o como crecimientos blancos y esponjosos en el micelio o la médula del tallo de las plantas infectadas (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum es capaz de formar esclerocios, lo que le permite sobrevivir en campos infectados durante largos periodos y persistir durante la enfermedad (Schwartz et al., 2005). Los esclerocios son ricos en nutrientes, pueden persistir en el suelo durante largos periodos y sirven como inóculo primario para infecciones posteriores (Schwartz et al., 2005). En condiciones favorables, los esclerocios germinan y producen esporas aerotransportadas que pueden infectar todas las partes aéreas de la planta, incluyendo, entre otras, flores, tallos o vainas (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum utiliza una estrategia multinivel para infectar a sus plantas hospedantes, que implica una serie de eventos coordinados desde la germinación de los esclerocios hasta el desarrollo de los síntomas. Inicialmente, S. sclerotiorum produce esporas suspendidas (llamadas ascosporas) a partir de estructuras similares a hongos llamadas apotecios, que se dispersan por el aire y se convierten en esclerocios inmóviles en los restos vegetales infectados (Bolton et al., 2006). Posteriormente, el hongo secreta ácido oxálico, un factor de virulencia, para controlar el pH de la pared celular vegetal, promover la degradación enzimática y la invasión tisular (Hegedus y Rimmer, 2005) y suprimir el estallido oxidativo de la planta hospedante. Este proceso de acidificación debilita la pared celular vegetal, proporcionando un entorno favorable para el funcionamiento normal y eficiente de las enzimas degradadoras de la pared celular fúngica (EDC), lo que permite al patógeno superar la barrera física y penetrar en los tejidos del hospedante (Marciano et al., 1983). Una vez penetrado, S. sclerotiorum secreta diversas CWDE, como poligalacturonasa y celulasa, que facilitan su diseminación en los tejidos infectados y causan necrosis tisular. La progresión de las lesiones y los tapetes hifales provoca los síntomas característicos del moho blanco (Hegedus y Rimmer, 2005). Mientras tanto, las plantas hospedantes reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) a través de receptores de reconocimiento de patrones (PRR), lo que desencadena una serie de eventos de señalización que, en última instancia, activan las respuestas de defensa.
A pesar de décadas de esfuerzos para controlar enfermedades, persiste la escasez de germoplasma resistente adecuado en el frijol, al igual que en otros cultivos comerciales, debido a la resistencia, supervivencia y adaptabilidad del patógeno. Por lo tanto, el manejo de enfermedades es extremadamente complejo y requiere una estrategia integral y multifacética que incluya una combinación de prácticas culturales, control biológico y fungicidas químicos (O'Sullivan et al., 2021). El control químico del moho blanco es el más efectivo porque los fungicidas, cuando se aplican correctamente y en el momento oportuno, pueden controlar eficazmente la propagación de la enfermedad, reducir la gravedad de la infección y minimizar las pérdidas de rendimiento. Sin embargo, el uso excesivo y la dependencia excesiva de fungicidas pueden provocar la aparición de cepas resistentes de S. sclerotiorum y afectar negativamente a organismos no objetivo, la salud del suelo y la calidad del agua (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Por lo tanto, encontrar alternativas respetuosas con el medio ambiente se ha convertido en una prioridad absoluta.
Las poliaminas (PA), como la putrescina, la espermidina, la espermina y la cadaverina, pueden constituir alternativas prometedoras contra los patógenos vegetales transmitidos por el suelo, reduciendo así total o parcialmente el uso de fungicidas químicos peligrosos (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). En las plantas superiores, las PA participan en numerosos procesos fisiológicos, como la división celular, la diferenciación y la respuesta al estrés abiótico y biótico (Killiny y Nehela, 2020). Pueden actuar como antioxidantes, ayudar a eliminar las especies reactivas de oxígeno (ROS), mantener la homeostasis redox (Nehela y Killiny, 2023), inducir genes relacionados con la defensa (Romero et al., 2018), regular varias vías metabólicas (Nehela y Killiny, 2023), modular las fitohormonas endógenas (Nehela y Killiny, 2019), establecer resistencia sistémica adquirida (SAR) y regular las interacciones planta-patógeno (Nehela y Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Cabe señalar que los mecanismos y funciones específicos de los AP en la defensa de las plantas varían según la especie vegetal, los patógenos y las condiciones ambientales. El AP más abundante en las plantas se biosintetiza a partir de la poliamina esencial L-ornitina (Killiny y Nehela, 2020).
La L-ornitina desempeña múltiples funciones en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Por ejemplo, estudios previos han demostrado que en el arroz (Oryza sativa), la ornitina puede estar asociada con el reciclaje de nitrógeno (Liu et al., 2018), el rendimiento, la calidad y el aroma del arroz (Lu et al., 2020) y la respuesta al estrés hídrico (Yang et al., 2000). Además, la aplicación exógena de L-ornitina mejoró significativamente la tolerancia a la sequía en la remolacha azucarera (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) y alivió el estrés salino en las plantas de cebolla (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu y Çavuşoǧlu, 2021) y anacardo (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). El posible papel de la L-ornitina en la defensa contra el estrés abiótico podría deberse a su participación en la acumulación de prolina en las plantas tratadas. Por ejemplo, se ha informado previamente que los genes relacionados con el metabolismo de la prolina, como los genes de la ornitina delta aminotransferasa (delta-OAT) y la prolina deshidrogenasa (ProDH1 y ProDH2), están involucrados en la defensa de Nicotiana benthamiana y Arabidopsis thaliana contra cepas de Pseudomonas syringae no hospedantes (Senthil-Kumar y Mysore, 2012). Por otro lado, la ornitina descarboxilasa fúngica (ODC) es necesaria para el crecimiento de patógenos (Singh et al., 2020). La focalización de la ODC de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici mediante silenciamiento génico inducido por el hospedante (HIGS) mejoró significativamente la resistencia de las plantas de tomate al marchitamiento por Fusarium (Singh et al., 2020). Sin embargo, el papel potencial de la aplicación exógena de ornitina contra estreses bióticos como los fitopatógenos no se ha estudiado en profundidad. Más importante aún, los efectos de la ornitina sobre la resistencia a las enfermedades y los fenómenos bioquímicos y fisiológicos asociados siguen en gran medida sin explorar.
Comprender la complejidad de la infección de leguminosas por S. sclerotiorum es fundamental para el desarrollo de estrategias de control eficaces. En este estudio, nos propusimos identificar el posible papel de la diamina L-ornitina como factor clave para mejorar los mecanismos de defensa y la resistencia de las leguminosas a la infección por S. sclerotiorum. Nuestra hipótesis es que, además de mejorar las respuestas de defensa de las plantas infectadas, la L-ornitina también desempeña un papel clave en el mantenimiento del estado redox. Proponemos que los posibles efectos de la L-ornitina se relacionan con la regulación de los mecanismos de defensa antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos y con la interferencia con los factores de patogenicidad/virulencia fúngica y las proteínas asociadas. Esta doble funcionalidad de la L-ornitina la convierte en una candidata prometedora para una estrategia sostenible que mitigue el impacto del moho blanco y mejore la resistencia de los cultivos de leguminosas comunes a este potente patógeno fúngico. Los resultados del presente estudio podrían contribuir al desarrollo de métodos innovadores y respetuosos con el medio ambiente para controlar el moho blanco y mitigar su impacto en la producción de leguminosas.
En este estudio, se utilizó una variedad comercial susceptible de frijol común, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), como material experimental. Semillas sanas fueron amablemente proporcionadas por el Departamento de Investigación de Legumbres, Instituto de Investigación de Cultivos de Campo (FCRI), Centro de Investigación Agrícola (ARC), Egipto. Cinco semillas se sembraron en macetas de plástico (diámetro interior 35 cm, profundidad 50 cm) llenas de suelo infectado con S. sclerotiorum en condiciones de invernadero (25 ± 2 °C, humedad relativa 75 ± 1%, 8 h de luz/16 h de oscuridad). A los 7-10 días después de la siembra (DPS), las plántulas se aclararon para dejar solo dos plántulas con crecimiento uniforme y tres hojas completamente expandidas en cada maceta. Todas las plantas en maceta se regaron una vez cada dos semanas y se fertilizaron mensualmente a la tasa recomendada para la variedad dada.
Para preparar una concentración de 500 mg/L de L-ornitinadiamina (también conocida como ácido (+)-(S)-2,5-diaminopentanoico; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania), primero se disolvieron 50 mg en 100 mL de agua destilada estéril. Luego, la solución madre se diluyó y se usó en experimentos posteriores. Brevemente, se probaron in vitro seis series de concentraciones de L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 y 125 mg/L). Además, se usó agua destilada estéril como control negativo (Mock) y el fungicida comercial “Rizolex-T” 50% polvo mojable (toclofos-metil 20% + tiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gobernación de Gharbia, Egipto) se usó como control positivo. El fungicida comercial “Rizolex-T” se probó in vitro en cinco concentraciones (2, 4, 6, 8 y 10 mg/L).
Se recogieron muestras de tallos y vainas de frijol común que mostraban síntomas típicos de moho blanco (tasa de infestación: 10-30%) de granjas comerciales. Aunque la mayoría de los materiales vegetales infectados se identificaron por especie/variedad (variedad comercial susceptible Giza 3), otros, especialmente los obtenidos de mercados locales, eran de especies desconocidas. Los materiales infectados recolectados se desinfectaron primero superficialmente con una solución de hipoclorito de sodio al 0,5% durante 3 minutos, luego se enjuagaron varias veces con agua destilada estéril y se secaron con papel de filtro estéril para eliminar el exceso de agua. Luego, los órganos infectados se cortaron en pequeños trozos del tejido medio (entre los tejidos sanos e infectados), se cultivaron en medio de agar de papa dextrosa (PDA) y se incubaron a 25 ± 2 °C con un ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad durante 5 días para estimular la formación de esclerocios. El método de la punta micelial también se utilizó para purificar aislados fúngicos de cultivos mixtos o contaminados. El aislado fúngico purificado se identificó inicialmente mediante sus características morfológicas de cultivo y posteriormente se confirmó que se trataba de S. sclerotiorum mediante características microscópicas. Finalmente, se analizó la patogenicidad de todos los aislados purificados en el cultivar de frijol común susceptible Giza 3 para cumplir con los postulados de Koch.
Además, el aislamiento más invasivo de S. sclerotiorum (aislado n.° 3) se confirmó mediante la secuenciación del espaciador transcrito interno (ITS), según lo descrito por White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. En resumen, los aislamientos se cultivaron en caldo de dextrosa de patata (PDB) y se incubaron a 25 ± 2 °C durante 5-7 días. A continuación, se recolectó el micelio fúngico, se filtró a través de una gasa, se lavó dos veces con agua estéril y se secó con papel de filtro estéril. El ADN genómico se aisló utilizando el kit Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). La región de ADNr ITS se amplificó entonces utilizando el par de cebadores específicos ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; tamaño esperado: 540 pb) ( Baturo-Ciesniewska et al., 2017 ). Los productos de PCR purificados se enviaron para secuenciación (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Las secuencias de ADNr ITS se secuenciaron bidireccionalmente utilizando el método de secuenciación de Sanger. Las secuencias de consulta ensambladas se compararon luego con los últimos datos en GenBank y el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) utilizando el software BLASTn. La secuencia de consulta se comparó con otras 20 cepas/aislamientos de S. sclerotiorum recuperados de los últimos datos en NCBI GenBank (Tabla Suplementaria S1) utilizando ClustalW en el Paquete de Análisis de Genética Evolutiva Molecular (MEGA-11; versión 11) (Kumar et al., 2024). El análisis evolutivo se realizó utilizando el método de máxima verosimilitud y el modelo general de sustitución de nucleótidos reversible en el tiempo (Nei y Kumar, 2000). Se muestra el árbol con la mayor verosimilitud logarítmica. El árbol inicial para la búsqueda heurística se selecciona eligiendo el árbol con la mayor verosimilitud logarítmica entre el árbol de unión de vecinos (NJ) (Kumar et al., 2024) y el árbol de máxima parsimonia (MP). El árbol NJ se construyó utilizando una matriz de distancias por pares calculada utilizando el modelo general reversible en el tiempo (Nei y Kumar, 2000).
La actividad antibacteriana de la L-ornitina y el bactericida “Rizolex-T” se determinó in vitro mediante el método de difusión en agar. Método: Tomar la cantidad apropiada de la solución madre de L-ornitina (500 mg/L) y mezclarla completamente con 10 ml del medio nutritivo PDA para preparar soluciones con concentraciones finales de 12,5, 25, 50, 75, 100 y 125 mg/L, respectivamente. Cinco concentraciones del fungicida “Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 y 10 mg/L) y agua destilada estéril se utilizaron como control. Después de que el medio se hubo solidificado, un tapón micelial recién preparado de cultivo de Sclerotinia sclerotiorum, de 4 mm de diámetro, se transfirió al centro de la placa Petri y se cultivó a 25±2°C hasta que el micelio cubrió toda la placa Petri de control, después de lo cual se registró el crecimiento del hongo. Calcule el porcentaje de inhibición del crecimiento radial de S. sclerotiorum utilizando la ecuación 1:
El experimento se repitió dos veces, con seis réplicas biológicas para cada grupo control/experimental y cinco macetas (dos plantas por maceta) para cada réplica biológica. Cada réplica biológica se analizó dos veces (dos réplicas técnicas) para garantizar la precisión, fiabilidad y reproducibilidad de los resultados experimentales. Además, se utilizó un análisis de regresión probit para calcular la concentración inhibitoria semimáxima (CI50) y la CI99 (Prentice, 1976).
Para evaluar el potencial de la L-ornitina en condiciones de invernadero, se realizaron dos experimentos consecutivos en macetas. Brevemente, las macetas se llenaron con suelo arcillo-arenoso esterilizado (3:1) y se inocularon con un cultivo recién preparado de S. sclerotiorum. Primero, el aislado más invasivo de S. sclerotiorum (aislamiento n.º 3) se cultivó cortando un esclerocio por la mitad, colocándolo boca abajo sobre un PDA e incubándolo a 25 °C en oscuridad constante (24 h) durante 4 días para estimular el crecimiento micelial. Luego, se tomaron cuatro tapones de agar de 5 mm de diámetro del borde delantero y se inocularon con 100 g de una mezcla estéril de salvado de trigo y arroz (1:1, v/v) y todos los matraces se incubaron a 25 ± 2 °C bajo un ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad durante 5 días para estimular la formación de esclerocios. El contenido de todos los matraces se mezcló completamente para asegurar la homogeneidad antes de agregar el suelo. Luego, se añadieron 100 g de la mezcla de salvado colonizador a cada maceta para asegurar una concentración constante de patógenos. Las macetas inoculadas se regaron para activar el crecimiento fúngico y se colocaron en invernadero durante 7 días.
Se sembraron cinco semillas de la variedad Giza 3 en cada maceta. En las macetas tratadas con L-ornitina y el fungicida Rizolex-T, las semillas esterilizadas se remojaron durante dos horas en una solución acuosa de ambos compuestos, con una concentración final de CI99 de aproximadamente 250 mg/L y 50 mg/L, respectivamente, y se secaron al aire durante una hora antes de la siembra. Por otro lado, las semillas se remojaron en agua destilada estéril como control negativo. Diez días después, antes del primer riego, se aclaró el follaje de las plántulas, dejando solo dos plántulas limpias en cada maceta. Además, para asegurar la infección con S. sclerotiorum, se cortaron tallos de frijol en la misma etapa de desarrollo (10 días) en dos puntos diferentes con un bisturí esterilizado y se colocaron aproximadamente 0,5 g de la mezcla de salvado colonizador en cada herida, seguido de una alta humedad para estimular la infección y el desarrollo de la enfermedad en todas las plantas inoculadas. Las plantas de control fueron heridas de manera similar y se colocó una cantidad igual (0,5 g) de mezcla de salvado estéril, no colonizado en la herida y se mantuvo bajo alta humedad para simular el ambiente para el desarrollo de la enfermedad y asegurar la consistencia entre los grupos de tratamiento.
Método de tratamiento: Las plántulas de frijol se regaron con 500 ml de una solución acuosa de L-ornitina (250 mg/l) o el fungicida Rizolex-T (50 mg/l) mediante riego del suelo, luego el tratamiento se repitió tres veces con un intervalo de 10 días. Los controles tratados con placebo se regaron con 500 ml de agua destilada estéril. Todos los tratamientos se llevaron a cabo en condiciones de invernadero (25 ± 2 °C, 75 ± 1 % de humedad relativa y un fotoperiodo de 8 h de luz/16 h de oscuridad). Todas las macetas se regaron quincenalmente y se trataron mensualmente con un fertilizante NPK balanceado (20-20-20, con 3,6 % de azufre y microelementos TE; Zain Seeds, Egipto) a una concentración de 3-4 g/l mediante pulverización foliar de acuerdo con las recomendaciones para la variedad específica y las instrucciones del fabricante. A menos que se indique lo contrario, se recolectaron hojas maduras completamente expandidas (segunda y tercera hoja desde arriba) de cada réplica biológica a las 72 h posteriores al tratamiento (hpt), se homogeneizaron, se agruparon y se almacenaron a -80 °C para análisis adicionales que incluyen, entre otros, localización histoquímica in situ de indicadores de estrés oxidativo, peroxidación lipídica, antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos y expresión genética.
La intensidad de la infección por moho blanco se evaluó semanalmente 21 días después de la inoculación (dpi) utilizando una escala del 1 al 9 (Tabla Suplementaria S2) basada en la escala de Petzoldt y Dickson (1996) modificada por Teran et al. (2006). Brevemente, se examinaron los tallos y ramas de las plantas de frijol comenzando en el punto de inoculación para seguir la progresión de las lesiones a lo largo de los entrenudos y nudos. Luego se midió la distancia de la lesión desde el punto de inoculación hasta el punto más alejado a lo largo del tallo o rama y se asignó una puntuación del 1 al 9 según la ubicación de la lesión, donde (1) indicaba ausencia de infección visible cerca del punto de inoculación y (2-9) indicaba un aumento gradual en el tamaño de la lesión y la progresión a lo largo de los nudos/entrenudos (Tabla Suplementaria S2). La intensidad de la infección por moho blanco se convirtió a porcentaje utilizando la fórmula 2:
Además, el área bajo la curva de progresión de la enfermedad (AUDPC) se calculó utilizando la fórmula (Shaner y Finney, 1977), que recientemente se adaptó para la podredumbre blanca del frijol común (Chauhan et al., 2020) utilizando la ecuación 3:
Donde Yi = severidad de la enfermedad en el momento ti, Yi+1 = severidad de la enfermedad en el siguiente momento ti+1, ti = tiempo de la primera medición (en días), ti+1 = tiempo de la siguiente medición (en días), n = número total de puntos de tiempo o de observación. Los parámetros de crecimiento de las plantas de frijol, incluyendo la altura de la planta (cm), el número de ramas por planta y el número de hojas por planta, se registraron semanalmente durante 21 días en todas las réplicas biológicas.
En cada réplica biológica, se recolectaron muestras de hojas (segunda y tercera hojas completamente desarrolladas desde la parte superior) el día 45 después del tratamiento (15 días después del último tratamiento). Cada réplica biológica consistió en cinco macetas (dos plantas por maceta). Aproximadamente 500 mg del tejido triturado se utilizaron para la extracción de pigmentos fotosintéticos (clorofila a, clorofila b y carotenoides) utilizando acetona al 80% a 4 °C en la oscuridad. Después de 24 h, las muestras se centrifugaron y se recolectó el sobrenadante para la determinación de clorofila a, clorofila b y contenidos de carotenoides colorimétricamente utilizando un espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japón) de acuerdo con el método de (Lichtenthaler, 1987) midiendo la absorbancia a tres longitudes de onda diferentes (A470, A646 y A663 nm). Finalmente, el contenido de pigmentos fotosintéticos se calculó utilizando las siguientes fórmulas 4-6 descritas por Lichtenthaler (1987).
A las 72 h post-tratamiento (hpt), se recolectaron hojas (segunda y tercera hojas completamente desarrolladas desde la parte superior) de cada réplica biológica para la localización histoquímica in situ del peróxido de hidrógeno (H2O2) y el anión superóxido (O2•−). Cada réplica biológica consistió en cinco macetas (dos plantas por maceta). Cada réplica biológica se analizó por duplicado (dos réplicas técnicas) para asegurar la precisión, confiabilidad y reproducibilidad del método. H2O2 y O2•− se determinaron utilizando 0.1% de 3,3′-diaminobenzidina (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania) o nitroazul de tetrazolio (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania), respectivamente, siguiendo los métodos descritos por Romero-Puertas et al. (2004) y Adam et al. (1989) con modificaciones menores. Para la localización histoquímica de H2O2 in situ, los foliolos se infiltraron al vacío con DAB al 0,1 % en tampón Tris 10 mM (pH 7,8) y luego se incubaron a temperatura ambiente en la luz durante 60 min. Los foliolos se blanquearon en TCA al 0,15 % (v/v) en etanol:cloroformo 4:1 (v/v) (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, El Cairo, Egipto) y luego se expusieron a la luz hasta que se oscurecieron. De forma similar, las válvulas se infiltraron al vacío con tampón de fosfato de potasio 10 mM (pH 7,8) que contenía HBT al 0,1 % p/v para la localización histoquímica de O2•− in situ. Los foliolos se incubaron en la luz a temperatura ambiente durante 20 min, luego se blanquearon como se indicó anteriormente y finalmente se iluminaron hasta que aparecieron manchas azul oscuro/violeta. La intensidad del color marrón resultante (como indicador de H2O2) o azul violeta (como indicador de O2•−) se evaluó utilizando la versión Fiji del paquete de procesamiento de imágenes ImageJ (http://fiji.sc; consultado el 7 de marzo de 2024).
El malondialdehído (MDA; como marcador de peroxidación lipídica) se determinó según el método de Du y Bramlage (1992) con ligeras modificaciones. Se recolectaron hojas de cada réplica biológica (segunda y tercera hojas completamente desarrolladas desde la parte superior) 72 h después del tratamiento (hpt). Cada réplica biológica incluyó cinco macetas (dos plantas por maceta). Cada réplica biológica se analizó por duplicado (dos réplicas técnicas) para garantizar la precisión, fiabilidad y reproducibilidad del método. Brevemente, se utilizaron 0,5 g de tejido foliar molido para la extracción de MDA con ácido tricloroacético al 20 % (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, EE. UU.) que contenía 0,01 % de butilhidroxitolueno (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.). Luego se determinó colorimétricamente el contenido de MDA en el sobrenadante midiendo la absorbancia a 532 y 600 nm usando un espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japón) y luego se expresó como nmol g−1 FW.
Para la evaluación de antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos, se recolectaron hojas (la segunda y la tercera hojas completamente desarrolladas desde la parte superior) de cada réplica biológica a las 72 h postratamiento (hpt). Cada réplica biológica consistió en cinco macetas (dos plantas por maceta). Cada muestra biológica se analizó por duplicado (dos muestras técnicas). Dos hojas se molieron con nitrógeno líquido y se utilizaron directamente para la determinación de antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos, aminoácidos totales, contenido de prolina, expresión génica y cuantificación de oxalato.
Los fenólicos solubles totales se determinaron utilizando el reactivo de Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) con ligeras modificaciones del método descrito por Kahkonen et al. (1999). Brevemente, aproximadamente 0,1 g de tejido foliar homogeneizado se extrajeron con 20 ml de metanol al 80 % en oscuridad durante 24 h y el sobrenadante se recogió después de la centrifugación. 0,1 ml del extracto de muestra se mezclaron con 0,5 ml de reactivo de Folin-Ciocalteu (10 %), se agitaron durante 30 s y se dejaron en oscuridad durante 5 min. Luego, se añadieron 0,5 ml de solución de carbonato de sodio al 20 % (Na₂CO₃; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, El Cairo, Egipto) a cada tubo, se mezcló bien y se incubó a temperatura ambiente en oscuridad durante 1 h. Tras la incubación, se midió la absorbancia de la mezcla de reacción a 765 nm con un espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japón). La concentración de fenoles solubles totales en los extractos de muestra se determinó mediante una curva de calibración de ácido gálico (Fisher Scientific, Hampton, NH, EE. UU.) y se expresó en miligramos de ácido gálico equivalente por gramo de peso fresco (mg GAE g-1 de peso fresco).
El contenido total de flavonoides solubles se determinó según el método de Djeridane et al. (2006) con ligeras modificaciones. Brevemente, 0,3 ml del extracto metanólico anterior se mezclaron con 0,3 ml de solución de cloruro de aluminio al 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, EE. UU.), se agitó vigorosamente y luego se incubó a temperatura ambiente durante 5 min, seguido de la adición de 0,3 ml de solución de acetato de potasio al 10% (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, El Cairo, Egipto), se mezcló completamente y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad. Después de la incubación, la absorbancia de la mezcla de reacción se midió a 430 nm utilizando un espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japón). La concentración de flavonoides solubles totales en extractos de muestra se determinó utilizando una curva de calibración de rutina (TCI America, Portland, OR, EE. UU.) y luego se expresó como miligramos de equivalente de rutina por gramo de peso fresco (mg RE g-1 de peso fresco).
El contenido total de aminoácidos libres de las hojas de frijol se determinó utilizando un reactivo de ninhidrina modificado (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, EE. UU.) basado en el método propuesto por Yokoyama e Hiramatsu (2003) y modificado por Sun et al. (2006). Brevemente, se extrajeron 0,1 g de tejido molido con un tampón de pH 5,4 y 200 μL del sobrenadante se hicieron reaccionar con 200 μL de ninhidrina (2%) y 200 μL de piridina (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, EE. UU.), se incubaron en un baño de agua hirviendo durante 30 min, luego se enfriaron y se midieron a 580 nm utilizando un espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japón). Por otro lado, la prolina se determinó mediante el método de Bates (Bates et al., 1973). La prolina se extrajo con ácido sulfosalicílico al 3 % (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, EE. UU.) y, tras la centrifugación, se mezclaron 0,5 ml del sobrenadante con 1 ml de ácido acético glacial (Fisher Scientific, Hampton, NH, EE. UU.) y reactivo de ninhidrina. Se incubó a 90 °C durante 45 min, se enfrió y se midió a 520 nm con el mismo espectrofotómetro mencionado anteriormente. Los aminoácidos libres totales y la prolina en los extractos de hojas se determinaron mediante curvas de calibración de glicina y prolina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.), respectivamente, y se expresaron en mg/g de peso fresco.
Para determinar la actividad enzimática de las enzimas antioxidantes, se extrajeron aproximadamente 500 mg de tejido homogeneizado con 3 ml de tampón Tris 50 mM (pH 7,8) que contenía 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) y 7,5 % de polivinilpirrolidona (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.), se centrifugaron a 10 000 × g durante 20 min en refrigeración (4 °C) y se recogió el sobrenadante (extracto crudo de enzima) (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). La catalasa (CAT) se hizo reaccionar con 2 ml de solución tampón de fosfato de sodio 0,1 M (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) y 100 μl de solución de H₂O₂ 269 mM para determinar su actividad enzimática según el método de Aebi (1984) con ligeras modificaciones (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). La actividad enzimática de la peroxidasa dependiente de guayacol (POX) se determinó mediante el método de Harrach et al. (2009). (2008) con modificaciones menores (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) y la actividad enzimática de la polifenol oxidasa (PPO) se determinó después de la reacción con 2,2 ml de tampón de fosfato de sodio 100 mM (pH 6,0), 100 μl de guayacol (TCI chemicals, Portland, OR, EE. UU.) y 100 μl de H₂O₂ 12 mM. El método fue ligeramente modificado de (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). El ensayo se realizó después de la reacción con 3 ml de solución de catecol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, EE. UU.) (0,01 M) recién preparada en tampón de fosfato 0,1 M (pH 6,0). La actividad de CAT se midió monitoreando la descomposición de H2O2 a 240 nm (A240), la actividad de POX se midió monitoreando el aumento en la absorbancia a 436 nm (A436) y la actividad de PPO se midió registrando las fluctuaciones de absorbancia a 495 nm (A495) cada 30 s durante 3 min usando un espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu, Japón).
Se utilizó RT-PCR en tiempo real para detectar los niveles de transcripción de tres genes relacionados con antioxidantes, incluyendo la catalasa peroxisomal (PvCAT1; N.º de acceso en GenBank: KF033307.1), la superóxido dismutasa (PvSOD; N.º de acceso en GenBank: XM_068639556.1) y la glutatión reductasa (PvGR; N.º de acceso en GenBank: KY195009.1), en hojas de frijol (la segunda y la tercera hojas completamente desarrolladas desde la parte superior) 72 h después del último tratamiento. Brevemente, se aisló el ARN utilizando el kit de extracción de ARN total Simply P (N.º de cat. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) de acuerdo con el protocolo del fabricante. A continuación, se sintetizó el ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc TOP script™ de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de cebadores de los tres genes mencionados se enumeran en la Tabla Suplementaria S3. Se utilizó PvActin-3 (número de acceso a GenBank: XM_068616709.1) como gen constitutivo y la expresión génica relativa se calculó mediante el método 2-ΔΔCT (Livak y Schmittgen, 2001). Se demostró la estabilidad de la actina bajo estrés biótico (interacción incompatible entre leguminosas comunes y el hongo de la antracnosis Colletotrichum lindemuthianum) y abiótico (sequía, salinidad, bajas temperaturas) (Borges et al., 2012).
Inicialmente, realizamos un análisis in silico de todo el genoma de las proteínas oxaloacetato acetilhidrolasa (OAH) en S. sclerotiorum utilizando la herramienta proteína-proteína BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Brevemente, utilizamos OAH de Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxida: 1191702; número de acceso en GenBank XP_040799428.1; 342 aminoácidos) y Penicillium lagena (PlOAH; taxida: 94218; número de acceso en GenBank XP_056833920.1; 316 aminoácidos) como secuencias de consulta para mapear la proteína homóloga en S. sclerotiorum (taxida: 5180). BLASTp se realizó contra los datos del genoma de S. sclerotiorum más recientes disponibles en GenBank en el sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Además, el gen OAH predicho de S. sclerotiorum (SsOAH) y el análisis evolutivo y el árbol filogenético de AfOAH de A. fijiensis CBS 313.89 y PlOAH de P. lagena se infirieron utilizando el método de máxima verosimilitud en MEGA11 (Tamura et al., 2021) y el modelo basado en la matriz JTT (Jones et al., 1992). El árbol filogenético se combinó con el análisis de alineamiento múltiple de las secuencias proteicas de todos los genes OAH predichos (SsOAH) de S. sclerotiorum y la secuencia de consulta utilizando la herramienta de alineamiento basado en restricciones (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos y Agarwala, 2007). Además, las secuencias de aminoácidos más coincidentes de SsOAH de S. sclerotiorum se alinearon con las secuencias de consulta (AfOAH y PlOAH) (Larkin et al., 2007) utilizando ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), y las regiones conservadas en la alineación se visualizaron utilizando la herramienta ESPript (versión 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Además, los dominios representativos funcionales previstos y los sitios conservados de la SsOAH de S. sclerotiorum se clasificaron interactivamente en diferentes familias mediante la herramienta InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Finalmente, se realizó un modelado estructural tridimensional (3D) de la SsOAH prevista de S. sclerotiorum mediante el motor de reconocimiento de homología/analogía de proteínas (servidor Phyre2 versión 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) y se validó mediante el servidor SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Las estructuras tridimensionales previstas (formato PDB) se visualizaron de forma interactiva utilizando el paquete UCSF-Chimera (versión 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004).
Se utilizó PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real para determinar el nivel transcripcional de oxaloacetato acetilhidrolasa (SsOAH; número de acceso de GenBank: XM_001590428.1) en el micelio de Sclerotinia sclerotiorum. Brevemente, S. sclerotiorum se inoculó en un matraz con PDB y se colocó en una incubadora con agitación (modelo: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, EE. UU.) a 25 ± 2 °C durante 24 h a 150 rpm y en oscuridad constante (24 h) para estimular el crecimiento micelial. Posteriormente, las células se trataron con L-ornitina y el fungicida Rizolex-T a concentraciones finales de CI50 (aproximadamente 40 y 3,2 mg/L, respectivamente) y se cultivaron durante otras 24 h en las mismas condiciones. Tras la incubación, los cultivos se centrifugaron a 2500 rpm durante 5 min y se recolectó el sobrenadante (micelio fúngico) para el análisis de la expresión génica. De forma similar, se recolectó micelio fúngico a las 0, 24, 48, 72, 96 y 120 h postinfección de plantas infectadas que habían formado moho blanco y micelio algodonoso en la superficie de los tejidos infectados. Se extrajo ARN del micelio fúngico y luego se sintetizó ADNc como se describió anteriormente. Las secuencias de cebadores para SsOAH se listan en la Tabla Suplementaria S3. Se utilizó SsActin (número de acceso de GenBank: XM_001589919.1) como gen constitutivo, y la expresión génica relativa se calculó utilizando el método 2-ΔΔCT (Livak y Schmittgen, 2001).
El ácido oxálico se determinó en caldo de dextrosa de patata (PDB) y muestras de plantas que contenían el patógeno fúngico Sclerotinia sclerotiorum según el método de Xu y Zhang (2000) con ligeras modificaciones. Brevemente, los aislados de S. sclerotiorum se inocularon en matraces que contenían PDB y luego se cultivaron en una incubadora con agitación (modelo I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, EE. UU.) a 150 rpm a 25 ± 2 °C durante 3-5 días en oscuridad constante (24 h) para estimular el crecimiento micelial. Después de la incubación, el cultivo fúngico se filtró primero a través de papel de filtro Whatman n.º 1 y luego se centrifugó a 2500 rpm durante 5 min para eliminar el micelio residual. El sobrenadante se recolectó y almacenó a 4 °C para una posterior determinación cuantitativa de oxalato. Para la preparación de las muestras de plantas, se extrajeron aproximadamente 0,1 g de fragmentos de tejido vegetal tres veces con agua destilada (2 ml cada vez). Luego, las muestras se centrifugaron a 2500 rpm durante 5 minutos, el sobrenadante se filtró en seco a través de papel de filtro Whatman No. 1 y se recogió para su posterior análisis.
Para el análisis cuantitativo del ácido oxálico, la mezcla de reacción se preparó en un tubo con tapón de vidrio en el siguiente orden: 0,2 ml de muestra (o filtrado de cultivo de PDB o solución estándar de ácido oxálico), 0,11 ml de azul de bromofenol (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, EE. UU.), 0,198 ml de ácido sulfúrico 1 M (H₂SO₄; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, El Cairo, Egipto) y 0,176 ml de dicromato de potasio 100 mM (K₂Cr₂O₄; TCI chemicals, Portland, OR, EE. UU.). A continuación, la solución se diluyó a 4,8 ml con agua destilada, se mezcló vigorosamente y se colocó inmediatamente en un baño de agua a 60 °C. Después de 10 min, la reacción se detuvo añadiendo 0,5 ml de solución de hidróxido de sodio (NaOH; 0,75 M). La absorbancia (A600) de la mezcla de reacción se midió a 600 nm con un espectrofotómetro UV-160 (Shimadzu Corporation, Japón). Se utilizaron PDB y agua destilada como controles para la cuantificación de los filtrados de cultivo y las muestras de plantas, respectivamente. Las concentraciones de ácido oxálico en los filtrados de cultivo, expresadas como microgramos de ácido oxálico por mililitro de medio PDB (μg.mL−1), y en los extractos de hojas, expresadas como microgramos de ácido oxálico por gramo de peso fresco (μg.g−1 FW), se determinaron mediante una curva de calibración de ácido oxálico (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, EE. UU.).
A lo largo del estudio, todos los experimentos se diseñaron en un diseño completamente aleatorizado (CRD) con seis réplicas biológicas por tratamiento y cinco macetas por réplica biológica (dos plantas por maceta) a menos que se indique lo contrario. Las réplicas biológicas se analizaron por duplicado (dos réplicas técnicas). Las réplicas técnicas se utilizaron para comprobar la reproducibilidad del mismo experimento, pero no se utilizaron en el análisis estadístico para evitar réplicas falsas. Los datos se analizaron estadísticamente mediante análisis de varianza (ANOVA) seguido de la prueba de diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey-Kramer (p ≤ 0,05). Para los experimentos in vitro, los valores de CI50 e CI99 se calcularon utilizando el modelo probit y se calcularon intervalos de confianza del 95%.
Se recolectaron cuatro aislados de diferentes campos de soja en la Gobernación de El Ghabiya, Egipto. En medio PDA, todos los aislados produjeron micelio blanco cremoso que rápidamente se tornó blanco algodonoso (Figura 1A) y luego beige o marrón en la etapa de esclerocio. Los esclerocios suelen ser densos, negros, esféricos o de forma irregular, de 5,2 a 7,7 mm de largo y 3,4 a 5,3 mm de diámetro (Figura 1B). Aunque cuatro aislados desarrollaron un patrón marginal de esclerocios en el borde del medio de cultivo después de 10-12 días de incubación a 25 ± 2 °C (Fig. 1A), el número de esclerocios por placa fue significativamente diferente entre ellos (P < 0,001), siendo el aislado 3 el que presentó el mayor número de esclerocios (32,33 ± 1,53 esclerocios por placa; Fig. 1C). De forma similar, el aislado n.° 3 produjo más ácido oxálico en PDB que otros aislados (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Fig. 1D). El aislado n.° 3 mostró características morfológicas y microscópicas típicas del hongo fitopatógeno Sclerotinia sclerotiorum. Por ejemplo, en PDA, las colonias del aislado n.° 3 crecieron rápidamente, fueron de color blanco cremoso (Figura 1A), beige inverso o marrón amarillento salmón claro, y requirieron de 6 a 7 días a 25 ± 2 °C para cubrir completamente la superficie de una placa de 9 cm de diámetro. Con base en las características morfológicas y microscópicas anteriores, el aislado n.° 3 se identificó como Sclerotinia sclerotiorum.
Figura 1. Características y patogenicidad de aislados de S. sclerotiorum de cultivos de leguminosas comunes. (A) Crecimiento micelial de cuatro aislados de S. sclerotiorum en medio PDA, (B) esclerocios de cuatro aislados de S. sclerotiorum, (C) número de esclerocios (por placa), (D) secreción de ácido oxálico en medio PDB (μg.mL−1), y (E) severidad de la enfermedad (%) de cuatro aislados de S. sclerotiorum en el cultivar de leguminosa comercial susceptible Giza 3 bajo condiciones de invernadero. Los valores representan la media ± DE de cinco réplicas biológicas (n = 5). Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos (p < 0,05). (F–H) Los síntomas típicos de moho blanco aparecieron en tallos aéreos y silicuas, respectivamente, 10 días después de la inoculación con el aislado #3 (dpi). (I) Se realizó un análisis evolutivo de la región del espaciador transcrito interno (ITS) del aislado n.° 3 de S. sclerotiorum mediante el método de máxima verosimilitud y se comparó con 20 aislados/cepas de referencia obtenidos de la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Los números sobre las líneas de agrupamiento indican la cobertura de la región (%) y los números debajo de ellas, la longitud de la ramificación.
Además, para confirmar la patogenicidad, se utilizaron cuatro aislados de S. sclerotiorum obtenidos para inocular el cultivar comercial de frijol susceptible Giza 3 en condiciones de invernadero, lo cual es consistente con los postulados de Koch (Fig. 1E). Aunque todos los aislados fúngicos obtenidos fueron patógenos y pudieron infectar el frijol verde (cv. Giza 3), causando síntomas típicos de moho blanco en todas las partes aéreas (Fig. 1F), especialmente en los tallos (Fig. 1G) y las vainas (Fig. 1H) a los 10 días posteriores a la inoculación (dpi), el aislado 3 fue el aislado más agresivo en dos experimentos independientes. El aislado 3 tuvo la mayor severidad de la enfermedad (%) en plantas de frijol (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0 y 76.7 ± 3.1 a los 7, 14 y 21 días posteriores a la infección, respectivamente; Figura 1F).
La identificación del aislado #3 de S. sclerotiorum más invasivo se confirmó además mediante la secuenciación del espaciador transcrito interno (ITS) (Fig. 1I). El análisis filogenético entre el aislado #3 y 20 aislados/cepas de referencia mostró una alta similitud (>99%) entre ellos. Cabe destacar que el aislado #3 de S. sclerotiorum (533 pb) tiene una alta similitud con el aislado LPM36 de S. sclerotiorum estadounidense aislado de semillas de guisante seco (número de acceso en GenBank MK896659.1; 540 pb) y el aislado YKY211 de S. sclerotiorum chino (número de acceso en GenBank OR206374.1; 548 pb), que causa la pudrición del tallo violeta (Matthiola incana), todos los cuales se agrupan por separado en la parte superior del dendrograma (Figura 1I). La nueva secuencia se ha depositado en la base de datos del NCBI y se ha denominado «Sclerotinia sclerotiorum – aislado YN-25» (número de acceso a GenBank PV202792). Como se puede observar, el aislado 3 es el más invasivo; por lo tanto, se seleccionó para el estudio en todos los experimentos posteriores.
Se investigó in vitro la actividad antibacteriana de la diamina L-ornitina (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania) a diferentes concentraciones (12,5, 25, 50, 75, 100 y 125 mg/L) contra el aislado 3 de S. sclerotiorum. Cabe destacar que la L-ornitina ejerció un efecto antibacteriano e inhibió gradualmente el crecimiento radial de las hifas de S. sclerotiorum de manera dependiente de la dosis (Figura 2A, B). A la concentración más alta probada (125 mg/L), la L-ornitina demostró la mayor tasa de inhibición del crecimiento micelial (99,62 ± 0,27%; Figura 2B), que fue equivalente al fungicida comercial Rizolex-T (tasa de inhibición 99,45 ± 0,39%; Figura 2C) a la concentración más alta probada (10 mg/L), lo que indica una eficacia similar.
Figura 2. Actividad antibacteriana in vitro de L-ornitina contra Sclerotinia sclerotiorum. (A) Comparación de la actividad antibacteriana de diferentes concentraciones de L-ornitina contra S. sclerotiorum con el fungicida comercial Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Tasa de inhibición (%) del crecimiento micelial de S. sclerotiorum después del tratamiento con diferentes concentraciones de L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 y 125 mg/L) o Rizolex-T (2, 4, 6, 8 y 10 mg/L), respectivamente. Los valores representan la media ± DE de cinco réplicas biológicas (n = 5). Las letras diferentes denotan diferencias estadísticas entre tratamientos (p < 0,05). (D, E) Análisis de regresión del modelo Probit de L-ornitina y fungicida comercial Rizolex-T, respectivamente. La línea de regresión del modelo probit se muestra como una línea azul sólida y el intervalo de confianza (95%) se muestra como una línea roja discontinua.
Además, se realizó un análisis de regresión probit y los gráficos correspondientes se muestran en la Tabla 1 y las Figuras 2D, E. Brevemente, el valor de pendiente aceptable (y = 2,92x − 4,67) y las estadísticas significativas asociadas (Cox y Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 y p < 0,0001; Figura 2D) de L-ornitina indicaron una actividad antifúngica mejorada contra S. sclerotiorum en comparación con el fungicida comercial Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox y Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 y p < 0,0001) (Tabla 1).
Tabla 1. Valores de concentración inhibitoria media máxima (CI50) y CI99 (mg/l) de L-ornitina y fungicida comercial “Rizolex-T” frente a S. sclerotiorum.
En general, la L-ornitina (250 mg/L) redujo significativamente el desarrollo y la gravedad del moho blanco en plantas de frijol común tratadas, en comparación con las plantas infectadas con S. sclerotiorum no tratadas (control; Figura 3A). En resumen, aunque la gravedad de la enfermedad en las plantas de control infectadas no tratadas aumentó gradualmente (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 y 92,33 ± 3,06%), la L-ornitina redujo significativamente la gravedad de la enfermedad (%) a lo largo del experimento (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 y 26,36 ± 3,07) a los 7, 14 y 21 días postratamiento (dpt), respectivamente (Figura 3A). De manera similar, cuando las plantas de frijol infectadas con S. sclerotiorum se trataron con 250 mg/L de L-ornitina, el área bajo la curva de progresión de la enfermedad (AUDPC) disminuyó de 1274,33 ± 33,13 en el control sin tratamiento a 281,03 ± 7,95, ligeramente inferior al del control positivo con fungicida Rizolex-T de 50 mg/L (183,61 ± 7,71; Fig. 3B). La misma tendencia se observó en el segundo experimento.
Fig. 3. Efecto de la aplicación exógena de L-ornitina sobre el desarrollo de la podredumbre blanca del frijol común causada por Sclerotinia sclerotiorum en invernadero. (A) Curva de progresión de la enfermedad del moho blanco del frijol común tras el tratamiento con 250 mg/L de L-ornitina. (B) Área bajo la curva de progresión de la enfermedad (AUDPC) del moho blanco del frijol común tras el tratamiento con L-ornitina. Los valores representan la media ± DE de cinco réplicas biológicas (n = 5). Las letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos (p < 0,05).
La aplicación exógena de 250 mg/L de L-ornitina incrementó gradualmente la altura de la planta (Fig. 4A), el número de ramas por planta (Fig. 4B) y el número de hojas por planta (Fig. 4C) después de 42 días. Si bien el fungicida comercial Rizolex-T (50 mg/L) tuvo el mayor efecto en todos los parámetros nutricionales estudiados, la aplicación exógena de 250 mg/L de L-ornitina tuvo el segundo mayor efecto en comparación con los controles sin tratamiento (Figs. 4A-C). Por otro lado, el tratamiento con L-ornitina no tuvo un efecto significativo en el contenido de los pigmentos fotosintéticos clorofila a (Fig. 4D) y clorofila b (Fig. 4E), pero aumentó ligeramente el contenido total de carotenoides (0,56 ± 0,03 mg/g peso neto) en comparación con el control negativo (0,44 ± 0,02 mg/g peso neto) y el control positivo (0,46 ± 0,02 mg/g peso neto; Fig. 4F). En general, estos resultados indican que la L-ornitina no es fitotóxica para las leguminosas tratadas e incluso puede estimular su crecimiento.
Fig. 4. Efecto de la aplicación exógena de L-ornitina sobre las características de crecimiento y pigmentos fotosintéticos de hojas de frijol infectadas con Sclerotinia sclerotiorum en invernadero. (A) Altura de la planta (cm), (B) Número de ramas por planta, (C) Número de hojas por planta, (D) Contenido de clorofila a (mg g-1 fr wt), (E) Contenido de clorofila b (mg g-1 fr wt), (F) Contenido total de carotenoides (mg g-1 fr wt). Los valores representan la media ± DE de cinco réplicas biológicas (n = 5). Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos (p < 0,05).
La localización histoquímica in situ de especies reactivas de oxígeno (ROS; expresadas como peróxido de hidrógeno [H2O2]) y radicales libres (expresados ​​como aniones superóxido [O2•−]) reveló que la aplicación exógena de L-ornitina (250 mg/L) redujo significativamente la acumulación de H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) y O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) en comparación con la acumulación de plantas infectadas no tratadas (173,31 ± 12,06 y 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW, respectivamente) y plantas tratadas con 50 mg/L del fungicida comercial Rizolex-T (170,12 ± 9,50 y 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt, respectivamente) a las 72 h. Se acumularon altos niveles de H₂O₂ y O₂₂ en condiciones de HPT (Fig. 5A, B). De forma similar, el ensayo de malondialdehído (MDA) basado en TCA mostró que las plantas de frijol infectadas con S. sclerotiorum acumularon mayores niveles de MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) en sus hojas (Fig. 5C). Sin embargo, la aplicación exógena de L-ornitina redujo significativamente la peroxidación lipídica, como lo demuestra la disminución del contenido de MDA en las plantas tratadas (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Fig. 5. Efecto de la aplicación de L-ornitina exógena sobre los principales marcadores de estrés oxidativo y mecanismos de defensa antioxidante no enzimáticos en hojas de frijol infectadas con S. sclerotiorum a las 72 h post-infección en condiciones de invernadero. (A) Peróxido de hidrógeno (H2O2; nmol g−1 FW) a 72 hpt, (B) anión superóxido (O2•−; nmol g−1 FW) a 72 hpt, (C) malondialdehído (MDA; nmol g−1 FW) a 72 hpt, (D) fenoles solubles totales (mg GAE g−1 FW) a 72 hpt, (E) flavonoides solubles totales (mg RE g−1 FW) a 72 hpt, (F) aminoácidos libres totales (mg g−1 FW) a 72 hpt, y (G) contenido de prolina (mg g−1 FW) a 72 hpt. Los valores representan la media ± desviación estándar (media ± DE) de 5 réplicas biológicas (n = 5). Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos (p < 0,05).