El artículo forma parte del tema de investigación “Mejora de la resistencia de las leguminosas a patógenos y plagas”. Ver los 5 artículos.
El agente causal de la necrosis fúngica de plantas, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, utiliza una estrategia de múltiples niveles para infectar diferentes plantas hospedantes. Este estudio propone el uso de la diamina L-ornitina, un aminoácido no proteico que estimula la síntesis de otros aminoácidos esenciales, como estrategia de manejo alternativa para mejorar las respuestas moleculares, fisiológicas y bioquímicas de Phaseolus vulgaris L. al moho blanco causado por Pseudomonas sclerotiorum. Los experimentos in vitro mostraron que la L-ornitina inhibió significativamente el crecimiento micelial de S. pyrenoidosa de manera dosis-dependiente. Además, pudo reducir significativamente la gravedad del moho blanco en condiciones de invernadero. Asimismo, la L-ornitina estimuló el crecimiento de las plantas tratadas, lo que indica que las concentraciones probadas de L-ornitina no fueron fitotóxicas para las plantas tratadas. Además, la L-ornitina potenció la expresión de antioxidantes no enzimáticos (fenoles y flavonoides solubles totales) y antioxidantes enzimáticos (catalasa (CAT), peroxidasa (POX) y polifenol oxidasa (PPO)), e incrementó la expresión de tres genes relacionados con antioxidantes (PvCAT1, PvSOD y PvGR). Asimismo, el análisis in silico reveló la presencia de una proteína oxalacetato acetilhidrolasa putativa (SsOAH) en el genoma de S. sclerotiorum, la cual era altamente similar a las proteínas oxalacetato acetilhidrolasa (SsOAH) de Aspergillus fijiensis (AfOAH) y Penicillium sp. (PlOAH) en términos de análisis funcional, dominios conservados y topología. Curiosamente, la adición de L-ornitina al medio de cultivo de caldo de patata y dextrosa (PDB) redujo significativamente la expresión del gen SsOAH en el micelio de S. sclerotiorum. De manera similar, la aplicación exógena de L-ornitina disminuyó significativamente la expresión del gen SsOAH en el micelio fúngico recolectado de plantas tratadas. Finalmente, la aplicación de L-ornitina redujo significativamente la secreción de ácido oxálico tanto en el medio PDB como en las hojas infectadas. En conclusión, la L-ornitina desempeña un papel clave en el mantenimiento del estado redox, así como en la mejora de la respuesta de defensa de las plantas infectadas. Los resultados de este estudio podrían contribuir al desarrollo de métodos innovadores y respetuosos con el medio ambiente para controlar el moho blanco y mitigar su impacto en la producción de frijol y otros cultivos.
El moho blanco, causado por el hongo necrotrófico Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, es una enfermedad devastadora que reduce el rendimiento y representa una seria amenaza para la producción mundial de frijol (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum es uno de los patógenos fúngicos de plantas transmitidos por el suelo más difíciles de controlar, con un amplio rango de hospedadores de más de 600 especies de plantas y la capacidad de macerar rápidamente los tejidos del hospedador de manera inespecífica (Liang y Rollins, 2018). En condiciones desfavorables, atraviesa una fase crítica de su ciclo de vida, permaneciendo latente durante largos períodos de tiempo como estructuras negras, duras y parecidas a semillas llamadas "esclerocios" en el suelo o como crecimientos blancos y algodonosos en el micelio o la médula del tallo de las plantas infectadas (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum es capaz de formar esclerocios, lo que le permite sobrevivir en campos infectados durante largos periodos y persistir durante la enfermedad (Schwartz et al., 2005). Los esclerocios son ricos en nutrientes, pueden persistir en el suelo durante largos periodos y sirven como inóculo primario para infecciones posteriores (Schwartz et al., 2005). En condiciones favorables, los esclerocios germinan y producen esporas aéreas que pueden infectar todas las partes aéreas de la planta, incluyendo, entre otras, flores, tallos y vainas (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum utiliza una estrategia de múltiples niveles para infectar a sus plantas hospedantes, que implica una serie de eventos coordinados desde la germinación de los esclerocios hasta el desarrollo de los síntomas. Inicialmente, S. sclerotiorum produce esporas suspendidas (llamadas ascosporas) a partir de estructuras similares a hongos llamadas apotecios, que se dispersan por el aire y se desarrollan en esclerocios inmóviles sobre los restos de plantas infectadas (Bolton et al., 2006). El hongo secreta ácido oxálico, un factor de virulencia, para controlar el pH de la pared celular de la planta, promover la degradación enzimática y la invasión de los tejidos (Hegedus y Rimmer, 2005), y suprimir el estallido oxidativo de la planta hospedante. Este proceso de acidificación debilita la pared celular de la planta, proporcionando un entorno favorable para el funcionamiento normal y eficiente de las enzimas degradadoras de la pared celular del hongo (CWDE), lo que permite al patógeno superar la barrera física y penetrar en los tejidos del hospedante (Marciano et al., 1983). Una vez que penetra en los tejidos, S. sclerotiorum secreta una serie de CWDE, como la poligalacturonasa y la celulasa, que facilitan su diseminación en los tejidos infectados y provocan necrosis tisular. La progresión de las lesiones y la formación de hifas dan lugar a los síntomas característicos del moho blanco (Hegedus y Rimmer, 2005). Mientras tanto, las plantas hospedantes reconocen los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) a través de receptores de reconocimiento de patrones (PRR), lo que desencadena una serie de eventos de señalización que, en última instancia, activan las respuestas de defensa.
A pesar de décadas de esfuerzos para el control de enfermedades, la escasez de germoplasma resistente adecuado persiste en el frijol, al igual que en otros cultivos comerciales, debido a la resistencia, supervivencia y adaptabilidad del patógeno. Por lo tanto, el manejo de la enfermedad es extremadamente complejo y requiere una estrategia integrada y multifacética que incluya una combinación de prácticas culturales, control biológico y fungicidas químicos (O'Sullivan et al., 2021). El control químico del moho blanco es el más efectivo porque los fungicidas, cuando se aplican correctamente y en el momento adecuado, pueden controlar eficazmente la propagación de la enfermedad, reducir la gravedad de la infección y minimizar las pérdidas de rendimiento. Sin embargo, el uso excesivo y la dependencia excesiva de fungicidas pueden conducir a la aparición de cepas resistentes de S. sclerotiorum y afectar negativamente a organismos no objetivo, la salud del suelo y la calidad del agua (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Por consiguiente, encontrar alternativas respetuosas con el medio ambiente se ha convertido en una prioridad.
Las poliaminas (PA), como la putrescina, la espermidina, la espermina y la cadaverina, pueden ser alternativas prometedoras contra los patógenos vegetales transmitidos por el suelo, reduciendo así total o parcialmente el uso de fungicidas químicos peligrosos (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). En las plantas superiores, las PA participan en numerosos procesos fisiológicos, entre los que se incluyen, pero no se limitan a, la división celular, la diferenciación y la respuesta a los estrés abióticos y bióticos (Killiny y Nehela, 2020). Pueden actuar como antioxidantes, ayudar a eliminar especies reactivas de oxígeno (ROS), mantener la homeostasis redox (Nehela y Killiny, 2023), inducir genes relacionados con la defensa (Romero et al., 2018), regular diversas vías metabólicas (Nehela y Killiny, 2023), modular fitohormonas endógenas (Nehela y Killiny, 2019), establecer resistencia sistémica adquirida (SAR) y regular las interacciones planta-patógeno (Nehela y Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Cabe destacar que los mecanismos y funciones específicos de las PA en la defensa de las plantas varían según la especie vegetal, los patógenos y las condiciones ambientales. La PA más abundante en las plantas se biosintetiza a partir de la poliamina esencial L-ornitina (Killiny y Nehela, 2020).
La L-ornitina desempeña múltiples funciones en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Por ejemplo, estudios previos han demostrado que en el arroz (Oryza sativa), la ornitina puede estar asociada con el reciclaje de nitrógeno (Liu et al., 2018), el rendimiento, la calidad y el aroma del arroz (Lu et al., 2020), y la respuesta al estrés hídrico (Yang et al., 2000). Además, la aplicación exógena de L-ornitina mejoró significativamente la tolerancia a la sequía en la remolacha azucarera (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) y alivió el estrés salino en plantas de cebolla (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu y Çavuşoǧlu, 2021) y anacardo (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). El papel potencial de la L-ornitina en la defensa contra el estrés abiótico puede deberse a su participación en la acumulación de prolina en las plantas tratadas. Por ejemplo, se ha informado previamente que genes relacionados con el metabolismo de la prolina, como los genes de la ornitina delta aminotransferasa (delta-OAT) y la prolina deshidrogenasa (ProDH1 y ProDH2), participan en la defensa de Nicotiana benthamiana y Arabidopsis thaliana contra cepas no hospedantes de Pseudomonas syringae (Senthil-Kumar y Mysore, 2012). Por otro lado, la ornitina descarboxilasa (ODC) fúngica es necesaria para el crecimiento del patógeno (Singh et al., 2020). La inhibición de la ODC de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici mediante el silenciamiento génico inducido por el hospedador (HIGS) mejoró significativamente la resistencia de las plantas de tomate a la marchitez por Fusarium (Singh et al., 2020). Sin embargo, el papel potencial de la aplicación exógena de ornitina contra el estrés biótico, como el causado por fitopatógenos, no se ha estudiado a fondo. Más importante aún, los efectos de la ornitina sobre la resistencia a las enfermedades y los fenómenos bioquímicos y fisiológicos asociados siguen estando en gran medida inexplorados.
Comprender la complejidad de la infección por S. sclerotiorum en leguminosas es fundamental para el desarrollo de estrategias de control eficaces. En este estudio, nos propusimos identificar el papel potencial de la diamina L-ornitina como factor clave para potenciar los mecanismos de defensa y la resistencia de las leguminosas a la infección por Sclerotinia sclerotiorum. Planteamos la hipótesis de que, además de potenciar las respuestas de defensa de las plantas infectadas, la L-ornitina también desempeña un papel crucial en el mantenimiento del estado redox. Proponemos que los efectos potenciales de la L-ornitina están relacionados con la regulación de los mecanismos de defensa antioxidante enzimáticos y no enzimáticos, así como con la interferencia con los factores de patogenicidad/virulencia del hongo y las proteínas asociadas. Esta doble funcionalidad de la L-ornitina la convierte en una candidata prometedora para una estrategia sostenible que permita mitigar el impacto del moho blanco y aumentar la resistencia de los cultivos de leguminosas comunes a este potente patógeno fúngico. Los resultados del presente estudio pueden contribuir al desarrollo de métodos innovadores y respetuosos con el medio ambiente para controlar el moho blanco y mitigar su impacto en la producción de leguminosas.
En este estudio, se utilizó como material experimental una variedad comercial susceptible de frijol común, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3). Las semillas sanas fueron amablemente proporcionadas por el Departamento de Investigación de Leguminosas, Instituto de Investigación de Cultivos de Campo (FCRI), Centro de Investigación Agrícola (ARC), Egipto. Se sembraron cinco semillas en macetas de plástico (35 cm de diámetro interno, 50 cm de profundidad) llenas de suelo infectado con S. sclerotiorum bajo condiciones de invernadero (25 ± 2 °C, humedad relativa 75 ± 1%, 8 h de luz/16 h de oscuridad). Entre los 7 y 10 días después de la siembra (DPS), las plántulas se ralearon para dejar solo dos plántulas con crecimiento uniforme y tres hojas completamente expandidas en cada maceta. Todas las plantas en maceta se regaron una vez cada dos semanas y se fertilizaron mensualmente a la dosis recomendada para la variedad en cuestión.
Para preparar una concentración de 500 mg/L de L-ornitinediamina (también conocida como ácido (+)-(S)-2,5-diaminopentanoico; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania), primero se disolvieron 50 mg en 100 mL de agua destilada estéril. La solución madre se diluyó y se utilizó en experimentos posteriores. En resumen, se probaron in vitro seis series de concentraciones de L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 y 125 mg/L). Además, se utilizó agua destilada estéril como control negativo (Mock) y el fungicida comercial “Rizolex-T” 50% polvo humectable (toclofos-metil 20% + tiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gobernación de Gharbia, Egipto) como control positivo. El fungicida comercial “Rizolex-T” se probó in vitro en cinco concentraciones (2, 4, 6, 8 y 10 mg/L).
Se recolectaron muestras de tallos y vainas de frijol común que presentaban síntomas típicos de moho blanco (tasa de infestación: 10–30%) de fincas comerciales. Si bien la mayoría de los materiales vegetales infectados se identificaron por especie/variedad (variedad comercial susceptible Giza 3), otros, especialmente los obtenidos en mercados locales, eran de especies desconocidas. Los materiales infectados recolectados se desinfectaron superficialmente con una solución de hipoclorito de sodio al 0,5% durante 3 minutos, luego se enjuagaron varias veces con agua destilada estéril y se secaron con papel de filtro estéril para eliminar el exceso de agua. Posteriormente, los órganos infectados se cortaron en pequeños trozos del tejido medio (entre los tejidos sanos e infectados), se cultivaron en medio de agar dextrosa de patata (PDA) y se incubaron a 25 ± 2 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h durante 5 días para estimular la formación de esclerocios. También se utilizó el método de la punta micelial para purificar los aislados fúngicos de cultivos mixtos o contaminados. El aislado fúngico purificado se identificó inicialmente en función de sus características morfológicas culturales y posteriormente se confirmó que se trataba de S. sclerotiorum mediante el análisis microscópico. Finalmente, se evaluó la patogenicidad de todos los aislados purificados en la variedad susceptible de frijol común Giza 3 para cumplir con los postulados de Koch.
Además, el aislado de S. sclerotiorum más invasivo (aislado n.° 3) se confirmó mediante la secuenciación del espaciador transcrito interno (ITS), como se describe en White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Brevemente, los aislados se cultivaron en caldo de patata dextrosa (PDB) y se incubaron a 25 ± 2 °C durante 5 a 7 días. Posteriormente, se recolectó el micelio fúngico, se filtró a través de una gasa, se lavó dos veces con agua estéril y se secó con papel de filtro estéril. El ADN genómico se aisló utilizando el kit Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). La región ITS rDNA se amplificó utilizando el par de cebadores específicos ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; tamaño esperado: 540 pb) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Los productos de PCR purificados se enviaron para su secuenciación (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Las secuencias ITS rDNA se secuenciaron bidireccionalmente utilizando el método de secuenciación de Sanger. Las secuencias de consulta ensambladas se compararon con los datos más recientes en GenBank y el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) utilizando el software BLASTn. La secuencia de consulta se comparó con otras 20 cepas/aislamientos de S. sclerotiorum recuperados de los datos más recientes en NCBI GenBank (Tabla suplementaria S1) usando ClustalW en el paquete de análisis de genética evolutiva molecular (MEGA-11; versión 11) (Kumar et al., 2024). El análisis evolutivo se realizó usando el método de máxima verosimilitud y el modelo general de sustitución de nucleótidos reversible en el tiempo (Nei y Kumar, 2000). Se muestra el árbol con la mayor log-verosimilitud. El árbol inicial para la búsqueda heurística se selecciona eligiendo el árbol con la mayor log-verosimilitud entre el árbol de unión de vecinos (NJ) (Kumar et al., 2024) y el árbol de máxima parsimonia (MP). El árbol NJ se construyó usando una matriz de distancias por pares calculada usando el modelo general reversible en el tiempo (Nei y Kumar, 2000).
La actividad antibacteriana de la L-ornitina y el bactericida “Rizolex-T” se determinó in vitro mediante el método de difusión en agar. Método: Tomar la cantidad apropiada de la solución madre de L-ornitina (500 mg/L) y mezclarla completamente con 10 ml del medio nutritivo PDA para preparar soluciones con concentraciones finales de 12,5, 25, 50, 75, 100 y 125 mg/L, respectivamente. Se utilizaron cinco concentraciones del fungicida “Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 y 10 mg/L) y agua destilada estéril como control. Después de que el medio se solidificó, un disco de micelio recién preparado de cultivo de Sclerotinia sclerotiorum, de 4 mm de diámetro, se transfirió al centro de la placa de Petri y se cultivó a 25±2°C hasta que el micelio cubrió toda la placa de Petri de control, después de lo cual se registró el crecimiento del hongo. Calcule el porcentaje de inhibición del crecimiento radial de S. sclerotiorum utilizando la ecuación 1:
El experimento se repitió dos veces, con seis réplicas biológicas para cada grupo control/experimental y cinco macetas (dos plantas por maceta) para cada réplica biológica. Cada réplica biológica se analizó dos veces (dos réplicas técnicas) para garantizar la exactitud, fiabilidad y reproducibilidad de los resultados experimentales. Además, se utilizó el análisis de regresión probit para calcular la concentración inhibitoria media (CI50) y la CI99 (Prentice, 1976).
Para evaluar el potencial de la L-ornitina en condiciones de invernadero, se realizaron dos experimentos consecutivos en macetas. Brevemente, las macetas se llenaron con tierra de arcilla y arena esterilizada (3:1) y se inocularon con un cultivo recién preparado de S. sclerotiorum. Primero, el aislado más invasivo de S. sclerotiorum (aislado n.° 3) se cultivó cortando un esclerocio por la mitad, colocándolo boca abajo en un PDA e incubándolo a 25 °C en oscuridad constante (24 h) durante 4 días para estimular el crecimiento micelial. Luego se tomaron cuatro discos de agar de 5 mm de diámetro del borde anterior y se inocularon con 100 g de una mezcla estéril de salvado de trigo y arroz (1:1, v/v) y todos los matraces se incubaron a 25 ± 2 °C bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h durante 5 días para estimular la formación de esclerocios. El contenido de todos los matraces se mezcló completamente para asegurar la homogeneidad antes de agregar tierra. A continuación, se añadieron 100 g de la mezcla de salvado colonizador a cada maceta para asegurar una concentración constante de patógenos. Las macetas inoculadas se regaron para activar el crecimiento de los hongos y se colocaron en condiciones de invernadero durante 7 días.
Luego se sembraron cinco semillas de la variedad Giza 3 en cada maceta. Para las macetas tratadas con L-ornitina y el fungicida Rizolex-T, las semillas esterilizadas se remojaron primero durante dos horas en una solución acuosa de los dos compuestos con una concentración final de CI99 de aproximadamente 250 mg/L y 50 mg/L, respectivamente, y luego se secaron al aire durante una hora antes de la siembra. Por otro lado, las semillas se remojaron en agua destilada estéril como control negativo. Después de 10 días, antes del primer riego, las plántulas se ralearon, dejando solo dos plántulas sanas en cada maceta. Adicionalmente, para asegurar la infección con S. sclerotiorum, los tallos de las plantas de frijol en la misma etapa de desarrollo (10 días) se cortaron en dos lugares diferentes usando un bisturí esterilizado y se colocó aproximadamente 0.5 g de la mezcla de salvado colonizador en cada herida, seguido de alta humedad para estimular la infección y el desarrollo de la enfermedad en todas las plantas inoculadas. Las plantas de control fueron dañadas de manera similar y se colocó una cantidad igual (0,5 g) de una mezcla de salvado estéril y no colonizada en la herida, manteniéndola en condiciones de alta humedad para simular el entorno propicio para el desarrollo de la enfermedad y garantizar la coherencia entre los grupos de tratamiento.
Método de tratamiento: Las plántulas de frijol se regaron con 500 ml de una solución acuosa de L-ornitina (250 mg/l) o el fungicida Rizolex-T (50 mg/l) mediante irrigación del suelo, y el tratamiento se repitió tres veces con un intervalo de 10 días. Los controles tratados con placebo se regaron con 500 ml de agua destilada estéril. Todos los tratamientos se llevaron a cabo en condiciones de invernadero (25 ± 2 °C, 75 ± 1 % de humedad relativa y un fotoperiodo de 8 h de luz/16 h de oscuridad). Todas las macetas se regaron quincenalmente y se trataron mensualmente con un fertilizante NPK equilibrado (20-20-20, con 3,6 % de azufre y microelementos TE; Zain Seeds, Egipto) a una concentración de 3–4 g/l mediante pulverización foliar según las recomendaciones para la variedad específica y las instrucciones del fabricante. Salvo que se indique lo contrario, se recolectaron hojas maduras completamente expandidas (la segunda y la tercera hoja desde la parte superior) de cada réplica biológica a las 72 horas posteriores al tratamiento (hpt), se homogeneizaron, se agruparon y se almacenaron a -80 °C para análisis posteriores que incluyen, entre otros, la localización histoquímica in situ de indicadores de estrés oxidativo, peroxidación lipídica, antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos y expresión génica.
La intensidad de la infección por moho blanco se evaluó semanalmente 21 días después de la inoculación (dpi) utilizando una escala de 1 a 9 (Tabla suplementaria S2) basada en la escala de Petzoldt y Dickson (1996) modificada por Teran et al. (2006). Brevemente, se examinaron los tallos y ramas de las plantas de frijol comenzando en el punto de inoculación para seguir la progresión de las lesiones a lo largo de los entrenudos y nudos. Luego se midió la distancia de la lesión desde el punto de inoculación hasta el punto más alejado a lo largo del tallo o rama y se asignó una puntuación de 1 a 9 según la ubicación de la lesión, donde (1) indicaba que no había infección visible cerca del punto de inoculación y (2-9) indicaban un aumento gradual en el tamaño de la lesión y progresión a lo largo de los nudos/entrenudos (Tabla suplementaria S2). La intensidad de la infección por moho blanco se convirtió luego a porcentaje utilizando la fórmula 2:
Además, el área bajo la curva de progresión de la enfermedad (AUDPC) se calculó utilizando la fórmula (Shaner y Finney, 1977), que fue adaptada recientemente para la podredumbre blanca del frijol común (Chauhan et al., 2020) utilizando la ecuación 3:
Donde Yi = gravedad de la enfermedad en el tiempo ti, Yi+1 = gravedad de la enfermedad en el siguiente tiempo ti+1, ti = tiempo de la primera medición (en días), ti+1 = tiempo de la siguiente medición (en días), n = número total de puntos de tiempo u observaciones. Los parámetros de crecimiento de las plantas de frijol, incluyendo la altura de la planta (cm), el número de ramas por planta y el número de hojas por planta, se registraron semanalmente durante 21 días en todas las réplicas biológicas.
En cada réplica biológica, se recolectaron muestras de hojas (la segunda y tercera hoja completamente desarrollada desde la parte superior) el día 45 después del tratamiento (15 días después del último tratamiento). Cada réplica biológica consistió en cinco macetas (dos plantas por maceta). Se utilizaron aproximadamente 500 mg del tejido triturado para la extracción de pigmentos fotosintéticos (clorofila a, clorofila b y carotenoides) utilizando acetona al 80% a 4 °C en la oscuridad. Después de 24 h, las muestras se centrifugaron y el sobrenadante se recolectó para la determinación colorimétrica de los contenidos de clorofila a, clorofila b y carotenoides utilizando un espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japón) según el método de (Lichtenthaler, 1987) midiendo la absorbancia en tres longitudes de onda diferentes (A470, A646 y A663 nm). Finalmente, el contenido de pigmentos fotosintéticos se calculó utilizando las siguientes fórmulas 4–6 descritas por Lichtenthaler (1987).
A las 72 h postratamiento (hpt), se recolectaron hojas (la segunda y tercera hoja completamente desarrollada desde la parte superior) de cada réplica biológica para la localización histoquímica in situ de peróxido de hidrógeno (H2O2) y anión superóxido (O2•−). Cada réplica biológica consistió en cinco macetas (dos plantas por maceta). Cada réplica biológica se analizó por duplicado (dos réplicas técnicas) para garantizar la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad del método. El H2O2 y el O2•− se determinaron utilizando 0,1 % de 3,3′-diaminobencidina (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania) o nitroazul de tetrazolio (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania), respectivamente, siguiendo los métodos descritos por Romero-Puertas et al. (2004) y Adam et al. (1989) con modificaciones menores. Para la localización histoquímica de H2O2 in situ, las valvas se infiltraron al vacío con DAB al 0,1% en tampón Tris 10 mM (pH 7,8) y luego se incubaron a temperatura ambiente en la luz durante 60 min. Las valvas se blanquearon en TCA al 0,15% (v/v) en etanol:cloroformo 4:1 (v/v) (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, El Cairo, Egipto) y luego se expusieron a la luz hasta que se oscurecieron. De manera similar, las valvas se infiltraron al vacío con tampón de fosfato de potasio 10 mM (pH 7,8) que contenía HBT al 0,1% p/v para la localización histoquímica de O2•− in situ. Las valvas se incubaron en la luz a temperatura ambiente durante 20 min, luego se blanquearon como se indicó anteriormente y luego se iluminaron hasta que aparecieron manchas azul oscuro/violeta. La intensidad del color marrón resultante (como indicador de H2O2) o azul-violeta (como indicador de O2•−) se evaluó utilizando la versión Fiji del paquete de procesamiento de imágenes ImageJ (http://fiji.sc; consultado el 7 de marzo de 2024).
El malondialdehído (MDA; como marcador de peroxidación lipídica) se determinó según el método de Du y Bramlage (1992) con ligeras modificaciones. Se recolectaron hojas de cada réplica biológica (segunda y tercera hojas completamente desarrolladas desde la parte superior) 72 h postratamiento (hpt). Cada réplica biológica incluyó cinco macetas (dos plantas por maceta). Cada réplica biológica se analizó por duplicado (dos réplicas técnicas) para asegurar la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad del método. Brevemente, se utilizaron 0,5 g de tejido foliar molido para la extracción de MDA con ácido tricloroacético (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, EE. UU.) al 20 % que contenía butilhidroxitolueno (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) al 0,01 %. El contenido de MDA en el sobrenadante se determinó colorimétricamente midiendo la absorbancia a 532 y 600 nm utilizando un espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japón) y luego se expresó en nmol g−1 FW.
Para la evaluación de antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos, se recolectaron hojas (la segunda y la tercera hoja completamente desarrollada desde la parte superior) de cada réplica biológica a las 72 h postratamiento (hpt). Cada réplica biológica constaba de cinco macetas (dos plantas por maceta). Cada muestra biológica se analizó por duplicado (dos muestras técnicas). Dos hojas se molieron con nitrógeno líquido y se utilizaron directamente para la determinación de antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos, aminoácidos totales, contenido de prolina, expresión génica y cuantificación de oxalato.
Los fenoles solubles totales se determinaron utilizando el reactivo de Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) con ligeras modificaciones del método descrito por Kahkonen et al. (1999). Brevemente, aproximadamente 0,1 g de tejido foliar homogeneizado se extrajo con 20 ml de metanol al 80 % en la oscuridad durante 24 h y el sobrenadante se recogió después de la centrifugación. 0,1 ml del extracto de la muestra se mezcló con 0,5 ml de reactivo de Folin-Ciocalteu (10 %), se agitó durante 30 s y se dejó en la oscuridad durante 5 min. Luego se añadieron 0,5 ml de solución de carbonato de sodio al 20 % (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, El Cairo, Egipto) a cada tubo, se mezcló bien y se incubó a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 h. Tras la incubación, se midió la absorbancia de la mezcla de reacción a 765 nm utilizando un espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japón). La concentración de fenoles solubles totales en los extractos de muestra se determinó mediante una curva de calibración de ácido gálico (Fisher Scientific, Hampton, NH, EE. UU.) y se expresó en miligramos de equivalente de ácido gálico por gramo de peso fresco (mg EAG g⁻¹ de peso fresco).
El contenido total de flavonoides solubles se determinó según el método de Djeridane et al. (2006) con ligeras modificaciones. Brevemente, se mezclaron 0,3 ml del extracto de metanol anterior con 0,3 ml de solución de cloruro de aluminio al 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, EE. UU.), se agitó vigorosamente y luego se incubó a temperatura ambiente durante 5 min, seguido de la adición de 0,3 ml de solución de acetato de potasio al 10% (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, El Cairo, Egipto), se mezcló completamente y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad. Después de la incubación, la absorbancia de la mezcla de reacción se midió a 430 nm utilizando un espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japón). La concentración de flavonoides solubles totales en los extractos de muestra se determinó utilizando una curva de calibración de rutina (TCI America, Portland, OR, EE. UU.) y luego se expresó como miligramos de equivalente de rutina por gramo de peso fresco (mg RE g-1 peso fresco).
El contenido total de aminoácidos libres de las hojas de frijol se determinó utilizando un reactivo de ninhidrina modificado (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, EE. UU.) basado en el método propuesto por Yokoyama y Hiramatsu (2003) y modificado por Sun et al. (2006). Brevemente, se extrajo 0,1 g de tejido molido con un tampón de pH 5,4, y 200 μL del sobrenadante se hicieron reaccionar con 200 μL de ninhidrina (2 %) y 200 μL de piridina (10 %; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, EE. UU.), se incubó en un baño de agua hirviendo durante 30 min, luego se enfrió y se midió a 580 nm utilizando un espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japón). Por otro lado, la prolina se determinó mediante el método de Bates (Bates et al., 1973). La prolina se extrajo con ácido sulfosalicílico al 3% (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, EE. UU.) y, tras la centrifugación, se mezclaron 0,5 ml del sobrenadante con 1 ml de ácido acético glacial (Fisher Scientific, Hampton, NH, EE. UU.) y reactivo de ninhidrina. La incubación se realizó a 90 °C durante 45 minutos, se enfrió y se midió a 520 nm utilizando el mismo espectrofotómetro descrito anteriormente. Los aminoácidos libres totales y la prolina en los extractos de hojas se determinaron utilizando curvas de calibración de glicina y prolina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.), respectivamente, y se expresaron en mg/g de peso fresco.
Para determinar la actividad enzimática de las enzimas antioxidantes, se extrajeron aproximadamente 500 mg de tejido homogeneizado con 3 ml de tampón Tris 50 mM (pH 7,8) que contenía 1 mM de EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) y 7,5 % de polivinilpirrolidona (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.), se centrifugó a 10.000 × g durante 20 min en refrigeración (4 °C) y se recogió el sobrenadante (extracto enzimático crudo) (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). La catalasa (CAT) se hizo reaccionar con 2 ml de tampón de fosfato de sodio 0,1 M (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) y 100 μl de solución de H2O2 269 mM para determinar su actividad enzimática según el método de Aebi (1984) con ligeras modificaciones (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). La actividad enzimática de la peroxidasa dependiente de guayacol (POX) se determinó utilizando el método de Harrach et al. (2009). (2008) con modificaciones menores (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) y la actividad enzimática de la polifenol oxidasa (PPO) se determinó después de la reacción con 2,2 ml de tampón de fosfato de sodio 100 mM (pH 6,0), 100 μl de guayacol (TCI chemicals, Portland, OR, EE. UU.) y 100 μl de H2O2 12 mM. El método fue ligeramente modificado de (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). El ensayo se realizó después de la reacción con 3 ml de solución de catecol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, EE. UU.) (0,01 M) recién preparada en tampón de fosfato 0,1 M (pH 6,0). La actividad de CAT se midió monitorizando la descomposición de H2O2 a 240 nm (A240), la actividad de POX se midió monitorizando el aumento de la absorbancia a 436 nm (A436) y la actividad de PPO se midió registrando las fluctuaciones de la absorbancia a 495 nm (A495) cada 30 s durante 3 min utilizando un espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu, Japón).
Se utilizó RT-PCR en tiempo real para detectar los niveles de transcripción de tres genes relacionados con antioxidantes, incluyendo la catalasa peroxisomal (PvCAT1; número de acceso de GenBank KF033307.1), la superóxido dismutasa (PvSOD; número de acceso de GenBank XM_068639556.1) y la glutatión reductasa (PvGR; número de acceso de GenBank KY195009.1), en hojas de frijol (la segunda y tercera hojas completamente desarrolladas desde la parte superior) 72 h después del último tratamiento. Brevemente, el ARN se aisló utilizando el kit de extracción de ARN total Simply P (n.° de cat. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) según el protocolo del fabricante. Luego, el ADNc se sintetizó utilizando el kit de síntesis de ADNc TOP script™ según las instrucciones del fabricante. Las secuencias de los cebadores de los tres genes mencionados se enumeran en la Tabla suplementaria S3. Se utilizó PvActin-3 (número de acceso de GenBank: XM_068616709.1) como gen de referencia y se calculó la expresión génica relativa mediante el método 2-ΔΔCT (Livak y Schmittgen, 2001). Se demostró la estabilidad de la actina bajo estrés biótico (interacción incompatible entre leguminosas comunes y el hongo de la antracnosis Colletotrichum lindemuthianum) y estrés abiótico (sequía, salinidad, baja temperatura) (Borges et al., 2012).
Inicialmente realizamos un análisis in silico de todo el genoma de las proteínas oxalacetato acetilhidrolasa (OAH) en S. sclerotiorum utilizando la herramienta BLAST de proteína-proteína (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Brevemente, utilizamos OAH de Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; número de acceso de GenBank XP_040799428.1; 342 aminoácidos) y Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; número de acceso de GenBank XP_056833920.1; 316 aminoácidos) como secuencias de consulta para mapear la proteína homóloga en S. sclerotiorum (taxide: 5180). Se realizó una búsqueda BLASTp contra los datos del genoma de S. sclerotiorum más recientes disponibles en GenBank en el sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Además, el gen OAH predicho de S. sclerotiorum (SsOAH) y el análisis evolutivo y árbol filogenético de AfOAH de A. fijiensis CBS 313.89 y PlOAH de P. lagena se infirieron utilizando el método de máxima verosimilitud en MEGA11 (Tamura et al., 2021) y el modelo basado en matriz JTT (Jones et al., 1992). El árbol filogenético se combinó con el análisis de alineación múltiple de secuencias de proteínas de todos los genes OAH predichos (SsOAH) de S. sclerotiorum y la secuencia de consulta utilizando la herramienta de alineación basada en restricciones (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos y Agarwala, 2007). Además, las secuencias de aminoácidos que mejor coincidían de SsOAH de S. sclerotiorum se alinearon con las secuencias de consulta (AfOAH y PlOAH) (Larkin et al., 2007) utilizando ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), y las regiones conservadas en la alineación se visualizaron utilizando la herramienta ESPript (versión 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Además, los dominios funcionales representativos predichos y los sitios conservados de S. sclerotiorum SsOAH se clasificaron interactivamente en diferentes familias utilizando la herramienta InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Finalmente, se realizó un modelado de la estructura tridimensional (3D) de la SsOAH predicha de S. sclerotiorum utilizando el motor de reconocimiento de homología/analogía de proteínas (servidor Phyre2 versión 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) y se validó utilizando el servidor SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Las estructuras tridimensionales predichas (formato PDB) se visualizaron de forma interactiva utilizando el paquete UCSF-Chimera (versión 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004).
Se utilizó PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real para determinar el nivel de transcripción de la oxalacetato acetilhidrolasa (SsOAH; número de acceso de GenBank: XM_001590428.1) en el micelio de Sclerotinia sclerotiorum. Brevemente, S. sclerotiorum se inoculó en un matraz que contenía PDB y se colocó en una incubadora con agitación (modelo: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, EE. UU.) a 25 ± 2 °C durante 24 h a 150 rpm y en oscuridad constante (24 h) para estimular el crecimiento micelial. Posteriormente, las células se trataron con L-ornitina y el fungicida Rizolex-T a concentraciones finales de CI50 (aproximadamente 40 y 3,2 mg/L, respectivamente) y luego se cultivaron durante otras 24 h en las mismas condiciones. Después de la incubación, los cultivos se centrifugaron a 2500 rpm durante 5 min y el sobrenadante (micelio fúngico) se recolectó para el análisis de la expresión génica. De manera similar, el micelio fúngico se recolectó a las 0, 24, 48, 72, 96 y 120 h post-infección de plantas infectadas que habían formado moho blanco y micelio algodonoso en la superficie de los tejidos infectados. Se extrajo ARN del micelio fúngico y luego se sintetizó ADNc como se describió anteriormente. Las secuencias de los cebadores para SsOAH se enumeran en la Tabla Suplementaria S3. SsActin (número de acceso de GenBank: XM_001589919.1) se usó como gen de referencia, y la expresión génica relativa se calculó usando el método 2-ΔΔCT (Livak y Schmittgen, 2001).
El ácido oxálico se determinó en caldo de patata dextrosa (PDB) y muestras de plantas que contenían el patógeno fúngico Sclerotinia sclerotiorum según el método de Xu y Zhang (2000) con ligeras modificaciones. Brevemente, los aislamientos de S. sclerotiorum se inocularon en matraces que contenían PDB y luego se cultivaron en una incubadora con agitación (modelo I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, EE. UU.) a 150 rpm a 25 ± 2 °C durante 3–5 días en oscuridad constante (24 h) para estimular el crecimiento micelial. Después de la incubación, el cultivo fúngico se filtró primero a través de papel de filtro Whatman #1 y luego se centrifugó a 2500 rpm durante 5 min para eliminar el micelio residual. El sobrenadante se recolectó y se almacenó a 4 °C para la posterior determinación cuantitativa de oxalato. Para la preparación de muestras de plantas, aproximadamente 0,1 g de fragmentos de tejido vegetal se extrajeron tres veces con agua destilada (2 ml cada vez). A continuación, las muestras se centrifugaron a 2500 rpm durante 5 minutos, el sobrenadante se filtró en seco a través de papel de filtro Whatman n.° 1 y se recogió para su posterior análisis.
Para el análisis cuantitativo del ácido oxálico, la mezcla de reacción se preparó en un tubo de vidrio con tapón en el siguiente orden: 0,2 ml de muestra (o filtrado de cultivo PDB o solución estándar de ácido oxálico), 0,11 ml de azul de bromofenol (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, EE. UU.), 0,198 ml de ácido sulfúrico 1 M (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, El Cairo, Egipto) y 0,176 ml de dicromato de potasio 100 mM (K2Cr2O7; TCI Chemicals, Portland, OR, EE. UU.). A continuación, la solución se diluyó a 4,8 ml con agua destilada, se mezcló vigorosamente y se colocó inmediatamente en un baño de agua a 60 °C. Tras 10 minutos, la reacción se detuvo añadiendo 0,5 ml de solución de hidróxido de sodio (NaOH; 0,75 M). La absorbancia (A600) de la mezcla de reacción se midió a 600 nm utilizando un espectrofotómetro UV-160 (Shimadzu Corporation, Japón). Se utilizaron PDB y agua destilada como controles para la cuantificación de los filtrados de cultivo y las muestras de plantas, respectivamente. Las concentraciones de ácido oxálico en los filtrados de cultivo, expresadas como microgramos de ácido oxálico por mililitro de medio PDB (μg·mL−1), y en los extractos de hojas, expresadas como microgramos de ácido oxálico por gramo de peso fresco (μg·g−1 PF), se determinaron utilizando una curva de calibración de ácido oxálico (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, EE. UU.).
A lo largo del estudio, todos los experimentos se diseñaron con un diseño completamente aleatorizado (DCA) con seis réplicas biológicas por tratamiento y cinco macetas por réplica biológica (dos plantas por maceta), salvo que se indique lo contrario. Las réplicas biológicas se analizaron por duplicado (dos réplicas técnicas). Las réplicas técnicas se utilizaron para comprobar la reproducibilidad del mismo experimento, pero no se incluyeron en el análisis estadístico para evitar réplicas espurias. Los datos se analizaron estadísticamente mediante análisis de varianza (ANOVA) seguido de la prueba de diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey-Kramer (p ≤ 0,05). Para los experimentos in vitro, los valores de IC50 e IC99 se calcularon utilizando el modelo probit y se calcularon los intervalos de confianza del 95 %.
Se recolectaron un total de cuatro aislamientos de diferentes campos de soja en la Gobernación de El Ghabiya, Egipto. En medio PDA, todos los aislamientos produjeron micelio blanco cremoso que rápidamente se tornó blanco algodonoso (Figura 1A) y luego beige o marrón en la etapa de esclerocio. Los esclerocios suelen ser densos, negros, esféricos o de forma irregular, de 5,2 a 7,7 mm de largo y de 3,4 a 5,3 mm de diámetro (Figura 1B). Aunque cuatro aislamientos desarrollaron un patrón marginal de esclerocios en el borde del medio de cultivo después de 10 a 12 días de incubación a 25 ± 2 °C (Fig. 1A), el número de esclerocios por placa fue significativamente diferente entre ellos (P < 0,001), siendo el aislamiento 3 el que presentó el mayor número de esclerocios (32,33 ± 1,53 esclerocios por placa; Fig. 1C). De manera similar, el aislado n.° 3 produjo más ácido oxálico en PDB que los demás aislados (3,33 ± 0,49 μg·mL−1; Fig. 1D). El aislado n.° 3 mostró características morfológicas y microscópicas típicas del hongo fitopatógeno Sclerotinia sclerotiorum. Por ejemplo, en PDA, las colonias del aislado n.° 3 crecieron rápidamente, eran de color blanco cremoso (Figura 1A), beige inverso o amarillo salmón claro, y requirieron de 6 a 7 días a 25 ± 2 °C para cubrir completamente la superficie de una placa de 9 cm de diámetro. Con base en las características morfológicas y microscópicas anteriores, el aislado n.° 3 se identificó como Sclerotinia sclerotiorum.
Figura 1. Características y patogenicidad de aislamientos de S. sclerotiorum de cultivos de leguminosas comunes. (A) Crecimiento micelial de cuatro aislamientos de S. sclerotiorum en medio PDA, (B) esclerocios de cuatro aislamientos de S. sclerotiorum, (C) número de esclerocios (por placa), (D) secreción de ácido oxálico en medio PDB (μg.mL−1) y (E) severidad de la enfermedad (%) de cuatro aislamientos de S. sclerotiorum en el cultivar comercial de leguminosa susceptible Giza 3 en condiciones de invernadero. Los valores representan la media ± DE de cinco réplicas biológicas (n = 5). Las letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos (p < 0,05). (F–H) Síntomas típicos de moho blanco aparecieron en tallos aéreos y silicua, respectivamente, 10 días después de la inoculación con el aislamiento n.° 3 (dpi). (I) Se realizó un análisis evolutivo de la región del espaciador transcrito interno (ITS) del aislado n.° 3 de S. sclerotiorum utilizando el método de máxima verosimilitud y se comparó con 20 aislados/cepas de referencia obtenidos de la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Los números sobre las líneas de agrupamiento indican la cobertura de la región (%), y los números debajo de las líneas de agrupamiento indican la longitud de la rama.
Además, para confirmar la patogenicidad, se utilizaron cuatro aislamientos de S. sclerotiorum obtenidos para inocular el cultivar comercial de frijol susceptible Giza 3 en condiciones de invernadero, lo cual es consistente con los postulados de Koch (Fig. 1E). Aunque todos los aislamientos fúngicos obtenidos fueron patógenos y pudieron infectar el frijol verde (cv. Giza 3), causando síntomas típicos de moho blanco en todas las partes aéreas (Fig. 1F), especialmente en los tallos (Fig. 1G) y las vainas (Fig. 1H) a los 10 días posteriores a la inoculación (dpi), el aislamiento 3 fue el más agresivo en dos experimentos independientes. El aislamiento 3 tuvo la mayor severidad de la enfermedad (%) en las plantas de frijol (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 y 76,7 ± 3,1 a los 7, 14 y 21 días posteriores a la infección, respectivamente; Figura 1F).
La identificación del aislado de S. sclerotiorum n.° 3, el más invasivo, se confirmó mediante la secuenciación del espaciador transcrito interno (ITS) (Fig. 1I). El análisis filogenético entre el aislado n.° 3 y 20 aislados/cepas de referencia mostró una alta similitud (>99 %) entre ellos. Cabe destacar que el aislado de S. sclerotiorum n.° 3 (533 pb) tiene una alta similitud con el aislado estadounidense de S. sclerotiorum LPM36, aislado de semillas de guisantes secas (número de acceso de GenBank MK896659.1; 540 pb), y con el aislado chino de S. sclerotiorum YKY211 (número de acceso de GenBank OR206374.1; 548 pb), que causa la pudrición del tallo violeta (Matthiola incana), todos los cuales se agrupan por separado en la parte superior del dendrograma (Figura 1I). La nueva secuencia se ha depositado en la base de datos del NCBI y se ha denominado “Sclerotinia sclerotiorum – aislado YN-25” (número de acceso GenBank PV202792). Se observa que el aislado 3 es el más invasivo; por lo tanto, se seleccionó para el estudio en todos los experimentos posteriores.
Se investigó in vitro la actividad antibacteriana de la diamina L-ornitina (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania) a diferentes concentraciones (12,5, 25, 50, 75, 100 y 125 mg/L) contra el aislado 3 de S. sclerotiorum. Cabe destacar que la L-ornitina ejerció un efecto antibacteriano e inhibió gradualmente el crecimiento radial de las hifas de S. sclerotiorum de manera dosis-dependiente (Figura 2A, B). A la concentración más alta probada (125 mg/L), la L-ornitina demostró la mayor tasa de inhibición del crecimiento micelial (99,62 ± 0,27%; Figura 2B), que fue equivalente al fungicida comercial Rizolex-T (tasa de inhibición 99,45 ± 0,39%; Figura 2C) a la concentración más alta probada (10 mg/L), lo que indica una eficacia similar.
Figura 2. Actividad antibacteriana in vitro de L-ornitina contra Sclerotinia sclerotiorum. (A) Comparación de la actividad antibacteriana de diferentes concentraciones de L-ornitina contra S. sclerotiorum con el fungicida comercial Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Tasa de inhibición (%) del crecimiento micelial de S. sclerotiorum después del tratamiento con diferentes concentraciones de L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 y 125 mg/L) o Rizolex-T (2, 4, 6, 8 y 10 mg/L), respectivamente. Los valores representan la media ± DE de cinco réplicas biológicas (n = 5). Las letras diferentes denotan diferencias estadísticas entre tratamientos (p < 0,05). (D, E) Análisis de regresión del modelo Probit de L-ornitina y el fungicida comercial Rizolex-T, respectivamente. La línea de regresión del modelo probit se muestra como una línea azul continua, y el intervalo de confianza (95%) se muestra como una línea roja discontinua.
Además, se realizó un análisis de regresión probit y los gráficos correspondientes se muestran en la Tabla 1 y las Figuras 2D,E. Brevemente, el valor de pendiente aceptable (y = 2,92x − 4,67) y las estadísticas significativas asociadas (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 y p < 0,0001; Figura 2D) de la L-ornitina indicaron una actividad antifúngica mejorada contra S. sclerotiorum en comparación con el fungicida comercial Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 y p < 0,0001) (Tabla 1).
Tabla 1. Valores de concentración inhibitoria media máxima (CI50) y CI99 (mg/l) de L-ornitina y fungicida comercial “Rizolex-T” frente a S. sclerotiorum.
En general, la L-ornitina (250 mg/L) redujo significativamente el desarrollo y la gravedad del moho blanco en plantas de frijol común tratadas en comparación con plantas infectadas con S. sclerotiorum no tratadas (control; Figura 3A). Brevemente, aunque la gravedad de la enfermedad en las plantas de control infectadas no tratadas aumentó gradualmente (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 y 92,33 ± 3,06%), la L-ornitina redujo significativamente la gravedad de la enfermedad (%) a lo largo del experimento (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 y 26,36 ± 3,07) a los 7, 14 y 21 días posteriores al tratamiento (dpt), respectivamente (Figura 3A). De manera similar, cuando las plantas de frijol infectadas con S. sclerotiorum fueron tratadas con 250 mg/L de L-ornitina, el área bajo la curva de progresión de la enfermedad (AUDPC) disminuyó de 1274,33 ± 33,13 en el control sin tratamiento a 281,03 ± 7,95, que fue ligeramente inferior a la del control positivo con 50 mg/L del fungicida Rizolex-T (183,61 ± 7,71; Fig. 3B). Se observó la misma tendencia en el segundo experimento.
Figura 3. Efecto de la aplicación exógena de L-ornitina en el desarrollo de la podredumbre blanca del frijol común causada por Sclerotinia sclerotiorum en condiciones de invernadero. (A) Curva de progresión de la enfermedad de la podredumbre blanca del frijol común tras el tratamiento con 250 mg/L de L-ornitina. (B) Área bajo la curva de progresión de la enfermedad (AUDPC) de la podredumbre blanca del frijol común tras el tratamiento con L-ornitina. Los valores representan la media ± desviación estándar de cinco réplicas biológicas (n = 5). Las letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos (p < 0,05).
La aplicación exógena de 250 mg/L de L-ornitina aumentó gradualmente la altura de la planta (Fig. 4A), el número de ramas por planta (Fig. 4B) y el número de hojas por planta (Fig. 4C) después de 42 días. Si bien el fungicida comercial Rizolex-T (50 mg/L) tuvo el mayor efecto sobre todos los parámetros nutricionales estudiados, la aplicación exógena de 250 mg/L de L-ornitina tuvo el segundo mayor efecto en comparación con los controles no tratados (Figs. 4A–C). Por otro lado, el tratamiento con L-ornitina no tuvo un efecto significativo en el contenido de los pigmentos fotosintéticos clorofila a (Fig. 4D) y clorofila b (Fig. 4E), pero sí aumentó ligeramente el contenido total de carotenoides (0,56 ± 0,03 mg/g de peso fresco) en comparación con el control negativo (0,44 ± 0,02 mg/g de peso fresco) y el control positivo (0,46 ± 0,02 mg/g de peso fresco; Fig. 4F). En general, estos resultados indican que la L-ornitina no es fitotóxica para las leguminosas tratadas e incluso puede estimular su crecimiento.
Figura 4. Efecto de la aplicación exógena de L-ornitina sobre las características de crecimiento y los pigmentos fotosintéticos de las hojas de frijol infectadas con Sclerotinia sclerotiorum en condiciones de invernadero. (A) Altura de la planta (cm), (B) Número de ramas por planta, (C) Número de hojas por planta, (D) Contenido de clorofila a (mg g⁻¹ peso fresco), (E) Contenido de clorofila b (mg g⁻¹ peso fresco), (F) Contenido total de carotenoides (mg g⁻¹ peso fresco). Los valores son la media ± desviación estándar de cinco réplicas biológicas (n = 5). Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos (p < 0,05).
La localización histoquímica in situ de especies reactivas de oxígeno (ROS; expresadas como peróxido de hidrógeno [H2O2]) y radicales libres (expresados ​​como aniones superóxido [O2•−]) reveló que la aplicación exógena de L-ornitina (250 mg/L) redujo significativamente la acumulación de H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) y O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) en comparación con la acumulación de plantas infectadas no tratadas (173,31 ± 12,06 y 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW, respectivamente) y plantas tratadas con 50 mg/L del fungicida comercial Rizolex-T (170,12 ± 9,50 y 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt, respectivamente) a las 72 h. Altos niveles de H2O2 y O2•− se acumularon bajo hpt (Fig. 5A, B). De manera similar, el ensayo de malondialdehído (MDA) basado en TCA mostró que las plantas de frijol infectadas con S. sclerotiorum acumularon niveles más altos de MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) en sus hojas (Fig. 5C). Sin embargo, la aplicación exógena de L-ornitina redujo significativamente la peroxidación lipídica como lo demuestra la disminución en el contenido de MDA en las plantas tratadas (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Figura 5. Efecto de la aplicación exógena de L-ornitina sobre los principales marcadores de estrés oxidativo y mecanismos de defensa antioxidante no enzimáticos en hojas de frijol infectadas con S. sclerotiorum a las 72 h post-infección en condiciones de invernadero. (A) Peróxido de hidrógeno (H2O2; nmol g−1 PF) a las 72 hpt, (B) anión superóxido (O2•−; nmol g−1 PF) a las 72 hpt, (C) malondialdehído (MDA; nmol g−1 PF) a las 72 hpt, (D) fenoles solubles totales (mg GAE g−1 PF) a las 72 hpt, (E) flavonoides solubles totales (mg RE g−1 PF) a las 72 hpt, (F) aminoácidos libres totales (mg g−1 PF) a las 72 hpt, y (G) contenido de prolina (mg g−1 PF) a las 72 hpt. Los valores representan la media ± desviación estándar (media ± DE) de 5 réplicas biológicas (n = 5). Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos (p < 0,05).