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Las nanopartículas (NP) de insulina con alto contenido de carga se han utilizado en diversas formas farmacéuticas. Este trabajo busca evaluar el efecto de los procesos de liofilización y secado por aspersión en la estructura de nanopartículas de quitosano cargadas con insulina, con o sin manitol como crioprotector. También evaluamos la calidad de estas nanopartículas mediante su redisolución. Antes de la deshidratación, el tamaño de partícula de las nanopartículas reticuladas de quitosano/tripolifosfato de sodio/insulina se optimizó a 318 nm, el PDI fue de 0,18, la eficiencia de encapsulación fue del 99,4 % y la carga fue del 25,01 %. Tras la reconstitución, todas las nanopartículas, excepto las producidas mediante liofilización sin manitol, mantuvieron su estructura esférica. En comparación con las nanopartículas con manitol deshidratadas por aspersión, las nanopartículas secadas por aspersión sin manitol también mostraron el tamaño medio de partícula más pequeño (376 nm). y el contenido de carga más alto (25,02%) con una tasa de encapsulación similar (98,7%) y PDI (0,20) mediante técnicas de secado o liofilización. Las nanopartículas secadas mediante secado por pulverización sin manitol también dieron como resultado la liberación más rápida de insulina y la mayor eficiencia de captación celular. Este trabajo muestra que el secado por pulverización puede deshidratar nanopartículas de insulina sin la necesidad de crioprotectores en comparación con los métodos de liofilización convencionales, lo que crea una mayor capacidad de carga, menores requisitos de aditivos y costos operativos significativos.
Desde su descubrimiento en 19221,2,3, la insulina y sus preparaciones farmacéuticas han salvado las vidas de pacientes con diabetes tipo 1 (DT1) y diabetes tipo 2 (DT1). Sin embargo, debido a sus propiedades como proteína de alto peso molecular, la insulina se agrega fácilmente, se descompone por enzimas proteolíticas y se elimina por el efecto de primer paso. Las personas diagnosticadas con diabetes tipo 1 necesitan inyecciones de insulina por el resto de sus vidas. Muchos pacientes diagnosticados inicialmente con diabetes tipo 2 también requieren inyecciones de insulina a largo plazo. Las inyecciones diarias de insulina son una fuente grave de dolor y malestar diario para estas personas, con efectos negativos en la salud mental. Como resultado, otras formas de administración de insulina que causan menos molestias, como la administración de insulina oral, se están estudiando ampliamente5 ya que tienen el potencial de restaurar la calidad de vida de aproximadamente 5 mil millones de personas con diabetes en todo el mundo.
La tecnología de nanopartículas ha proporcionado un avance significativo en los intentos de administrar insulina oral4,6,7. Una que encapsula y protege eficazmente la insulina de la degradación para su administración dirigida a sitios corporales específicos. Sin embargo, el uso de formulaciones de nanopartículas tiene varias limitaciones, principalmente debido a problemas de estabilidad de las suspensiones de partículas. Puede producirse cierta agregación durante el almacenamiento, lo que reduce la biodisponibilidad de las nanopartículas cargadas con insulina8. Además, también se debe considerar la estabilidad química de la matriz polimérica de las nanopartículas y la insulina para garantizar la estabilidad de las nanopartículas de insulina (NP). Actualmente, la tecnología de liofilización es el estándar de oro para crear NP estables al tiempo que se evitan cambios no deseados durante el almacenamiento9.
Sin embargo, la liofilización requiere la adición de crioprotectores para evitar que la estructura esférica de las NP se vea afectada por la tensión mecánica de los cristales de hielo. Esto reduce significativamente la carga de nanopartículas de insulina después de la liofilización, ya que el crioprotector ocupa la mayor parte de la relación de peso. Por lo tanto, las NP de insulina producidas a menudo resultan inadecuadas para la fabricación de formulaciones de polvo seco, como tabletas orales y películas orales, debido a la necesidad de grandes cantidades de nanopartículas secas para lograr la ventana terapéutica de la insulina.
El secado por aspersión es un proceso a escala industrial conocido y económico para producir polvos secos a partir de fases líquidas en la industria farmacéutica10,11. El control sobre el proceso de formación de partículas permite la encapsulación adecuada de varios compuestos bioactivos 12, 13. Además, se ha convertido en una técnica eficaz para la preparación de proteínas encapsuladas para administración oral. Durante el secado por aspersión, el agua se evapora muy rápidamente, lo que ayuda a mantener baja la temperatura del núcleo de la partícula11,14, lo que permite su aplicación para encapsular componentes sensibles al calor. Antes del secado por aspersión, el material de recubrimiento debe homogeneizarse completamente con la solución que contiene los ingredientes encapsulados11,14. A diferencia del secado por liofilización, la homogeneización antes de la encapsulación en el secado por aspersión mejora la eficiencia de encapsulación durante la deshidratación. Dado que el proceso de encapsulación por secado por aspersión no requiere crioprotectores, el secado por aspersión se puede utilizar para producir NP secas con un alto contenido de carga.
Este estudio informa sobre la producción de NP cargadas con insulina mediante la reticulación de quitosano y tripolifosfato de sodio utilizando un método de gel iónico. La gelificación iónica es un método de preparación que permite la producción de nanopartículas a través de interacciones electrostáticas entre dos o más especies iónicas en determinadas condiciones. Se utilizaron técnicas de liofilización y secado por aspersión para deshidratar las nanopartículas reticuladas de quitosano/tripolifosfato de sodio/insulina optimizadas. Después de la deshidratación, se analizó su morfología mediante SEM. Se evaluó su capacidad de recombinación midiendo su distribución de tamaño, carga superficial, PDI, eficiencia de encapsulación y contenido de carga. También se evaluó la calidad de las nanopartículas resolubilizadas producidas por diferentes métodos de deshidratación comparando su protección contra la insulina, comportamiento de liberación y eficacia de captación celular.
El pH de la solución mixta y la proporción de quitosano e insulina son dos factores clave que afectan el tamaño de partícula y la eficiencia de encapsulación (EE) de las nanopartículas finales, ya que inciden directamente en el proceso de gelificación ionotrópica. Se demostró que el pH de la solución mixta está altamente correlacionado con el tamaño de partícula y la eficiencia de encapsulación (Fig. 1a). Como se muestra en la Fig. 1a, al aumentar el pH de 4,0 a 6,0, el tamaño promedio de partícula (nm) disminuyó y la EE aumentó significativamente, mientras que al aumentar el pH a 6,5, el tamaño promedio de partícula comenzó a aumentar y la EE se mantuvo sin cambios. Al aumentar la proporción de quitosano e insulina, también aumenta el tamaño promedio de partícula. Además, no se observaron cambios en la EE cuando las nanopartículas se prepararon con una proporción de masa de quitosano/insulina superior a 2,5:1 (p/p) (Fig. 1b). Por lo tanto, las condiciones óptimas de preparación en este estudio (pH 6,0, proporción de masa de quitosano/insulina de 2,5:1) se utilizaron para preparar nanopartículas cargadas con insulina para estudios posteriores. Bajo esta condición de preparación, el tamaño de partícula promedio de las nanopartículas de insulina se optimizó para ser 318 nm (Fig. 1c), el PDI fue 0,18, la eficiencia de incrustación fue 99,4%, el potencial zeta fue 9,8 mv y la carga de insulina fue 25,01% (m/m). Con base en los resultados de la microscopía electrónica de transmisión (TEM), las nanopartículas optimizadas fueron aproximadamente esféricas y discretas con un tamaño relativamente uniforme (Fig. 1d).
Optimización de parámetros de nanopartículas de insulina: (a) efecto del pH en el diámetro medio y la eficiencia de encapsulación (EE) de nanopartículas de insulina (preparadas con una proporción de masa de 5:1 de quitosano e insulina); (b) influencia de la proporción de masa de quitosano e insulina en el diámetro medio y la eficiencia de encapsulación (EE) de nanopartículas de insulina (preparadas a pH 6); (c) distribución del tamaño de partícula de nanopartículas de insulina optimizadas; (d) micrografía TEM de nanopartículas de insulina optimizadas.
Es bien sabido que el quitosano es un polielectrolito débil con un pKa de 6,5. Está cargado positivamente en medios ácidos porque su grupo amino principal está protonado por iones de hidrógeno15. Por lo tanto, a menudo se utiliza como portador para encapsular macromoléculas cargadas negativamente. En este estudio, se utilizó quitosano para encapsular insulina con un punto isoeléctrico de 5,3. Dado que el quitosano se utiliza como material de recubrimiento, con el aumento de su proporción, el espesor de la capa exterior de las nanopartículas aumenta correspondientemente, lo que resulta en un tamaño de partícula promedio mayor. Además, niveles más altos de quitosano pueden encapsular más insulina. En nuestro caso, EE fue más alto cuando la proporción de quitosano e insulina alcanzó 2,5:1, y no hubo cambios significativos en EE cuando la proporción siguió aumentando.
Además de la proporción de quitosano e insulina, el pH también jugó un papel crucial en la preparación de NP. Gan et al. 17 estudiaron el efecto del pH en el tamaño de partícula de las nanopartículas de quitosano. Encontraron una disminución continua en el tamaño de partícula hasta que el pH alcanzó 6,0, y se observó un aumento significativo en el tamaño de partícula a pH > 6,0, lo que es consistente con nuestras observaciones. Este fenómeno se debe al hecho de que al aumentar el pH, la molécula de insulina adquiere una carga superficial negativa, favoreciendo así las interacciones electrostáticas con el complejo quitosano/tripolifosfato de sodio (TPP), lo que resulta en un tamaño de partícula pequeño y una EE alta. Sin embargo, cuando el pH se ajustó a 6,5, los grupos amino en el quitosano se desprotonaron, lo que resultó en el plegamiento del quitosano. Por lo tanto, un pH alto da como resultado una menor exposición de los iones amino al TPP y la insulina, lo que resulta en una menor reticulación, un tamaño de partícula promedio final más grande y una EE más baja.
El análisis de las propiedades morfológicas de las nanopartículas (NP) liofilizadas y secadas por aspersión puede orientar la selección de las mejores técnicas de deshidratación y formación de polvo. El método preferido debe proporcionar estabilidad del fármaco, forma uniforme de las partículas, alta carga de fármaco y buena solubilidad en la solución original. En este estudio, para comparar mejor las dos técnicas, se utilizaron nanopartículas de insulina con o sin manitol al 1 % durante la deshidratación. El manitol se utiliza como agente de carga o crioprotector en diversas formulaciones de polvo seco para liofilización y secado por aspersión. En las nanopartículas de insulina liofilizadas sin manitol, como se muestra en la Figura 2a, se observó una estructura de polvo altamente porosa con superficies grandes, irregulares y rugosas bajo microscopía electrónica de barrido (MEB). Se detectaron pocas partículas discretas en el polvo después de la deshidratación (Fig. 2e). Estos resultados indicaron que la mayoría de las NP se descompusieron durante la liofilización sin ningún crioprotector. En las nanopartículas de insulina liofilizadas y secadas por aspersión que contienen manitol al 1 %, se utilizaron nanopartículas esféricas con superficies lisas. Se observaron superficies (Fig. 2b,d,f,h).Las nanopartículas de insulina secadas por aspersión sin manitol permanecieron esféricas pero arrugadas en la superficie (Fig. 2c).Las superficies esféricas y arrugadas se discuten más a fondo en el comportamiento de liberación y las pruebas de captación celular a continuación.Con base en la apariencia visible de las NP secas, tanto las NP secadas por aspersión sin manitol como las NP liofilizadas y secadas por aspersión con manitol produjeron polvos de NP finos (Fig. 2f,g,h).Cuanto mayor sea el área superficial entre las superficies de las partículas, mayor será la solubilidad y, por lo tanto, mayor será la tasa de liberación.
Morfología de diferentes nanopartículas de insulina deshidratadas: (a) imagen SEM de nanopartículas de insulina liofilizadas sin manitol; (b) imagen SEM de nanopartículas de insulina liofilizadas con manitol; (c) imagen SEM de nanopartículas de insulina secadas por aspersión sin manitol; (d) imagen SEM de nanopartículas de insulina secadas por aspersión con manitol; (e) imagen de polvo de nanopartículas de insulina liofilizadas sin manitol; (f) imagen de nanopartículas de insulina liofilizadas con manitol; (g) imagen de polvo de nanopartículas de insulina secadas por aspersión sin manitol; (h) imagen de polvo de nanopartículas de insulina secadas por aspersión con manitol.
Durante la liofilización, el manitol actúa como crioprotector, manteniendo las NP en una forma amorfa y evitando daños por cristales de hielo19. Por el contrario, no hay un paso de congelación durante el secado por aspersión. Por lo tanto, no se requiere manitol en este método. De hecho, las NP secadas por aspersión sin manitol produjeron NP más finas como se describió anteriormente. Sin embargo, el manitol todavía puede actuar como un relleno en el proceso de secado por aspersión para dar a las NP una estructura más esférica20 (Fig. 2d), lo que ayuda a obtener un comportamiento de liberación uniforme de dichas NP encapsuladas. Además, está claro que se pueden detectar algunas partículas grandes en las NP de insulina liofilizadas y secadas por aspersión que contienen manitol (Fig. 2b,d), lo que puede deberse a la acumulación de manitol en el núcleo de la partícula junto con la insulina encapsulada. Para.Capa de quitosano.Cabe destacar que en este estudio, para asegurar que la estructura esférica permanezca intacta después de la deshidratación, la proporción de manitol y quitosano se mantiene en 5:1, de modo que una gran cantidad de relleno también puede agrandar el tamaño de partícula de las NP secas.
La espectroscopia de reflexión total atenuada por infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR-ATR) caracterizó la mezcla física de insulina libre, quitosano, quitosano, TPP e insulina. Todas las nanopartículas deshidratadas se caracterizaron mediante espectroscopia FTIR-ATR. Cabe destacar que se observaron intensidades de banda de 1641, 1543 y 1412 cm-1 en las nanopartículas encapsuladas liofilizadas con manitol y en las nanopartículas secadas por aspersión con y sin manitol (Fig. 3). Como se informó previamente, estos aumentos en la fuerza se asociaron con la reticulación entre el quitosano, el TPP y la insulina. La investigación de la interacción entre el quitosano y la insulina mostró que en los espectros FTIR de nanopartículas de quitosano cargadas con insulina, la banda del quitosano se superpuso con la de la insulina, aumentando la intensidad del carbonilo (1641 cm-1) y la banda de amina (1543 cm-1). Los grupos tripolifosfato del TPP están unidos a grupos amonio en quitosano, formando una banda a 1412 cm-1.
Espectros FTIR-ATR de insulina libre, quitosano, mezclas físicas de quitosano/TPP/insulina y NPs deshidratadas por diferentes métodos.
Además, estos resultados son consistentes con los mostrados en SEM, que mostraron que las NP encapsuladas permanecieron intactas tanto al ser pulverizadas como liofilizadas con manitol, pero en ausencia de manitol, solo el secado por pulverización produjo partículas encapsuladas. Por el contrario, los resultados espectrales FTIR-ATR de las NP liofilizadas sin manitol fueron muy similares a la mezcla física de quitosano, TPP e insulina. Este resultado indica que los enlaces cruzados entre el quitosano, el TPP y la insulina ya no están presentes en las NP liofilizadas sin manitol. La estructura de las NP se destruyó durante la liofilización sin crioprotector, lo que se puede observar en los resultados de SEM (Fig. 2a). Con base en la morfología y los resultados de FTIR de las NP de insulina deshidratadas, solo se utilizaron NP liofilizadas, pulverizadas y sin manitol para los experimentos de reconstitución y NP sin manitol debido a la descomposición de las NP sin manitol. Durante la deshidratación. discutir.
La deshidratación se utiliza para el almacenamiento a largo plazo y el reprocesamiento en otras formulaciones. La capacidad de las NP secas para reconstituirse después del almacenamiento es fundamental para su uso en diferentes formulaciones, como tabletas y películas. Notamos que el tamaño de partícula promedio de las NP de insulina secadas por aspersión en ausencia de manitol aumentó solo ligeramente después de la reconstitución. Por otro lado, el tamaño de partícula de las nanopartículas de insulina secadas por aspersión y liofilizadas con manitol aumentó significativamente (Tabla 1). El PDI y el EE no cambiaron significativamente (p > 0,05) después de la recombinación de todas las NP en este estudio (Tabla 1). Este resultado indica que la mayoría de las partículas permanecieron intactas después de la redisolción. Sin embargo, la adición de manitol resultó en una carga de insulina muy reducida de las nanopartículas de manitol liofilizadas y secadas por aspersión (Tabla 1). Por el contrario, el contenido de carga de insulina de las NP secadas por aspersión sin manitol se mantuvo igual que antes (Tabla 1).
Es bien sabido que la carga de nanopartículas es crítica cuando se utilizan para fines de administración de fármacos. Para las NP con cargas bajas, se requieren cantidades muy grandes de material para alcanzar el umbral terapéutico. Sin embargo, la alta viscosidad de tales altas concentraciones de NP conduce a inconvenientes y dificultades en la administración oral y formulaciones inyectables, respectivamente 22. Además, las NP de insulina también se pueden utilizar para hacer comprimidos y biopelículas viscosas23, 24, lo que requiere el uso de grandes cantidades de NP a niveles de carga bajos, lo que da como resultado comprimidos grandes y biopelículas gruesas que no son adecuadas para aplicaciones orales. Por lo tanto, las NP deshidratadas con alta carga de insulina son muy deseables. Nuestros resultados sugieren que la alta carga de insulina de las NP secadas por aspersión sin manitol puede ofrecer muchas ventajas atractivas para estos métodos de administración alternativos.
Todas las NP deshidratadas se mantuvieron en el refrigerador durante tres meses. Los resultados de SEM mostraron que la morfología de todas las NP deshidratadas no cambió significativamente durante el almacenamiento de tres meses (Fig. 4). Después de la reconstitución en agua, todas las NP mostraron una ligera disminución en EE y liberaron aproximadamente una pequeña cantidad (~ 5%) de insulina durante el período de almacenamiento de tres meses (Tabla 2). Sin embargo, el tamaño de partícula promedio de todas las nanopartículas aumentó. El tamaño de partícula de las NP secadas por aspersión sin manitol aumentó a 525 nm, mientras que el de las NP secadas por aspersión y liofilizadas con manitol aumentó a 872 y 921 nm, respectivamente (Tabla 2).
Morfología de diferentes nanopartículas de insulina deshidratadas almacenadas durante tres meses: (a) imagen SEM de nanopartículas de insulina liofilizadas con manitol; (b) imagen SEM de nanopartículas de insulina secadas por aspersión sin manitol; (c) imágenes SEM sin manitol de nanopartículas de insulina secadas por aspersión.
Además, se observaron precipitados en las nanopartículas de insulina reconstituidas secadas por aspersión con manitol y liofilizadas (Fig. S2). Esto puede deberse a que las partículas grandes no se suspenden adecuadamente en el agua. Todos los resultados anteriores demuestran que la técnica de secado por aspersión puede proteger a las nanopartículas de insulina de la deshidratación y que se pueden obtener altas cargas de nanopartículas de insulina sin ningún relleno o crioprotector.
La retención de insulina se probó en un medio de pH = 2,5 con pepsina, tripsina y α-quimotripsina para demostrar la capacidad protectora de las NP contra la digestión enzimática después de la deshidratación. La retención de insulina de las NP deshidratadas se comparó con la de las NP recién preparadas, y la insulina libre se utilizó como control negativo. En este estudio, la insulina libre mostró una rápida eliminación de insulina en 4 h en los tres tratamientos enzimáticos (Fig. 5a-c). Por el contrario, las pruebas de eliminación de insulina de las NP liofilizadas con manitol y las NP secadas por aspersión con o sin manitol mostraron una protección significativamente mayor de estas NP contra la digestión enzimática, que fue similar a la de las NP de insulina recién preparadas (figura 1).5a-c). Con la ayuda de nanopartículas en pepsina, tripsina y α-quimotripsina, más del 50%, 60% y 75% de la insulina se pudo proteger en 4 h, respectivamente (Fig. 5a–c). Esta capacidad protectora de la insulina puede aumentar la probabilidad de una mayor absorción de insulina en el torrente sanguíneo25. Estos resultados sugieren que el secado por aspersión con o sin manitol y la liofilización con manitol pueden preservar la capacidad protectora de la insulina de las NP después de la deshidratación.
Comportamiento de protección y liberación de las nanopartículas de insulina deshidratadas: (a) protección de la insulina en solución de pepsina; (b) protección de la insulina en solución de tripsina; (c) protección de la insulina por solución de α-quimotripsina; (d) Comportamiento de liberación de las nanopartículas deshidratadas en solución de pH = 2,5; (e) Comportamiento de liberación de las nanopartículas deshidratadas en solución de pH = 6,6; (f) Comportamiento de liberación de las nanopartículas deshidratadas en solución de pH = 7,0.
Las nanopartículas de insulina secas recién preparadas y reconstituidas se incubaron en varios tampones (pH = 2,5, 6,6, 7,0) a 37 °C, simulando el entorno de pH del estómago, el duodeno y el intestino delgado superior, para examinar el efecto de la insulina sobre la resistencia a la insulina. Comportamiento de liberación en diferentes entornos. Fragmento del tracto gastrointestinal. A pH = 2,5, las NP cargadas con insulina y las NP de insulina secas resolubilizadas mostraron una liberación inicial repentina dentro de la primera hora, seguida de una liberación lenta durante las siguientes 5 horas (Fig. 5d). Esta liberación rápida al principio es muy probablemente el resultado de una rápida desorción superficial de moléculas de proteína que no están completamente inmovilizadas en la estructura interna de la partícula. A pH = 6,5, las NP cargadas con insulina y las NP de insulina secas reconstituidas mostraron una liberación suave y lenta durante 6 h, ya que el pH de la solución de prueba fue similar al de la solución preparada con NP (Fig. 5e). A pH = 7, las NP fueron inestables y se descompusieron casi por completo dentro de las primeras dos horas (Fig. 5f). Esto se debe a que la desprotonación del quitosano ocurre a un pH más alto, lo que resulta en una red de polímero menos compacta y la liberación de insulina cargada.
Además, las nanopartículas de insulina secadas por aspersión sin manitol mostraron un perfil de liberación más rápido que las otras nanopartículas deshidratadas (Fig. 5d–f). Como se describió anteriormente, las nanopartículas de insulina reconstituidas secadas sin manitol mostraron el tamaño de partícula más pequeño. Las partículas pequeñas proporcionan una mayor área de superficie, por lo que la mayor parte del fármaco relevante estará en o cerca de la superficie de la partícula, lo que da como resultado una liberación rápida del fármaco26.
La citotoxicidad de las NP se investigó mediante el ensayo MTT. Como se muestra en la Figura S4, se encontró que todas las NP deshidratadas no tenían un efecto significativo en la viabilidad celular en concentraciones de 50 a 500 μg/ml, lo que sugiere que todas las NP deshidratadas se pueden usar de manera segura para alcanzar la ventana terapéutica.
El hígado es el principal órgano a través del cual la insulina ejerce sus funciones fisiológicas. Las células HepG2 son una línea celular de hepatoma humano comúnmente utilizada como modelo de captación de hepatocitos in vitro. Aquí, las células HepG2 se utilizaron para evaluar la captación celular de NP deshidratadas mediante métodos de liofilización y secado por aspersión. La captación celular por escaneo láser confocal utilizando citometría de flujo y visión después de varias horas de incubación con insulina FITC libre a una concentración de 25 μg/mL, NP cargadas con insulina FITC recién preparadas y NP cargadas con insulina FITC deshidratadas a concentraciones iguales de insulina. Se realizaron observaciones de microscopía cuantitativa (CLSM). Las NP liofilizadas sin manitol se destruyeron durante la deshidratación y no se evaluaron en esta prueba. Las intensidades de fluorescencia intracelular de las NP cargadas con insulina recién preparadas, las NP liofilizadas con manitol y las NP secadas por aspersión con y sin manitol (Fig. 6a) fueron 4,3, 2,6, 2,4 y 4,1 veces mayor que las libres.Grupo FITC-insulina, respectivamente (Fig. 6b).Estos resultados sugieren que la insulina encapsulada es más potente en la captación celular que la insulina libre, principalmente debido al menor tamaño de las nanopartículas cargadas de insulina producidas en el estudio.
Captación de células HepG2 después de 4 h de incubación con NP recién preparadas y NP deshidratadas: (a) Distribución de la captación de insulina FITC por las células HepG2.(b) Media geométrica de las intensidades de fluorescencia analizadas por citometría de flujo (n = 3), *P < 0,05 en comparación con la insulina libre.
Asimismo, las imágenes CLSM mostraron que las intensidades de fluorescencia FITC de las NP recién preparadas cargadas con insulina FITC y las NP secadas por aspersión cargadas con insulina FITC (sin manitol) fueron mucho más fuertes que las de las otras muestras (Fig. 6a). Además, con la adición de manitol, la mayor viscosidad de la solución aumentó la resistencia a la captación celular, lo que resultó en una disminución de la proliferación de insulina. Estos resultados sugieren que las NP secadas por aspersión sin manitol exhibieron la mayor eficiencia de captación celular porque su tamaño de partícula fue menor que el de las NP liofilizadas después de la redisolución.
El quitosano (peso molecular promedio 100 KDa, 75–85% desacetilado) se adquirió de Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canadá). El tripolifosfato de sodio (TPP) se adquirió de VWR (Radnor, Pensilvania, EE. UU.). La insulina humana recombinante utilizada en este estudio fue de Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.). La insulina humana marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) y el diclorhidrato de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se adquirieron de Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canadá). La línea celular HepG2 se obtuvo de ATCC (Manassas, Virginia, EE. UU.). Todos los demás reactivos fueron de grado analítico o cromatográfico.
Prepare una solución de CS de 1 mg/ml disolviéndola en agua bidestilada (agua bidestilada) con ácido acético al 0,1 %. Prepare soluciones de TPP e insulina de 1 mg/ml disolviéndolas en agua bidestilada y ácido acético al 0,1 %, respectivamente. La preemulsión se preparó con un homogeneizador de alta velocidad Polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, EE. UU.). El proceso de preparación es el siguiente: primero, se añaden 2 ml de solución de TPP a 4 ml de solución de insulina y la mezcla se agita durante 30 min hasta que se mezcla completamente. Luego, la solución mezclada se añade gota a gota a la solución de CS mediante una jeringa con agitación a alta velocidad (10 000 rpm). Las mezclas se mantienen con agitación a alta velocidad (15 000 rpm) en un baño de hielo durante 30 min y se ajusta el pH para obtener nanopartículas de insulina reticuladas. Para homogeneizar aún más y reducir el tamaño de partícula de las nanopartículas de insulina, se sonican. durante 30 minutos más en un baño de hielo utilizando un sonicador tipo sonda (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Alemania).
Las NPS de insulina se analizaron para determinar el diámetro promedio Z, el índice de polidispersidad (PDI) y el potencial zeta mediante mediciones de dispersión dinámica de luz (DLS) con un Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Austria) diluyéndolas en agua DD a 25 °C. La morfología y la distribución del tamaño se caracterizaron con un microscopio electrónico de transmisión (TEM) Hitachi H7600 (Hitachi, Tokio, Japón) y las imágenes se analizaron posteriormente con el software de imágenes Hitachi (Hitachi, Tokio, Japón). Para evaluar la eficiencia de encapsulación (EE) y la capacidad de carga (LC) de las NP de insulina, las NP se pipetearon en tubos de ultrafiltración con un corte de peso molecular de 100 kDa y se centrifugaron a 500 xg durante 30 min. La insulina no encapsulada en el filtrado se cuantificó con un sistema HPLC Agilent Serie 1100 (Agilent, Santa Clara, California, EE. UU.) que consta de una bomba cuaternaria, un muestreador automático, Calentador de columna y detector DAD. La insulina se analizó mediante una columna C18 (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, EE. UU.) y se detectó a 214 nm. La fase móvil fue acetonitrilo y agua, conteniendo 0,1% TFA, relaciones de gradiente de 10/90 a 100/0, y funcionó durante 10 minutos. La fase móvil se bombeó a un caudal de 1,0 ml/min. La temperatura de la columna se ajustó a 20 °C. Calcule los porcentajes de EE y LC utilizando las ecuaciones (1) y (2).
Se probaron varias proporciones de CS/insulina que oscilaban entre 2,0 y 4,0 para optimizar las NP de insulina. Se agregaron diferentes cantidades de solución de CS durante la preparación, mientras que la mezcla de insulina/TPP se mantuvo constante. Las NP de insulina se prepararon en el rango de pH de 4,0 a 6,5 ​​controlando cuidadosamente el pH de la mezcla después de agregar todas las soluciones (insulina, TPP y CS). El EE y el tamaño de partícula de las nanopartículas de insulina se evaluaron a diferentes valores de pH y proporciones de masa de CS/insulina para optimizar la formación de NP de insulina.
Las nanopartículas de insulina optimizadas se colocaron en un recipiente de aluminio y se cubrieron con un tejido apretado con cinta adhesiva. Posteriormente, los recipientes roscados se colocaron en un liofilizador Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, EE. UU.) equipado con un secador de bandejas. La temperatura y la presión de vacío se ajustaron a -10 °C, 0,350 Torr durante las primeras 2 h, y 0 °C y 0,120 Torr durante las 22 h restantes de las 24 h para obtener nanopartículas de insulina secas.
Se utilizó el secador por pulverización Buchi Mini B-290 (BÜCHI, Flawil, Suiza) para generar insulina encapsulada. Los parámetros de secado seleccionados fueron: temperatura 100 °C, flujo de alimentación 3 L/min y flujo de gas 4 L/min.
Las nanopartículas de insulina antes y después de la deshidratación se caracterizaron mediante espectroscopia FTIR-ATR. Las nanopartículas deshidratadas, así como la insulina libre y el quitosano, se analizaron utilizando un espectrofotómetro FTIR Spectrum 100 (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, EE. UU.) equipado con un accesorio de muestreo ATR universal (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, EE. UU.). Los promedios de señal se obtuvieron a partir de 16 escaneos a una resolución de 4 cm2 en el rango de frecuencia de 4000-600 cm2.
La morfología de las nanopartículas de insulina secas se evaluó mediante imágenes de SEM de nanopartículas de insulina liofilizadas y pulverizadas, capturadas con un microscopio electrónico de barrido de haz de iones enfocado (FIB-SEM) Helios NanoLab 650 (FEI, Hillsboro, Oregón, EE. UU.). El parámetro principal utilizado fue un voltaje de 5 keV y una corriente de 30 mA.
Todas las nanopartículas de insulina deshidratadas se redisolvieron en agua dd. El tamaño de partícula, PDI, EE y LC se analizaron nuevamente utilizando el mismo método mencionado anteriormente para evaluar su calidad después de la deshidratación. La estabilidad de las nanopartículas de anhidroinsulina también se midió probando las propiedades de las nanopartículas después de un almacenamiento prolongado. En este estudio, todas las nanopartículas después de la deshidratación se almacenaron en el refrigerador durante tres meses. Después de tres meses de almacenamiento, las nanopartículas se analizaron para determinar el tamaño de partícula morfológica, PDI, EE y LC.
Disolver 5 mL de NP reconstituidas en 45 mL que contengan fluido gástrico simulado (pH 1,2, que contiene 1% de pepsina), fluido intestinal (pH 6,8, que contiene 1% de tripsina) o solución de quimotripsina (100 g/mL, en tampón fosfato, pH 7,8) para evaluar la eficacia de la insulina en la protección de las NP después de la deshidratación. Se incubaron a 37 °C con una velocidad de agitación de 100 rpm. Se recolectaron 500 μL de la solución en diferentes puntos de tiempo y se determinó la concentración de insulina por HPLC.
El comportamiento de liberación in vitro de nanopartículas de insulina recién preparadas y deshidratadas se analizó mediante el método de la bolsa de diálisis (punto de corte de peso molecular de 100 kDa, Spectra Por Inc.). Las nanopartículas secas recién preparadas y reconstituidas se dializaron en fluidos a pH 2,5, pH 6,6 y pH 7,0 (solución salina tamponada con fosfato 0,1 M, PBS) para simular el entorno de pH del estómago, el duodeno y el intestino delgado superior, respectivamente. Todas las muestras se incubaron a 37 °C con agitación continua a 200 rpm. Aspire el fluido fuera de la bolsa de diálisis de 5 ml en los siguientes tiempos: 0,5, 1, 2, 3, 4 y 6 h, y reponga inmediatamente el volumen con dializado fresco. La contaminación por insulina en el fluido se analizó mediante HPLC y la velocidad de liberación de insulina de las nanopartículas se calculó a partir de la relación entre la insulina libre liberada y la insulina total encapsulada en las nanopartículas. (Ecuación 3).
Las células de la línea celular de carcinoma hepatocelular humano HepG2 se cultivaron en placas de 60 mm de diámetro utilizando medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía 10% de suero bovino fetal, 100 UI/ml de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina29. Los cultivos se mantuvieron a 37 °C, 95% de humedad relativa y 5% de CO2. Para los ensayos de captación, las células HepG2 se sembraron a 1 × 105 células/ml en un sistema de portaobjetos de cámara Nunc Lab-Tek de 8 pocillos (Thermo Fisher, NY, EE. UU.). Para los ensayos de citotoxicidad, se sembraron en placas de 96 pocillos (Corning, NY, EE. UU.) a una densidad de 5 × 104 células/ml.
El ensayo MTT se utilizó para evaluar la citotoxicidad de las nanopartículas de insulina recién preparadas y deshidratadas30. Las células HepG2 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 × 104 células/ml y se cultivaron durante 7 días antes de la prueba. Las nanopartículas de insulina se diluyeron a varias concentraciones (50 a 500 μg/ml) en medio de cultivo y luego se administraron a las células. Después de 24 horas de incubación, las células se lavaron 3 veces con PBS y se incubaron con medio que contenía 0,5 mg/ml de MTT durante 4 horas más. La citotoxicidad se evaluó midiendo la reducción enzimática del MTT de tetrazolio amarillo a formazán púrpura a 570 nm utilizando un lector de placas espectrofotómetro Tecan infinite M200 pro (Tecan, Männedorf, Suiza).
La eficiencia de captación celular de las nanopartículas se evaluó mediante microscopía confocal de barrido láser y análisis de citometría de flujo. Cada pocillo del sistema de portaobjetos de cámara Nunc Lab-Tek se trató con insulina FITC libre, nanopartículas cargadas con insulina FITC y se reconstituyeron 25 μg/ml de nanopartículas deshidratadas con insulina FITC a la misma concentración y se incubaron durante 4 horas. Las células se lavaron 3 veces con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4%. Los núcleos se tiñeron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). La localización de la insulina se observó utilizando un microscopio confocal de barrido láser/dos fotones Olympus FV1000 (Olympus, Shinjuku City, Tokio, Japón). Para el análisis de citometría de flujo, se utilizaron las mismas concentraciones de 10 μg/ml de insulina FITC libre, nanopartículas cargadas con insulina FITC y Las nanopartículas de insulina FITC deshidratadas y resolubilizadas se agregaron a placas de 96 pocillos sembradas con células HepG2 y se incubaron durante 4 horas. Después de 4 horas de incubación, las células se retiraron y se lavaron 3 veces con FBS. Se analizaron 5 × 104 células por muestra mediante un citómetro de flujo BD LSR II (BD, Franklin Lakes, Nueva Jersey, Estados Unidos).
Todos los valores se expresan como media ± desviación estándar. Las comparaciones entre todos los grupos se evaluaron mediante ANOVA de una vía o prueba t de IBM SPSS Statistics 26 para Mac (IBM, Endicott, Nueva York, EE. UU.) y p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
Este estudio demuestra la flexibilidad y la capacidad del secado por aspersión para deshidratar nanopartículas reticuladas de quitosano/TPP/insulina con una mejor reconstitución en comparación con los métodos estándar de liofilización que utilizan agentes de carga o crioprotectores. Las nanopartículas de insulina optimizadas arrojaron un tamaño de partícula promedio de 318 nm y una eficiencia de encapsulación del 99,4 %. Los resultados de SEM y FTIR después de la deshidratación mostraron que la estructura esférica se mantuvo solo en las nanopartículas secadas por aspersión con y sin manitol y liofilizadas con manitol, pero las nanopartículas liofilizadas sin manitol se descompusieron durante la deshidratación. En la prueba de capacidad de reconstitución, las nanopartículas de insulina secadas por aspersión sin manitol mostraron el tamaño de partícula promedio más pequeño y la carga más alta tras la reconstitución. Los comportamientos de liberación de todas estas nanopartículas deshidratadas mostraron que se liberaron rápidamente en soluciones de pH = 2,5 y pH = 7, y muy estables en soluciones de pH = 6,5. En comparación con otras nanopartículas redisueltas Las nanopartículas deshidratadas, las nanopartículas secadas por aspersión sin manitol mostraron la liberación más rápida. Este resultado es consistente con el observado en el ensayo de captación celular, ya que las nanopartículas secadas por aspersión en ausencia de manitol mantuvieron casi por completo la eficiencia de captación celular de las nanopartículas recién preparadas. Estos resultados sugieren que las nanopartículas de insulina secas preparadas mediante secado por aspersión sin manitol son las más adecuadas para su posterior procesamiento en otras formas de dosificación anhidras, como tabletas orales o películas bioadhesivas.
Debido a cuestiones de propiedad intelectual, los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual no están disponibles públicamente, pero están disponibles a pedido razonable de los respectivos autores.
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