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Las nanopartículas de insulina (NP) con alto contenido de carga han encontrado diferentes aplicaciones en diferentes formas de dosificación. Este trabajo tiene como objetivo evaluar el efecto de los procesos de liofilización y secado por aspersión en la estructura de nanopartículas de quitosano cargadas con insulina, con o sin manitol como crioprotector. También evaluamos la calidad de estas nanopartículas redisolviéndolas. Antes de la deshidratación, el tamaño de partícula de las nanopartículas reticuladas de quitosano/tripolifosfato de sodio/insulina se optimizó a 318 nm, el PDI fue de 0,18, la eficiencia de encapsulación fue del 99,4% y la carga fue del 25,01%. Después de la reconstitución, todas las nanopartículas, excepto las producidas por un método de liofilización sin el uso de manitol, mantuvieron su estructura de partícula esférica. En comparación con las nanopartículas que contienen manitol deshidratadas por aspersión, las nanopartículas secadas por aspersión sin manitol también mostraron el tamaño de partícula medio más pequeño (376 nm). y el mayor contenido de carga (25,02%) con una tasa de encapsulación similar (98,7%) y PDI (0,20) mediante técnicas de secado o liofilización. Las nanopartículas secas por secado por pulverización sin manitol también dieron como resultado la liberación más rápida de insulina y la mayor eficiencia de captación celular. Este trabajo muestra que el secado por pulverización puede deshidratar nanopartículas de insulina sin necesidad de crioprotectores en comparación con los métodos convencionales de liofilización, creando una mayor capacidad de carga, menores requisitos de aditivos y costos operativos, una ventaja significativa.
Desde su descubrimiento en 19221,2,3, la insulina y sus preparaciones farmacéuticas han salvado la vida de pacientes con diabetes tipo 1 (DM1) y diabetes tipo 2 (DM2). Sin embargo, debido a sus propiedades como proteína de alto peso molecular, la insulina se agrega fácilmente, se degrada por enzimas proteolíticas y se elimina por el efecto de primer paso. Las personas diagnosticadas con diabetes tipo 1 necesitan inyecciones de insulina por el resto de sus vidas. Muchos pacientes diagnosticados inicialmente con diabetes tipo 2 también requieren inyecciones de insulina a largo plazo. Las inyecciones diarias de insulina son una fuente importante de dolor y malestar diarios para estas personas, con efectos negativos en la salud mental. Como resultado, otras formas de administración de insulina que causan menos molestias, como la administración oral de insulina, se están estudiando ampliamente5 ya que tienen el potencial de restaurar la calidad de vida de aproximadamente 5 mil millones de personas con diabetes en todo el mundo.
La tecnología de nanopartículas ha proporcionado un avance significativo en los intentos de tomar insulina oral4,6,7. Una que encapsula y protege eficazmente la insulina de la degradación para una administración dirigida a sitios corporales específicos. Sin embargo, el uso de formulaciones de nanopartículas tiene varias limitaciones, principalmente debido a problemas de estabilidad de las suspensiones de partículas. Puede ocurrir cierta agregación durante el almacenamiento, lo que reduce la biodisponibilidad de las nanopartículas cargadas con insulina8. Además, también se debe considerar la estabilidad química de la matriz polimérica de las nanopartículas y la insulina para garantizar la estabilidad de las nanopartículas de insulina (NP). Actualmente, la tecnología de liofilización es el estándar de oro para crear NP estables y prevenir cambios no deseados durante el almacenamiento9.
Sin embargo, la liofilización requiere la adición de crioprotectores para evitar que la estructura esférica de las nanopartículas se vea afectada por la tensión mecánica de los cristales de hielo. Esto reduce significativamente la cantidad de nanopartículas de insulina que se pueden incorporar después de la liofilización, ya que el crioprotector ocupa la mayor parte del peso. Por lo tanto, las nanopartículas de insulina producidas suelen resultar inadecuadas para la fabricación de formulaciones en polvo seco, como comprimidos y películas orales, debido a la necesidad de grandes cantidades de nanopartículas secas para alcanzar el rango terapéutico de la insulina.
El secado por pulverización es un proceso industrial conocido y económico para producir polvos secos a partir de fases líquidas en la industria farmacéutica10,11. El control sobre el proceso de formación de partículas permite una encapsulación adecuada de varios compuestos bioactivos12, 13. Además, se ha convertido en una técnica eficaz para la preparación de proteínas encapsuladas para administración oral. Durante el secado por pulverización, el agua se evapora muy rápidamente, lo que ayuda a mantener baja la temperatura del núcleo de la partícula11,14, lo que permite su aplicación para encapsular componentes sensibles al calor. Antes del secado por pulverización, el material de recubrimiento debe homogeneizarse completamente con la solución que contiene los ingredientes encapsulados11,14. A diferencia de la liofilización, la homogeneización antes de la encapsulación en el secado por pulverización mejora la eficiencia de encapsulación durante la deshidratación. Dado que el proceso de encapsulación por secado por pulverización no requiere crioprotectores, el secado por pulverización puede utilizarse para producir NP secas con un alto contenido de carga.
Este estudio describe la producción de nanopartículas cargadas con insulina mediante la reticulación de quitosano y tripolifosfato de sodio utilizando un método de gel iónico. La gelificación iónica es un método de preparación que permite la producción de nanopartículas a través de interacciones electrostáticas entre dos o más especies iónicas bajo ciertas condiciones. Se utilizaron técnicas de liofilización y secado por aspersión para deshidratar las nanopartículas reticuladas de quitosano/tripolifosfato de sodio/insulina optimizadas. Tras la deshidratación, se analizó su morfología mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Su capacidad de recombinación se evaluó midiendo su distribución de tamaño, carga superficial, índice de polidispersidad (PDI), eficiencia de encapsulación y contenido de carga. La calidad de las nanopartículas resuspendidas producidas mediante diferentes métodos de deshidratación también se evaluó comparando su protección contra la insulina, su comportamiento de liberación y su eficacia de captación celular.
El pH de la solución mixta y la proporción de quitosano e insulina son dos factores clave que afectan el tamaño de partícula y la eficiencia de encapsulación (EE) de las NP finales, ya que afectan directamente el proceso de gelificación ionotrópica. Se demostró que el pH de la solución mixta está altamente correlacionado con el tamaño de partícula y la eficiencia de encapsulación (Fig. 1a). Como se muestra en la Fig. 1a, a medida que el pH aumentó de 4,0 a 6,0, el tamaño promedio de partícula (nm) disminuyó y la EE aumentó significativamente, mientras que cuando el pH aumentó a 6,5, el tamaño promedio de partícula comenzó a aumentar y la EE se mantuvo sin cambios. A medida que aumenta la proporción de quitosano a insulina, el tamaño promedio de partícula también aumenta. Además, no se observó ningún cambio en la EE cuando las nanopartículas se prepararon con una proporción de masa de quitosano/insulina superior a 2,5:1 (p/p) (Fig. 1b). Por lo tanto, las condiciones óptimas de preparación en este estudio (pH 6,0, proporción de masa de quitosano/insulina de 2,5:1) Se utilizaron para preparar nanopartículas cargadas con insulina para su posterior estudio. Bajo estas condiciones de preparación, el tamaño promedio de partícula de las nanopartículas de insulina se optimizó a 318 nm (Fig. 1c), el PDI fue de 0,18, la eficiencia de encapsulación fue del 99,4 %, el potencial zeta fue de 9,8 mV y la carga de insulina fue del 25,01 % (m/m). Según los resultados de la microscopía electrónica de transmisión (TEM), las nanopartículas optimizadas eran aproximadamente esféricas y discretas con un tamaño relativamente uniforme (Fig. 1d).
Optimización de parámetros de nanopartículas de insulina: (a) efecto del pH sobre el diámetro medio y la eficiencia de encapsulación (EE) de nanopartículas de insulina (preparadas con una relación de masa de 5:1 de quitosano e insulina); (b) influencia de la relación de masa de quitosano e insulina sobre el diámetro medio y la eficiencia de encapsulación (EE) de nanopartículas de insulina (preparadas a pH 6); (c) distribución del tamaño de partícula de nanopartículas de insulina optimizadas; (d) micrografía TEM de nanopartículas de insulina optimizadas.
Es bien sabido que el quitosano es un polielectrolito débil con un pKa de 6,5. Está cargado positivamente en medios ácidos porque su grupo amino principal está protonado por iones de hidrógeno15. Por lo tanto, se usa a menudo como portador para encapsular macromoléculas cargadas negativamente. En este estudio, se usó quitosano para encapsular insulina con un punto isoeléctrico de 5,3. Dado que el quitosano se usa como material de recubrimiento, con el aumento de su proporción, el espesor de la capa exterior de las nanopartículas aumenta correspondientemente, lo que resulta en un tamaño de partícula promedio mayor. Además, niveles más altos de quitosano pueden encapsular más insulina. En nuestro caso, la EE fue más alta cuando la proporción de quitosano e insulina alcanzó 2,5:1, y no hubo un cambio significativo en la EE cuando la proporción siguió aumentando.
Además de la proporción de quitosano e insulina, el pH también desempeñó un papel crucial en la preparación de NP. Gan et al. 17 estudiaron el efecto del pH en el tamaño de partícula de nanopartículas de quitosano. Encontraron una disminución continua en el tamaño de partícula hasta que el pH alcanzó 6,0, y se observó un aumento significativo en el tamaño de partícula a pH > 6,0, lo cual es consistente con nuestras observaciones. Este fenómeno se debe al hecho de que con el aumento del pH, la molécula de insulina adquiere una carga superficial negativa, favoreciendo así las interacciones electrostáticas con el complejo quitosano/tripolifosfato de sodio (TPP), lo que resulta en un tamaño de partícula pequeño y una alta EE. Sin embargo, cuando el pH se ajustó a 6,5, los grupos amino en el quitosano se desprotonaron, lo que resultó en el plegamiento del quitosano. Por lo tanto, un pH alto resulta en una menor exposición de los iones amino al TPP y la insulina, lo que resulta en una menor reticulación, un mayor tamaño de partícula promedio final y una menor EE.
El análisis de las propiedades morfológicas de las nanopartículas liofilizadas y secadas por pulverización puede guiar la selección de mejores técnicas de deshidratación y formación de polvo. El método preferido debe proporcionar estabilidad del fármaco, forma de partícula uniforme, alta carga de fármaco y buena solubilidad en la solución original. En este estudio, para comparar mejor las dos técnicas, se utilizaron nanopartículas de insulina con y sin 1% de manitol durante la deshidratación. El manitol se utiliza como agente de carga o crioprotector en diversas formulaciones de polvo seco para liofilización y secado por pulverización. Para las nanopartículas de insulina liofilizadas sin manitol, como se muestra en la Figura 2a, se observó una estructura de polvo altamente porosa con superficies grandes, irregulares y rugosas bajo microscopía electrónica de barrido (MEB). Se detectaron pocas partículas discretas en el polvo después de la deshidratación (Fig. 2e). Estos resultados indicaron que la mayoría de las nanopartículas se descompusieron durante la liofilización sin ningún crioprotector. Para las nanopartículas de insulina liofilizadas y secadas por pulverización que contienen 1% de manitol, se observaron nanopartículas esféricas con superficies lisas. Se observaron superficies (Fig. 2b,d,f,h). Las nanopartículas de insulina secadas por pulverización sin manitol permanecieron esféricas pero arrugadas en la superficie (Fig. 2c). Las superficies esféricas y arrugadas se discuten más adelante en el comportamiento de liberación y las pruebas de captación celular. Con base en la apariencia visible de las NP secas, tanto las NP secadas por pulverización sin manitol como las NP liofilizadas y secadas por pulverización con manitol produjeron polvos finos de NP (Fig. 2f,g,h). Cuanto mayor sea el área de superficie entre las superficies de las partículas, mayor será la solubilidad y, por lo tanto, mayor será la tasa de liberación.
Morfología de diferentes NP de insulina deshidratadas: (a) Imagen SEM de NP de insulina liofilizadas sin manitol; (b) Imagen SEM de NP de insulina liofilizadas con manitol; (c) Imagen SEM de NP de insulina secadas por pulverización sin manitol; (d) Imagen SEM de NP de insulina secadas por pulverización con manitol; (e) Imagen de polvo de NP de insulina liofilizadas sin manitol; (f) Imagen de NP de insulina liofilizadas con manitol; (g) Imagen de polvo de NP de insulina secadas por pulverización sin manitol; (h) Imagen de polvo de NP de insulina secadas por pulverización con manitol.
Durante la liofilización, el manitol actúa como crioprotector, manteniendo las NP en forma amorfa y evitando daños por cristales de hielo19. En contraste, no hay una etapa de congelación durante el secado por aspersión. Por lo tanto, el manitol no es necesario en este método. De hecho, las NP secadas por aspersión sin manitol produjeron NP más finas como se describió anteriormente. Sin embargo, el manitol aún puede actuar como relleno en el proceso de secado por aspersión para dar a las NP una estructura más esférica20 (Fig. 2d), lo que ayuda a obtener un comportamiento de liberación uniforme de dichas NP encapsuladas. Además, es claro que se pueden detectar algunas partículas grandes tanto en las NP de insulina liofilizadas como en las secadas por aspersión que contienen manitol (Fig. 2b,d), lo que puede deberse a la acumulación de manitol en el núcleo de la partícula junto con la insulina encapsulada. A.Capa de quitosano. Cabe destacar que en este estudio, para asegurar que la estructura esférica permanezca intacta después de la deshidratación, la proporción de manitol y quitosano se mantiene en 5:1, de modo que una gran cantidad de relleno también puede aumentar el tamaño de partícula de las NP secas.
La espectroscopia de reflexión total atenuada por transformada de Fourier infrarroja (FTIR-ATR) caracterizó la mezcla física de insulina libre, quitosano, quitosano, TPP e insulina. Todas las NP deshidratadas se caracterizaron mediante espectroscopia FTIR-ATR. Cabe destacar que se observaron intensidades de banda de 1641, 1543 y 1412 cm-1 en las NP encapsuladas liofilizadas con manitol y en las NP secadas por pulverización con y sin manitol (Fig. 3). Como se informó anteriormente, estos aumentos de fuerza se asociaron con el entrecruzamiento entre quitosano, TPP e insulina. La investigación de la interacción entre quitosano e insulina mostró que en los espectros FTIR de las nanopartículas de quitosano cargadas con insulina, la banda de quitosano se superpuso con la de insulina, aumentando la intensidad del carbonilo (1641 cm-1) y la banda de amina (1543 cm-1). Los grupos tripolifosfato de TPP están unidos a grupos amonio en quitosano, formando una banda a 1412 cm-1.
Espectros FTIR-ATR de insulina libre, quitosano, mezclas físicas de quitosano/TPP/insulina y nanopartículas deshidratadas mediante diferentes métodos.
Además, estos resultados son consistentes con los mostrados en SEM, que mostraron que las NP encapsuladas permanecieron intactas tanto cuando se rociaron como cuando se liofilizaron con manitol, pero en ausencia de manitol, solo el secado por aspersión produjo partículas encapsuladas. En contraste, los resultados espectrales FTIR-ATR de las NP liofilizadas sin manitol fueron muy similares a la mezcla física de quitosano, TPP e insulina. Este resultado indica que los enlaces cruzados entre quitosano, TPP e insulina ya no están presentes en las NP liofilizadas sin manitol. La estructura de las NP se destruyó durante el secado por aspersión sin crioprotector, lo que se puede ver en los resultados SEM (Fig. 2a). Con base en la morfología y los resultados FTIR de las NP de insulina deshidratadas, solo se utilizaron NP liofilizadas, secadas por aspersión y sin manitol para los experimentos de reconstitución y NP sin manitol debido a la descomposición de las NP sin manitol. durante la deshidratación. discutir.
La deshidratación se utiliza para el almacenamiento a largo plazo y el reprocesamiento en otras formulaciones. La capacidad de las NP secas para reconstituirse después del almacenamiento es fundamental para su uso en diferentes formulaciones, como tabletas y películas. Observamos que el tamaño promedio de partícula de las NP de insulina secadas por pulverización en ausencia de manitol aumentó solo ligeramente después de la reconstitución. Por otro lado, el tamaño de partícula de las nanopartículas de insulina secadas por pulverización y liofilizadas con manitol aumentó significativamente (Tabla 1). El PDI y el EE no cambiaron significativamente (p > 0,05) después de la recombinación de todas las NP en este estudio (Tabla 1). Este resultado indica que la mayoría de las partículas permanecieron intactas después de la redisolución. Sin embargo, la adición de manitol resultó en una carga de insulina muy reducida de las nanopartículas de manitol liofilizadas y secadas por pulverización (Tabla 1). En contraste, el contenido de carga de insulina de las NP secadas por pulverización sin manitol se mantuvo igual que antes (Tabla 1).
Es bien sabido que la carga de nanopartículas es fundamental cuando se utilizan para la administración de fármacos. Para las NP con bajas cargas, se requieren cantidades muy grandes de material para alcanzar el umbral terapéutico. Sin embargo, la alta viscosidad de concentraciones tan altas de NP genera inconvenientes y dificultades en la administración oral y en las formulaciones inyectables, respectivamente. Además, las NP de insulina también se pueden utilizar para hacer comprimidos y biopelículas viscosas, lo que requiere el uso de grandes cantidades de NP con bajos niveles de carga, lo que da como resultado comprimidos grandes y biopelículas gruesas que no son adecuadas para aplicaciones orales. Por lo tanto, las NP deshidratadas con alta carga de insulina son muy deseables. Nuestros resultados sugieren que la alta carga de insulina de las NP secadas por pulverización sin manitol puede ofrecer muchas ventajas atractivas para estos métodos de administración alternativos.
Todas las NP deshidratadas se mantuvieron en el refrigerador durante tres meses. Los resultados de SEM mostraron que la morfología de todas las NP deshidratadas no cambió significativamente durante el almacenamiento de tres meses (Fig. 4). Después de la reconstitución en agua, todas las NP mostraron una ligera disminución en EE y liberaron aproximadamente una pequeña cantidad (~5%) de insulina durante el período de almacenamiento de tres meses (Tabla 2). Sin embargo, el tamaño promedio de partícula de todas las nanopartículas aumentó. El tamaño de partícula de las NP secadas por pulverización sin manitol aumentó a 525 nm, mientras que el de las NP secadas por pulverización y liofilizadas con manitol aumentó a 872 y 921 nm, respectivamente (Tabla 2).
Morfología de diferentes nanopartículas de insulina deshidratadas almacenadas durante tres meses: (a) Imagen SEM de nanopartículas de insulina liofilizadas con manitol; (b) Imagen SEM de nanopartículas de insulina secadas por pulverización sin manitol; (c) Imágenes SEM de nanopartículas de insulina secadas por pulverización sin manitol.
Además, se observaron precipitados en las nanopartículas de insulina reconstituidas, secadas por pulverización con manitol y liofilizadas (Fig. S2). Esto puede deberse a que las partículas grandes no se suspenden adecuadamente en el agua. Todos los resultados anteriores demuestran que la técnica de secado por pulverización puede proteger las nanopartículas de insulina de la deshidratación y que se pueden obtener altas concentraciones de nanopartículas de insulina sin necesidad de rellenos ni crioprotectores.
La retención de insulina se probó en un medio de pH = 2,5 con pepsina, tripsina y α-quimotripsina para demostrar la capacidad protectora de las NP contra la digestión enzimática después de la deshidratación. La retención de insulina de las NP deshidratadas se comparó con la de las NP recién preparadas, y se utilizó insulina libre como control negativo. En este estudio, la insulina libre mostró una rápida eliminación de insulina en 4 h en los tres tratamientos enzimáticos (Fig. 5a-c). Por el contrario, la prueba de eliminación de insulina de las NP liofilizadas con manitol y las NP secadas por pulverización con o sin manitol mostró una protección significativamente mayor de estas NP contra la digestión enzimática, que fue similar a la de las NP de insulina recién preparadas (figura 1).5a-c). Con la ayuda de nanopartículas en pepsina, tripsina y α-quimotripsina, más del 50%, 60% y 75% de la insulina podría protegerse en 4 h, respectivamente (Fig. 5a–c). Esta capacidad de protección de la insulina puede aumentar la probabilidad de una mayor absorción de insulina en el torrente sanguíneo25. Estos resultados sugieren que el secado por pulverización con o sin manitol y la liofilización con manitol pueden preservar la capacidad de protección de la insulina de las NP después de la deshidratación.
Comportamiento de protección y liberación de nanopartículas de insulina deshidratadas: (a) protección de la insulina en solución de pepsina; (b) protección de la insulina en solución de tripsina; (c) protección de la insulina por solución de α-quimotripsina; (d) Comportamiento de liberación de nanopartículas deshidratadas en solución de pH = 2,5; (e) comportamiento de liberación de nanopartículas deshidratadas en solución de pH = 6,6; (f) comportamiento de liberación de nanopartículas deshidratadas en solución de pH = 7,0.
Las nanopartículas de insulina secas, recién preparadas y reconstituidas, se incubaron en varios tampones (pH = 2,5, 6,6, 7,0) a 37 °C, simulando el entorno de pH del estómago, el duodeno y la parte superior del intestino delgado, para examinar el efecto de la insulina sobre la resistencia a la insulina. Comportamiento de liberación en diferentes entornos. Fragmento del tracto gastrointestinal. A pH = 2,5, las NP cargadas con insulina y las NP de insulina seca resuspendidas mostraron una liberación inicial rápida durante la primera hora, seguida de una liberación lenta durante las siguientes 5 horas (Fig. 5d). Esta liberación rápida al principio es muy probablemente el resultado de la rápida desorción superficial de moléculas de proteína que no están completamente inmovilizadas en la estructura interna de la partícula. A pH = 6,5, las NP cargadas con insulina y las NP de insulina seca reconstituidas mostraron una liberación suave y lenta durante 6 h, ya que el pH de la solución de prueba fue similar al de la solución preparada con NP (Fig. 5e). A pH = 7, las NP fueron inestables y se descompusieron casi por completo durante las primeras dos horas (Fig. 5f). Esto se debe a que la desprotonación del quitosano ocurre a un pH más alto, lo que da como resultado una red polimérica menos compacta y la liberación de la insulina cargada.
Además, las nanopartículas de insulina secadas por pulverización sin manitol mostraron un perfil de liberación más rápido que las otras nanopartículas deshidratadas (Fig. 5d–f). Como se describió anteriormente, las nanopartículas de insulina reconstituidas secadas sin manitol mostraron el tamaño de partícula más pequeño. Las partículas pequeñas proporcionan una mayor superficie, por lo que la mayor parte del fármaco relevante estará en la superficie de la partícula o cerca de ella, lo que da como resultado una liberación rápida del fármaco26.
Se investigó la citotoxicidad de las nanopartículas mediante el ensayo MTT. Como se muestra en la Figura S4, se encontró que todas las nanopartículas deshidratadas no tenían un efecto significativo sobre la viabilidad celular en concentraciones de 50 a 500 μg/ml, lo que sugiere que todas las nanopartículas deshidratadas se pueden usar de forma segura para alcanzar la ventana terapéutica.
El hígado es el principal órgano a través del cual la insulina ejerce sus funciones fisiológicas. Las células HepG2 son una línea celular de hepatoma humano comúnmente utilizada como modelo de captación de hepatocitos in vitro. Aquí, se utilizaron células HepG2 para evaluar la captación celular de NP deshidratadas mediante liofilización y secado por aspersión. La captación celular mediante escaneo láser confocal utilizando citometría de flujo y visión después de varias horas de incubación con insulina FITC libre a una concentración de 25 μg/mL, NP cargadas con insulina FITC recién preparadas y NP cargadas con insulina FITC deshidratadas a concentraciones iguales de insulina. Se realizaron observaciones de microscopía cuantitativa (CLSM). Las NP liofilizadas sin manitol se destruyeron durante la deshidratación y no se evaluaron en esta prueba. Las intensidades de fluorescencia intracelular de las NP cargadas con insulina recién preparadas, las NP liofilizadas con manitol y las NP secadas por aspersión con y sin manitol (Fig. 6a) fueron 4,3, 2,6, 2,4 y 4,1 veces más altas que las libres.Grupo de insulina FITC, respectivamente (Fig. 6b).Estos resultados sugieren que la insulina encapsulada es más potente en la captación celular que la insulina libre, principalmente debido al menor tamaño de las nanopartículas cargadas con insulina producidas en el estudio.
Captación de células HepG2 después de 4 h de incubación con NP recién preparadas y NP deshidratadas: (a) Distribución de la captación de FITC-insulina por células HepG2. (b) Media geométrica de las intensidades de fluorescencia analizadas por citometría de flujo (n = 3), *P < 0,05 en comparación con la insulina libre.
Asimismo, las imágenes CLSM mostraron que las intensidades de fluorescencia FITC de las NP cargadas con insulina FITC recién preparadas y las NP secadas por aspersión cargadas con insulina FITC (sin manitol) fueron mucho más fuertes que las de las otras muestras (Fig. 6a). Además, con la adición de manitol, la mayor viscosidad de la solución aumentó la resistencia a la captación celular, lo que resultó en una menor proliferación de insulina. Estos resultados sugieren que las NP secadas por aspersión sin manitol exhibieron la mayor eficiencia de captación celular porque su tamaño de partícula fue menor que el de las NP liofilizadas después de la redisolución.
El quitosano (peso molecular promedio de 100 kDa, 75-85 % desacetilado) se adquirió de Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canadá). El tripolifosfato de sodio (TPP) se adquirió de VWR (Radnor, Pensilvania, EE. UU.). La insulina humana recombinante utilizada en este estudio fue de Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.). La insulina humana marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) y el diclorhidrato de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se adquirieron de Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canadá). La línea celular HepG2 se obtuvo de ATCC (Manassas, Virginia, EE. UU.). Todos los demás reactivos eran de grado analítico o cromatográfico.
Prepare una solución de CS de 1 mg/ml disolviéndola en agua bidestilada (agua DD) que contenga 0,1% de ácido acético. Prepare soluciones de TPP e insulina de 1 mg/ml disolviéndolas en agua DD y 0,1% de ácido acético, respectivamente. La preemulsión se preparó con un homogeneizador de alta velocidad Polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, EE. UU.). El proceso de preparación es el siguiente: primero, se añaden 2 ml de solución de TPP a 4 ml de solución de insulina, y la mezcla se agita durante 30 min y se mezcla completamente. Luego, la solución mezclada se añade gota a gota a la solución de CS a través de una jeringa bajo agitación a alta velocidad (10 000 rpm). Las mezclas se mantienen bajo agitación a alta velocidad (15 000 rpm) en un baño de hielo durante 30 min, y se ajustan a un cierto pH para obtener NP de insulina reticuladas. Para homogeneizar aún más y reducir el tamaño de partícula de las NP de insulina, se sonicaron. durante 30 minutos adicionales en un baño de hielo utilizando un sonicador de tipo sonda (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Alemania).
Las NPS de insulina se analizaron para determinar el diámetro promedio Z, el índice de polidispersidad (PDI) y el potencial zeta mediante mediciones de dispersión dinámica de luz (DLS) utilizando un Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Austria) diluyéndolas en agua DD a 25 °C. La morfología y la distribución del tamaño se caracterizaron mediante un microscopio electrónico de transmisión (TEM) Hitachi H7600 (Hitachi, Tokio, Japón), y las imágenes se analizaron posteriormente utilizando el software de imágenes Hitachi (Hitachi, Tokio, Japón). Para evaluar la eficiencia de encapsulación (EE) y la capacidad de carga (LC) de las NP de insulina, las NP se pipetearon en tubos de ultrafiltración con un límite de exclusión de peso molecular de 100 kDa y se centrifugaron a 500 xg durante 30 min. La insulina no encapsulada en el filtrado se cuantificó utilizando un sistema HPLC Agilent Serie 1100 (Agilent, Santa Clara, California, EE. UU.) que consta de una bomba cuaternaria, un automuestreador, Calentador de columna y detector DAD. La insulina se analizó mediante una columna C18 (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, EE. UU.) y se detectó a 214 nm. La fase móvil fue acetonitrilo y agua, que contenía 0,1 % de TFA, con relaciones de gradiente de 10/90 a 100/0, y se ejecutó durante 10 minutos. La fase móvil se bombeó a un caudal de 1,0 ml/min. La temperatura de la columna se ajustó a 20 °C. Calcule los porcentajes de EE y LC utilizando las ecuaciones (1) y (2).
Se probaron varias proporciones de CS/insulina que iban de 2,0 a 4,0 para optimizar las NP de insulina. Se añadieron diferentes cantidades de solución de CS durante la preparación, mientras que la mezcla de insulina/TPP se mantuvo constante. Las NP de insulina se prepararon en el rango de pH de 4,0 a 6,5 ​​controlando cuidadosamente el pH de la mezcla después de añadir todas las soluciones (insulina, TPP y CS). La EE y el tamaño de partícula de las nanopartículas de insulina se evaluaron a diferentes valores de pH y proporciones de masa de CS/insulina para optimizar la formación de las NP de insulina.
Las nanopartículas de insulina optimizadas se colocaron en el recipiente de aluminio y se cubrieron con tejido ajustado con cinta adhesiva. Posteriormente, los recipientes atornillados se colocaron en un liofilizador Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, EE. UU.) equipado con un secador de bandejas. La temperatura y la presión de vacío se establecieron en -10 °C, 0,350 Torr durante las primeras 2 h, y 0 °C y 0,120 Torr durante las 22 h restantes de las 24 h para obtener nanopartículas de insulina secas.
Se utilizó un secador por pulverización Buchi Mini B-290 (BÜCHI, Flawil, Suiza) para generar insulina encapsulada. Los parámetros de secado seleccionados fueron: temperatura 100 °C, caudal de alimentación 3 L/min y caudal de gas 4 L/min.
Las nanopartículas de insulina antes y después de la deshidratación se caracterizaron mediante espectroscopia FTIR-ATR. Las nanopartículas deshidratadas, así como la insulina libre y el quitosano, se analizaron utilizando un espectrofotómetro FTIR Spectrum 100 (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, EE. UU.) equipado con un accesorio de muestreo ATR universal (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, EE. UU.). Se obtuvieron promedios de señal a partir de 16 escaneos con una resolución de 4 cm2 en el rango de frecuencia de 4000-600 cm2.
La morfología de las nanopartículas de insulina secas se evaluó mediante imágenes SEM de nanopartículas de insulina liofilizadas y secadas por pulverización, capturadas con un microscopio electrónico de barrido de haz de iones focalizado (FIB-SEM) Helios NanoLab 650 (FEI, Hillsboro, Oregón, EE. UU.). Los parámetros principales utilizados fueron un voltaje de 5 keV y una corriente de 30 mA.
Todas las nanopartículas de insulina deshidratadas se redisolvieron en agua destilada. El tamaño de partícula, el PDI, el EE y el LC se analizaron nuevamente utilizando el mismo método mencionado anteriormente para evaluar su calidad después de la deshidratación. La estabilidad de las nanopartículas de anhidroinsulina también se midió analizando las propiedades de las nanopartículas después de un almacenamiento prolongado. En este estudio, todas las nanopartículas después de la deshidratación se almacenaron en el refrigerador durante tres meses. Después de tres meses de almacenamiento, se analizó el tamaño de partícula morfológico, el PDI, el EE y el LC de las nanopartículas.
Disuelva 5 ml de nanopartículas reconstituidas en 45 ml que contengan fluido gástrico simulado (pH 1,2, con 1 % de pepsina), fluido intestinal (pH 6,8, con 1 % de tripsina) o solución de quimotripsina (100 g/ml, en tampón fosfato, pH 7,8) para evaluar la eficacia de la insulina en la protección de las nanopartículas después de la deshidratación. Se incubaron a 37 °C con una velocidad de agitación de 100 rpm. Se recogieron 500 μl de la solución en diferentes momentos y se determinó la concentración de insulina mediante HPLC.
El comportamiento de liberación in vitro de nanopartículas de insulina recién preparadas y deshidratadas se probó mediante el método de la bolsa de diálisis (corte de peso molecular de 100 kDa, Spectra Por Inc.). Las nanopartículas secas recién preparadas y reconstituidas se dializaron en fluidos a pH 2,5, pH 6,6 y pH 7,0 (solución salina tamponada con fosfato 0,1 M, PBS) para simular el entorno de pH del estómago, el duodeno y la parte superior del intestino delgado, respectivamente. Todas las muestras se incubaron a 37 °C con agitación continua a 200 rpm. Se aspiró el fluido fuera de la bolsa de diálisis de 5 ml en los siguientes tiempos: 0,5, 1, 2, 3, 4 y 6 h, y se repuso inmediatamente el volumen con dializado fresco. La contaminación por insulina en el fluido se analizó mediante HPLC, y la tasa de liberación de insulina de las nanopartículas se calculó a partir de la relación entre la insulina libre liberada y la insulina total encapsulada en las nanopartículas. (Ecuación 3).
Las células de la línea celular de carcinoma hepatocelular humano HepG2 se cultivaron en placas de 60 mm de diámetro utilizando el medio Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) que contenía 10 % de suero fetal bovino, 100 UI/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina29. Los cultivos se mantuvieron a 37 °C, 95 % de humedad relativa y 5 % de CO2. Para los ensayos de captación, las células HepG2 se sembraron a 1 × 105 células/ml en un sistema de portaobjetos de cámara Nunc Lab-Tek de 8 pocillos (Thermo Fisher, NY, EE. UU.). Para los ensayos de citotoxicidad, se sembraron en placas de 96 pocillos (Corning, NY, EE. UU.) a una densidad de 5 × 104 células/ml.
El ensayo MTT se utilizó para evaluar la citotoxicidad de las nanopartículas de insulina recién preparadas y deshidratadas30. Las células HepG2 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 × 104 células/mL y se cultivaron durante 7 días antes de la prueba. Las nanopartículas de insulina se diluyeron a varias concentraciones (50 a 500 μg/mL) en medio de cultivo y luego se administraron a las células. Después de 24 horas de incubación, las células se lavaron 3 veces con PBS y se incubaron con medio que contenía 0,5 mg/ml de MTT durante 4 horas adicionales. La citotoxicidad se evaluó midiendo la reducción enzimática del tetrazolio amarillo MTT a formazán púrpura a 570 nm utilizando un lector de placas de espectrofotómetro Tecan infinite M200 pro (Tecan, Männedorf, Suiza).
La eficiencia de captación celular de las NP se probó mediante microscopía confocal de barrido láser y análisis de citometría de flujo. Cada pocillo del sistema de portaobjetos de cámara Nunc Lab-Tek se trató con insulina FITC libre, NP cargadas con insulina FITC y 25 μg/mL reconstituidos de NP de insulina FITC deshidratadas a la misma concentración y se incubó durante 4 horas. Las células se lavaron 3 veces con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4%. Los núcleos se tiñeron con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). La localización de la insulina se observó utilizando un microscopio confocal de barrido láser/dos fotones Olympus FV1000 (Olympus, Shinjuku City, Tokio, Japón). Para el análisis de citometría de flujo, las mismas concentraciones de 10 μg/mL de insulina FITC libre, NP cargadas con insulina FITC y Se añadieron nanopartículas de insulina FITC deshidratadas y resuspendidas a placas de 96 pocillos sembradas con células HepG2 y se incubaron durante 4 horas. Tras 4 horas de incubación, las células se retiraron y se lavaron 3 veces con FBS. Se analizaron 5 × 10⁴ células por muestra mediante un citómetro de flujo BD LSR II (BD, Franklin Lakes, Nueva Jersey, Estados Unidos).
Todos los valores se expresan como media ± desviación estándar. Las comparaciones entre todos los grupos se evaluaron mediante ANOVA unidireccional o prueba t con IBM SPSS Statistics 26 para Mac (IBM, Endicott, Nueva York, EE. UU.) y se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05.
Este estudio demuestra la flexibilidad y capacidad del secado por aspersión para deshidratar nanopartículas de quitosano/TPP/insulina reticuladas con mejor reconstitución en comparación con los métodos estándar de liofilización que utilizan agentes de carga o crioprotectores, con mayor capacidad y mayor capacidad de carga. Las nanopartículas de insulina optimizadas produjeron un tamaño de partícula promedio de 318 nm y una eficiencia de encapsulación del 99,4%. Los resultados de SEM y FTIR después de la deshidratación mostraron que la estructura esférica se mantuvo solo en las NP secadas por aspersión con y sin manitol y liofilizadas con manitol, pero las NP liofilizadas sin manitol se descompusieron durante la deshidratación. En la prueba de capacidad de reconstitución, las nanopartículas de insulina secadas por aspersión sin manitol mostraron el tamaño de partícula promedio más pequeño y la carga más alta después de la reconstitución. Los comportamientos de liberación de todas estas NP deshidratadas mostraron que se liberaron rápidamente en soluciones de pH = 2,5 y pH = 7, y fueron muy estables en una solución de pH = 6,5. En comparación con otras redisueltas En comparación con las nanopartículas deshidratadas, las nanopartículas secadas por pulverización sin manitol mostraron la liberación más rápida. Este resultado es consistente con el observado en el ensayo de captación celular, ya que las nanopartículas secadas por pulverización en ausencia de manitol mantuvieron casi por completo la eficiencia de captación celular de las nanopartículas recién preparadas. Estos resultados sugieren que las nanopartículas de insulina secas preparadas mediante secado por pulverización sin manitol son las más adecuadas para su posterior procesamiento en otras formas farmacéuticas anhidras, como comprimidos orales o películas bioadhesivas.
Debido a cuestiones de propiedad intelectual, los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el presente estudio no están disponibles públicamente, pero pueden obtenerse de los autores respectivos previa solicitud justificada.
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