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El ácido propiónico (PPA) se utiliza para estudiar el papel de la disfunción mitocondrial en trastornos del neurodesarrollo como el trastorno del espectro autista. Se sabe que el PPA altera la biogénesis, el metabolismo y la renovación mitocondrial. Sin embargo, los efectos del PPA en la dinámica, fisión y fusión mitocondriales siguen siendo problemáticos debido a la compleja naturaleza temporal de estos mecanismos. Aquí, utilizamos técnicas complementarias de imagen cuantitativa para investigar cómo el PPA afecta la ultraestructura, morfología y dinámica mitocondrial en células SH-SY5Y similares a neuronas. El PPA (5 mM) causó una disminución significativa en el área mitocondrial (p < 0,01), el diámetro y la circunferencia de Feret (p < 0,05) y el área 2 (p < 0,01). El análisis del localizador de eventos mitocondriales mostró un aumento significativo (p < 0,05) en los eventos de fisión y fusión, manteniendo así la integridad de la red mitocondrial en condiciones de estrés. Además, la expresión de ARNm de cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) y OPA1 (p < 0,05) se redujo significativamente (01). Esto ilustra la remodelación de la morfología, la biogénesis y la dinámica mitocondrial para mantener su función en condiciones de estrés. Nuestros datos aportan una nueva perspectiva sobre los efectos de la PPA en la dinámica mitocondrial y destacan la utilidad de las técnicas de imagen para estudiar los complejos mecanismos reguladores implicados en las respuestas mitocondriales al estrés.
Las mitocondrias participan de forma integral en diversas funciones celulares, más allá de sus roles típicos en la producción de energía y la biosíntesis. El metabolismo mitocondrial es un regulador clave de la señalización del calcio, la homeostasis metabólica y redox, la señalización inflamatoria, las modificaciones epigenéticas, la proliferación celular, la diferenciación y la muerte celular programada1. En particular, el metabolismo mitocondrial es crucial para el desarrollo, la supervivencia y la función neuronal, y está ampliamente implicado en diversas manifestaciones de la neuropatología2,3,4.
Durante la última década, el estado metabólico ha emergido como un regulador central de la neurogénesis, la diferenciación, la maduración y la plasticidad5,6. Recientemente, la morfología y la dinámica mitocondrial se han vuelto componentes particularmente importantes de la mitosis, un proceso dinámico que mantiene un conjunto de mitocondrias sanas dentro de las células. La dinámica mitocondrial está regulada por vías interdependientes complejas que van desde la biogénesis y la bioenergética mitocondrial hasta la fisión, fusión, transporte y depuración mitocondrial7,8. La interrupción de cualquiera de estos mecanismos integrativos perjudica el mantenimiento de redes mitocondriales sanas y tiene profundas consecuencias funcionales para el neurodesarrollo9,10. De hecho, la desregulación de la dinámica mitocondrial se observa en muchos trastornos psiquiátricos, neurodegenerativos y del neurodesarrollo, incluyendo los trastornos del espectro autista (TEA)11,12.
El TEA es un trastorno heterogéneo del neurodesarrollo con una arquitectura genética y epigenética compleja. La heredabilidad del TEA es indiscutible, pero la etiología molecular subyacente sigue siendo poco conocida. La acumulación de datos de modelos preclínicos, estudios clínicos y conjuntos de datos moleculares multiómicos proporciona cada vez más evidencia de disfunción mitocondrial en el TEA13,14. Previamente, realizamos un cribado de metilación del ADN a nivel de todo el genoma en una cohorte de pacientes con TEA e identificamos genes metilados diferencialmente agrupados a lo largo de las vías metabólicas mitocondriales15. Posteriormente, informamos de la metilación diferencial de los reguladores centrales de la biogénesis y la dinámica mitocondrial, que se asoció con un mayor número de copias de ADNmt y un perfil metabólico urinario alterado en el TEA16. Nuestros datos proporcionan cada vez más evidencia de que la dinámica y la homeostasis mitocondriales desempeñan un papel central en la fisiopatología del TEA. Por lo tanto, mejorar la comprensión mecanicista de la relación entre la dinámica, la morfología y la función mitocondrial es un objetivo clave de la investigación en curso sobre enfermedades neurológicas caracterizadas por disfunción mitocondrial secundaria.
Las técnicas moleculares se utilizan a menudo para estudiar el papel de genes específicos en las respuestas al estrés mitocondrial. Sin embargo, este enfoque puede estar limitado por la naturaleza multifacética y temporal de los mecanismos de control mitótico. Además, la expresión diferencial de los genes mitocondriales es un indicador indirecto de cambios funcionales, especialmente porque normalmente solo se analiza un número limitado de genes. Por lo tanto, se han propuesto métodos más directos para estudiar la función mitocondrial y la bioenergética17. La morfología mitocondrial está estrechamente relacionada con la dinámica mitocondrial. La forma, la conectividad y la estructura mitocondriales son fundamentales para la producción de energía y la supervivencia mitocondrial y celular5,18. Además, los diversos componentes de la mitosis se centran en los cambios en la morfología mitocondrial, que pueden servir como puntos finales útiles de la disfunción mitocondrial y proporcionar una base para estudios mecanísticos posteriores.
La morfología mitocondrial se puede observar directamente mediante microscopía electrónica de transmisión (MET), lo que permite un estudio detallado de la ultraestructura celular. La MET visualiza directamente la morfología, la forma y la estructura de las crestas mitocondriales con la resolución de mitocondrias individuales, en lugar de basarse únicamente en la transcripción génica, la expresión proteica o los parámetros funcionales mitocondriales en poblaciones celulares17,19,20. Además, la MET facilita el estudio de las interacciones entre las mitocondrias y otros orgánulos, como el retículo endoplasmático y los autofagosomas, que desempeñan papeles clave en la función mitocondrial y la homeostasis21,22. Por lo tanto, esto convierte a la MET en un buen punto de partida para estudiar la disfunción mitocondrial antes de centrarse en vías o genes específicos. A medida que la función mitocondrial se vuelve cada vez más relevante para la neuropatología, existe una clara necesidad de poder estudiar directa y cuantitativamente la morfología y la dinámica mitocondriales en modelos neuronales in vitro.
En este artículo, examinamos la dinámica mitocondrial en un modelo neuronal de disfunción mitocondrial en el trastorno del espectro autista. Previamente, informamos sobre la metilación diferencial de la propionil-CoA carboxilasa beta (PCCB) en el TEA15, una subunidad de la enzima propionil-CoA carboxilasa mitocondrial PCC. Se sabe que la desregulación de la PCC causa la acumulación tóxica de derivados del propionilo, incluido el ácido propiónico (PPA)23,24,25. Se ha demostrado que el PPA altera el metabolismo neuronal y el comportamiento in vivo, y es un modelo animal establecido para estudiar los mecanismos del neurodesarrollo implicados en el TEA26,27,28. Además, se ha informado que el PPA altera el potencial de membrana mitocondrial, la biogénesis y la respiración in vitro, y se ha utilizado ampliamente para modelar la disfunción mitocondrial en neuronas29,30. Sin embargo, el impacto de la disfunción mitocondrial inducida por PPA en la morfología y la dinámica mitocondriales sigue siendo poco conocido.
Este estudio utiliza técnicas de imagen complementarias para cuantificar los efectos de la PPA en la morfología, dinámica y función mitocondrial en células SH-SY5Y. Primero, desarrollamos un método TEM para visualizar cambios en la morfología y ultraestructura mitocondrial17,31,32. Dada la naturaleza dinámica de las mitocondrias33, también utilizamos el análisis del localizador de eventos mitocondriales (MEL) para cuantificar los cambios en el equilibrio entre los eventos de fisión y fusión, el número y el volumen mitocondriales bajo estrés de PPA. Finalmente, examinamos si la morfología y dinámica mitocondrial están asociadas con cambios en la expresión de genes involucrados en la biogénesis, fisión y fusión. Tomados en conjunto, nuestros datos ilustran el desafío de dilucidar la complejidad de los mecanismos que regulan la dinámica mitocondrial. Destacamos la utilidad de TEM en el estudio de la morfología mitocondrial como un punto final convergente medible de la mitosis en células SH-SY5Y. Además, destacamos que los datos de TEM proporcionan la información más completa cuando se combinan con técnicas de imagen que también capturan eventos dinámicos en respuesta al estrés metabólico. Una mayor caracterización de los mecanismos reguladores moleculares que sustentan la mitosis neuronal puede proporcionar información importante sobre el componente mitocondrial del sistema nervioso y las enfermedades neurodegenerativas.
Para inducir estrés mitocondrial, las células SH-SY5Y se trataron con PPA utilizando propionato de sodio (NaP) 3 mM y 5 mM. Antes de la TEM, las muestras se sometieron a una preparación criogénica mediante congelación a alta presión y congelación (Fig. 1a). Desarrollamos un sistema automatizado de análisis de imágenes mitocondriales para medir ocho parámetros morfológicos de las poblaciones mitocondriales en tres réplicas biológicas. Descubrimos que el tratamiento con PPA modificó significativamente cuatro parámetros: área 2, área, perímetro y diámetro de Feret (Fig. 1b-e). El área 2 disminuyó significativamente con los tratamientos con PPA 3 mM y 5 mM (p = 0,0183 y p = 0,002, respectivamente) (Fig. 1b), mientras que el área (p = 0,003), el perímetro (p = 0,0106) y el diámetro de Feret disminuyeron significativamente. Se observó una reducción significativa (p = 0,0172) en el grupo de tratamiento con 5 mM en comparación con el grupo control (Fig. 1c-e). Las reducciones significativas en el área y la circunferencia mostraron que las células tratadas con 5 mM de PPA tenían mitocondrias más pequeñas y redondeadas, y que estas mitocondrias eran menos elongadas que las de las células control. Esto también es consistente con una disminución significativa del diámetro de Feret, un parámetro independiente que indica una disminución de la distancia máxima entre los bordes de las partículas. Se observaron cambios en la ultraestructura de las crestas: las crestas se volvieron menos pronunciadas bajo la influencia del estrés de PPA (Fig. 1a, panel B). Sin embargo, no todas las imágenes reflejaban claramente la ultraestructura de las crestas, por lo que no se realizó un análisis cuantitativo de estos cambios. Estos datos de TEM pueden reflejar tres posibles escenarios: (1) el PPA mejora la fisión o inhibe la fusión, lo que hace que las mitocondrias existentes se reduzcan de tamaño; (2) la biogénesis mejorada crea mitocondrias nuevas y más pequeñas o (3) induce ambos mecanismos simultáneamente. Aunque estas condiciones no se pueden distinguir mediante TEM, los cambios morfológicos significativos indican cambios en la homeostasis y la dinámica mitocondrial bajo estrés de PPA. Posteriormente exploramos parámetros adicionales para caracterizar mejor estas dinámicas y los posibles mecanismos subyacentes a ellas.
El ácido propiónico (PPA) remodela la morfología mitocondrial. (a) Imágenes representativas de microscopía electrónica de transmisión (MET) que muestran que el tamaño mitocondrial disminuye y las mitocondrias se hacen más pequeñas y más redondeadas con el aumento del tratamiento con PPA; 0 mM (sin tratar), 3 mM y 5 mM, respectivamente. Las flechas rojas indican las mitocondrias. (b–e) Las células SH-SY5Y tratadas con PPA durante 24 h se prepararon para TEM y los resultados se analizaron utilizando Fiji/ImageJ. Cuatro de los ocho parámetros mostraron diferencias significativas entre las células de control (sin tratar, 0 mM de PPA) y las células tratadas (3 mM y 5 mM de PPA). (b) Región 2, (c) Área, (d) Perímetro, (e) Diámetro de Feret. Se utilizaron el análisis de varianza unidireccional (control vs. tratamiento) y la prueba de comparación múltiple de Dunnett para determinar las diferencias significativas (p < 0,05). Los puntos de datos representan el valor mitocondrial promedio de cada célula, y las barras de error representan la media ± EEM. Los datos mostrados representan n = 3, al menos 24 células por réplica; se analizaron 266 imágenes en total; * indica p < 0,05, ** indica p < 0,01.
Para caracterizar con mayor precisión la respuesta de la dinámica mitocondrial al PPA, tiñemos las mitocondrias con éster etílico de tetrametilrodamina (TMRE) y utilizamos microscopía de lapso de tiempo y análisis MEL para localizar y cuantificar las mitocondrias tras 24 horas con 3 y 5 mM de PPA. Tratamiento de los eventos de fisión y fusión (Fig. 2a). Tras el análisis MEL, se analizaron las mitocondrias para cuantificar el número de estructuras mitocondriales y su volumen promedio. Observamos un aumento pequeño pero significativo en el número de eventos de fisión que ocurrieron a 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] en comparación con la fisión [5,6 ± 0,3 (p < 0,05) )] y la fusión [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] y los eventos de fusión [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] 0,05)] <0,05)] aumentaron significativamente a 5 mM en comparación con el control (Fig. 3b). El número de mitocondrias aumentó significativamente tanto a 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] como a 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Fig. 3c), mientras que el volumen promedio de cada estructura mitocondrial permaneció sin cambios (Fig. 3c). 3d). En conjunto, esto sugiere que la remodelación de la dinámica mitocondrial actúa como una respuesta compensatoria que mantiene con éxito la integridad de la red mitocondrial. El aumento en el número de eventos de fisión con 3 mM de PPA sugiere que el aumento en el número de mitocondrias se debe en parte a la fisión mitocondrial, pero dado que el volumen mitocondrial promedio permanece prácticamente inalterado, no se puede descartar la biogénesis como una respuesta compensatoria adicional. Sin embargo, estos datos son consistentes con las estructuras mitocondriales más pequeñas y redondeadas observadas por TEM y también demuestran cambios significativos en la dinámica mitocondrial inducidos por PPA.
El ácido propiónico (PPA) induce la remodelación mitocondrial dinámica para mantener la integridad de la red. Se cultivaron células SH-SY5Y, se trataron con PPA 3 y 5 mM durante 24 horas y se tiñeron con TMRE y Hoechst 33342 seguido de análisis MEL. (a) Imágenes representativas de microscopía time-lapse que representan proyecciones de intensidad máxima en color y binarizadas en el tiempo 2 (t2) para cada condición. Las regiones seleccionadas indicadas en cada imagen binaria se mejoran y se muestran en 3D en tres marcos de tiempo diferentes (t1-t3) para ilustrar la dinámica a lo largo del tiempo; los eventos de fusión se resaltan en verde; los eventos de fisión se resaltan en verde. Se muestran en rojo. (b) Número promedio de eventos dinámicos por condición. (c) Número promedio de estructuras mitocondriales por célula. (d) Volumen promedio (µm3) de cada estructura mitocondrial por célula. Los datos mostrados son representativos de n = 15 células por grupo de tratamiento. Las barras de error mostradas representan la media ± SEM, barra de escala = 10 μm, * p < 0,05.
El ácido propiónico (PPA) causa supresión transcripcional de genes asociados con la dinámica mitocondrial. Las células SH-SY5Y se trataron con PPA 3 y 5 mM durante 24 h. La cuantificación genética relativa se realizó mediante RT-qPCR y se normalizó a B2M. Genes de biogénesis mitocondrial (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 y (d) NFE2L2. Genes de fusión y fisión mitocondrial (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 e (i) DRP1. Las diferencias significativas (p < 0,05) se probaron utilizando ANOVA de una vía (control vs. tratamiento) y la prueba de comparación múltiple de Dunnett: * indica p < 0,05, ** indica p < 0,01 y **** indica p < 0,0001. Las barras representan la expresión media ± SEM. Los datos mostrados representan n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) y n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) réplicas biológicas.
Los datos de los análisis TEM y MEL juntos indican que la PPA altera la morfología y la dinámica mitocondrial. Sin embargo, estas técnicas de imagen no proporcionan información sobre los mecanismos subyacentes que impulsan estos procesos. Por lo tanto, examinamos la expresión de ARNm de nueve reguladores clave de la dinámica mitocondrial, la biogénesis y la mitosis en respuesta al tratamiento con PPA. Cuantificamos el oncogén de mieloma celular (cMYC), el factor respiratorio nuclear (NRF1), el factor de transcripción mitocondrial 1 (TFAM), el factor de transcripción similar a NFE2 BZIP (NFE2L2), la proteína similar a la gastrina 2 (STOML2), la atrofia del nervio óptico 1 (OPA1), la mitofusina 1 (MFN1), la mitofusina 2 (MFN2) y la proteína relacionada con la dinamina 1 (DRP1) después de 24 horas de tratamiento con 3 mM y 5 mM de PPA. Observamos tratamientos con PPA a 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 y p < 0,0001, respectivamente) y 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) (Fig. 3a–c). La disminución en la expresión de ARNm fue dependiente de la dosis: la expresión de cMYC, NRF1 y TFAM disminuyó 5,7, 2,6 y 1,9 veces a 3 mM, respectivamente, y 11,2, 3 y 2,2 veces a 5 mM. Por el contrario, el gen central de biogénesis redox NFE2L2 no se alteró a ninguna concentración de PPA, aunque se observó una tendencia similar dependiente de la dosis de disminución de la expresión (Fig. 3d).
También examinamos la expresión de genes clásicos involucrados en la regulación de la fisión y fusión. Se cree que STOML2 está involucrado en la fusión, mitofagia y biogénesis, y su expresión se redujo significativamente (p < 0,0001) con 3 mM (cambio de 2,4 veces) y 5 mM (cambio de 2,8 veces) de PPA (Fig. 1). 3d). De manera similar, la expresión del gen de fusión OPA1 disminuyó con 3 mM (cambio de 1,6 veces) y 5 mM (cambio de 1,9 veces) de PPA (p = 0,006 y p = 0,0024, respectivamente) (Fig. 3f). Sin embargo, no encontramos diferencias significativas en la expresión de los genes de fusión MFN1, MFN2 o el gen de fisión DRP1 bajo estrés de PPA de 24 h (Fig. 3g–i). Además, observamos que los niveles de cuatro proteínas de fusión y fisión (OPA1, MFN1, MFN2 y DRP1) no variaron en las mismas condiciones (Fig. 4a-d). Cabe destacar que estos datos reflejan un único momento temporal y podrían no reflejar cambios en la expresión o actividad proteica durante las primeras etapas del estrés por PPA. Sin embargo, las reducciones significativas en la expresión de cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 y OPA1 indican una desregulación transcripcional significativa del metabolismo, la biogénesis y la dinámica mitocondrial. Además, estos datos resaltan la utilidad de las técnicas de imagen para estudiar directamente los cambios en el estado final de la función mitocondrial.
Los niveles de proteína de los factores de fusión y fisión no cambiaron después del tratamiento con ácido propiónico (PPA). Las células SH-SY5Y se trataron con PPA 3 y 5 mM durante 24 h. Los niveles de proteína se cuantificaron mediante análisis Western blot, y los niveles de expresión se normalizaron a la proteína total. Se muestran la expresión proteica promedio y Western blots representativos de la proteína diana y total. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Las barras representan la media ± SEM, y los datos mostrados son representativos de n = 3 réplicas biológicas. Se realizaron comparaciones múltiples (p < 0,05) mediante análisis de varianza unidireccional y la prueba de Dunnett. El gel original y el blot se muestran en la Figura S1.
La disfunción mitocondrial se asocia con enfermedades multisistémicas que van desde enfermedades metabólicas, cardiovasculares y musculares hasta enfermedades neurológicas1,10. Muchas enfermedades neurodegenerativas y neurodegenerativas se asocian con la disfunción mitocondrial, lo que destaca la importancia de estos orgánulos a lo largo de la vida del cerebro. Estas enfermedades incluyen la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y el TEA3,4,18. Sin embargo, el acceso al tejido cerebral para estudiar estas enfermedades es difícil, especialmente a nivel mecanístico, lo que hace que los sistemas de modelos celulares sean una alternativa necesaria. En este estudio, utilizamos un sistema de modelo celular que utiliza células SH-SY5Y tratadas con PPA para recapitular la disfunción mitocondrial observada en enfermedades neuronales, particularmente trastornos del espectro autista. El uso de este modelo de PPA para estudiar la dinámica mitocondrial en neuronas puede proporcionar información sobre la etiología del TEA.
Exploramos la posibilidad de usar TEM para visualizar cambios en la morfología mitocondrial. Es importante destacar que TEM debe usarse correctamente para maximizar su efectividad. La preparación de crioespecímenes permite una mejor preservación de las estructuras neuronales al fijar simultáneamente los componentes celulares y reducir la formación de artefactos34. En consonancia con esto, observamos que las células SH-SY5Y similares a neuronas tenían orgánulos subcelulares intactos y mitocondrias elongadas (Fig. 1a). Esto resalta la utilidad de las técnicas de preparación criogénica para estudiar la morfología mitocondrial en modelos de células neuronales. Aunque las mediciones cuantitativas son críticas para el análisis objetivo de los datos de TEM, aún no hay consenso sobre qué parámetros específicos deben medirse para confirmar los cambios morfológicos mitocondriales. Con base en una gran cantidad de estudios que han examinado cuantitativamente la morfología mitocondrial17,31,32, desarrollamos una tubería automatizada de análisis de imágenes mitocondriales que mide ocho parámetros morfológicos, a saber: área, área2, relación de aspecto, perímetro, circularidad, grado, diámetro de Feret y redondez.
Entre ellos, el PPA redujo significativamente el área 2, el área, el perímetro y el diámetro de Feret (Fig. 1b–e). Esto mostró que las mitocondrias se volvieron más pequeñas y más redondeadas, lo cual es consistente con estudios previos que muestran una disminución del área mitocondrial después de 72 horas de estrés mitocondrial inducido por PPA30. Estas características morfológicas pueden indicar fisión mitocondrial, un proceso necesario para secuestrar componentes dañados de la red mitocondrial para promover su degradación a través de la mitofagia35,36,37. Por otro lado, la disminución del tamaño mitocondrial promedio puede estar asociada con una mayor biogénesis, que resulta en la formación de pequeñas mitocondrias nacientes. El aumento de la fisión o biogénesis representa una respuesta compensatoria para mantener la mitosis contra el estrés mitocondrial. Sin embargo, no se puede excluir la disminución del crecimiento mitocondrial, la fusión alterada u otras afecciones.
Aunque las imágenes de alta resolución creadas por TEM permiten la determinación de características morfológicas a nivel de mitocondrias individuales, este método produce instantáneas bidimensionales en un único punto en el tiempo. Para estudiar las respuestas dinámicas al estrés metabólico, teñimos mitocondrias con TMRE y utilizamos microscopía de lapso de tiempo con análisis MEL, que permite la visualización 3D de alto rendimiento de los cambios en la red mitocondrial a lo largo del tiempo33,38. Observamos cambios sutiles pero significativos en la dinámica mitocondrial bajo estrés de PPA (Fig. 2). A 3 mM, el número de eventos de fisión aumentó significativamente, mientras que los eventos de fusión se mantuvieron iguales que en el control. Se observó un aumento en el número de eventos de fisión y fusión a 5 mM de PPA, pero estos cambios fueron aproximadamente proporcionales, lo que sugiere que la cinética de fisión y fusión alcanza el equilibrio a concentraciones más altas (Fig. 2b). El volumen mitocondrial promedio se mantuvo sin cambios con PPA de 3 y 5 mM, lo que indica que se conservó la integridad de la red mitocondrial (Fig. 2d). Esto refleja la capacidad de las redes mitocondriales dinámicas para responder a un estrés metabólico leve y mantener eficazmente la homeostasis sin causar fragmentación de la red. Con PPA de 3 mM, el aumento de la fisión es suficiente para promover la transición a un nuevo equilibrio, pero se requiere una remodelación cinética más profunda en respuesta al estrés inducido por concentraciones más altas de PPA.
El número de mitocondrias aumentó con ambas concentraciones de estrés de PPA, pero el volumen mitocondrial promedio no varió significativamente (Fig. 2c). Esto podría deberse a un aumento de la biogénesis o la división; sin embargo, en ausencia de una disminución significativa del volumen mitocondrial promedio, es más probable que aumente la biosíntesis. No obstante, los datos de la Figura 2 respaldan la existencia de dos mecanismos compensatorios: un aumento del número de eventos de fisión, consistente con la regulación positiva de la fisión mitocondrial, y un aumento del número de eventos, consistente con la biogénesis mitocondrial. En definitiva, la compensación dinámica del estrés leve puede consistir en procesos simultáneos que involucran fisión, fusión, biogénesis y mitofagia. Si bien autores anteriores han demostrado que la PPA mejora la mitosis30,39 y la mitofagia29, nosotros aportamos evidencia de la remodelación de la dinámica de fisión y fusión mitocondrial en respuesta a la PPA. Estos datos confirman los cambios morfológicos observados mediante TEM y proporcionan mayor comprensión de los mecanismos asociados con la disfunción mitocondrial inducida por la PPA.
Debido a que ni el análisis TEM ni el MEL proporcionaron evidencia directa de los mecanismos reguladores de los genes que subyacen a los cambios morfológicos observados, examinamos la expresión de ARN de genes involucrados en el metabolismo, la biogénesis y la dinámica mitocondrial. El protooncogén cMYC es un factor de transcripción involucrado en la regulación de las mitocondrias, la glucólisis, el metabolismo de aminoácidos y ácidos grasos40. Además, se sabe que cMYC regula la expresión de casi 600 genes mitocondriales involucrados en la transcripción, traducción y ensamblaje de complejos mitocondriales, incluyendo NRF1 y TFAM41. NRF1 y TFAM son dos reguladores centrales de la mitosis, que actúan aguas abajo de PGC-1α para activar la replicación del ADNmt. Esta vía es activada por la señalización de AMPc y AMPK y es sensible al gasto energético y al estrés metabólico. También examinamos NFE2L2, un regulador redox de la biogénesis mitocondrial, para determinar si los efectos de la PPA podrían estar mediados por el estrés oxidativo.
Aunque la expresión de NFE2L2 permaneció sin cambios, encontramos una disminución consistente dependiente de la dosis en la expresión de cMYC, NRF1 y TFAM después de 24 h de tratamiento con 3 mM y 5 mM de PPA (Fig. 3a–c). La regulación negativa de la expresión de cMYC se ha reportado previamente como una respuesta al estrés mitocondrial42, y por el contrario, la regulación negativa de la expresión de cMYC puede causar disfunción mitocondrial al remodelar el metabolismo mitocondrial, la conectividad de la red y la polarización de la membrana43. Curiosamente, cMYC también está involucrado en la regulación de la fisión y fusión mitocondrial42,43 y se sabe que aumenta la fosforilación de DRP1 y la localización mitocondrial durante la división celular44, así como media la remodelación morfológica mitocondrial en células madre neuronales45. De hecho, los fibroblastos deficientes en cMYC exhiben un tamaño mitocondrial reducido, consistente con los cambios inducidos por el estrés de PPA43. Estos datos ilustran una relación interesante pero aún poco clara entre cMYC y la dinámica mitocondrial, lo que proporciona un objetivo interesante para futuros estudios de remodelación inducida por estrés de PPA.
La reducción de NRF1 y TFAM es consistente con el papel de cMYC como un importante activador transcripcional. Estos datos también son consistentes con estudios previos en células de cáncer de colon humano que muestran que PPA redujo la expresión de ARNm de NRF1 a las 22 horas, que se asoció con el agotamiento de ATP y aumentó ROS46. Estos autores también informaron que la expresión de TFAM aumentó a las 8,5 horas, pero regresó a los niveles basales a las 22 horas. Por el contrario, Kim et al. (2019) mostraron que la expresión de ARNm de TFAM disminuyó significativamente después de 4 h de estrés de PPA en células SH-SY5Y; sin embargo, después de 72 horas, la expresión de la proteína TFAM aumentó significativamente y el número de copias de ADNmt aumentó significativamente. Por lo tanto, la disminución en el número de genes de biogénesis mitocondrial que observamos después de 24 horas no excluye la posibilidad de que el aumento en el número de mitocondrias esté asociado con la activación de la biogénesis en puntos temporales anteriores. Estudios previos han demostrado que la PPA aumenta significativamente la expresión del ARNm y la proteína PGC-1α en células SH-SY5Y a las 4 horas y 30 minutos, mientras que el ácido propiónico mejora la biogénesis mitocondrial en hepatocitos de ternera a través de PGC-1α a las 12 horas y 39 minutos. Curiosamente, la PGC-1α no solo es un regulador transcripcional directo de NRF1 y TFAM, sino que también ha demostrado regular la actividad de MFN2 y DRP1 mediante la regulación de la fisión y la fusión47. En conjunto, esto resalta la estrecha asociación de los mecanismos que regulan las respuestas compensatorias mitocondriales inducidas por la PPA. Además, nuestros datos reflejan una desregulación significativa de la regulación transcripcional de la biogénesis y el metabolismo bajo estrés por PPA.
Los genes STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 y DRP1 se encuentran entre los reguladores centrales de la fisión, fusión y dinámica mitocondrial37,48,49. Existen muchos otros genes involucrados en la dinámica mitocondrial; sin embargo, se ha encontrado previamente que STOML2, OPA1 y MFN2 están metilados diferencialmente en cohortes de TEA,16 y varios estudios independientes han reportado cambios en estos factores de transcripción en respuesta al estrés mitocondrial50,51. 52. La expresión tanto de OPA1 como de STOML2 se redujo significativamente con el tratamiento con PPA a 3 mM y 5 mM (Fig. 3e, f). OPA1 es uno de los reguladores clásicos de la fusión mitocondrial a través de la interacción directa con MFN1 y 2 y desempeña un papel en la remodelación de las crestas y la morfología mitocondrial53. El papel preciso de STOML2 en la dinámica mitocondrial aún no está claro, pero la evidencia sugiere que juega un papel en la fusión mitocondrial, la biogénesis y la mitofagia.
STOML2 participa en el mantenimiento del acoplamiento respiratorio mitocondrial y la formación de complejos de la cadena respiratoria54,55 y se ha demostrado que altera profundamente las características metabólicas de las células cancerosas56. Estudios han demostrado que STOML2 promueve el potencial de membrana mitocondrial y la biogénesis a través de la interacción con BAN y cardiolipina55, 57, 58. Además, estudios independientes han demostrado que la interacción entre STOML2 y PINK1 regula la mitofagia59,60. En particular, se ha informado que STOML2 interactúa directamente con MFN2 y lo estabiliza, y también desempeña un papel importante en la estabilización de las isoformas largas de OPA1 al inhibir la proteasa responsable de la degradación de OPA153,61,62. La reducción en la expresión de STOML2 observada en las reacciones de PPA puede hacer que estas proteínas de fusión sean más susceptibles a la degradación a través de vías dependientes de ubiquitina y proteasoma48. Aunque el papel preciso de STOML2 y OPA1 en la respuesta dinámica a la PPA no está claro, la disminución de la expresión de estos genes de fusión (Figura 3) puede alterar el equilibrio entre la fisión y la fusión y conducir a una disminución del tamaño mitocondrial (Figura 3). 1).
Por otro lado, la expresión de la proteína OPA1 permaneció sin cambios después de 24 h, mientras que los niveles de ARNm y proteína de MFN1, MFN2 o DRP1 no cambiaron significativamente después del tratamiento con PPA (Fig. 3g-i, Fig. 4). Esto puede indicar que no hay cambios en la regulación de estos factores involucrados en la fusión y fisión mitocondrial. Sin embargo, vale la pena señalar que cada uno de estos cuatro genes también está regulado por modificaciones postranscripcionales (PTM) que controlan la actividad proteica. OPA1 tiene ocho variantes de empalme alternativo que se escinden proteolíticamente en las mitocondrias para producir dos isoformas distintas 63 . El equilibrio entre las isoformas largas y cortas determina en última instancia el papel de OPA1 en la fusión mitocondrial y el mantenimiento de la red mitocondrial64. La actividad de DRP1 está regulada por la fosforilación de la proteína quinasa II dependiente de calcio/calmodulina (CaMKII), mientras que la degradación de DRP1 está regulada por la ubiquitinación y la SUMOilación65. Finalmente, tanto DRP1 como MFN1/2 son GTPasas, por lo que su actividad puede verse influenciada por la tasa de producción de GTP en las mitocondrias 66 . Por lo tanto, aunque la expresión de estas proteínas permanece constante, esto puede no reflejar una actividad o localización proteica inalterada67,68. De hecho, los repertorios de proteínas PTM existentes a menudo sirven como la primera línea de defensa responsable de mediar las respuestas al estrés agudo. En presencia de estrés metabólico moderado en nuestro modelo, es probable que PTM promueva una mayor actividad de las proteínas de fusión y fisión para restaurar suficientemente la integridad mitocondrial sin requerir la activación adicional de estos genes a nivel de ARNm o proteína.
En conjunto, los datos anteriores resaltan la compleja y dependiente del tiempo regulación de la morfología mitocondrial y los desafíos de dilucidar estos mecanismos. Para estudiar la expresión génica, primero es necesario identificar genes diana específicos en la vía. Sin embargo, nuestros datos muestran que los genes en la misma vía no responden de la misma manera al mismo estrés. De hecho, estudios previos han demostrado que diferentes genes en la misma vía pueden exhibir diferentes perfiles de respuesta temporal30,46. Además, existen mecanismos postranscripcionales complejos que alteran la relación entre la transcripción y la función génica. Los estudios proteómicos pueden proporcionar información sobre el impacto de las PTM y la función proteica, pero también plantean desafíos, incluyendo métodos de bajo rendimiento, altas relaciones señal-ruido y baja resolución.
En este contexto, el estudio de la morfología mitocondrial mediante TEM y MEL presenta un gran potencial para abordar cuestiones fundamentales sobre la relación entre la dinámica y la función mitocondrial y su influencia en las enfermedades. Más importante aún, la TEM proporciona un método directo para medir la morfología mitocondrial como criterio de valoración convergente de la disfunción y la dinámica mitocondrial51. La MEL también proporciona un método directo para visualizar eventos de fisión y fusión en un entorno celular tridimensional, lo que permite cuantificar la remodelación mitocondrial dinámica incluso en ausencia de cambios en la expresión génica33. Aquí destacamos la utilidad de las técnicas de imagen mitocondrial en enfermedades mitocondriales secundarias. Estas enfermedades se caracterizan típicamente por un estrés metabólico leve crónico caracterizado por una remodelación sutil de las redes mitocondriales, en lugar de un daño mitocondrial agudo. Sin embargo, la compensación mitocondrial necesaria para mantener la mitosis bajo estrés crónico tiene profundas consecuencias funcionales. En el contexto de la neurociencia, una mejor comprensión de estos mecanismos compensatorios puede proporcionar información importante sobre la neuropatología pleiotrópica asociada con la disfunción mitocondrial.
En última instancia, nuestros datos resaltan la utilidad de las técnicas de imagen para comprender las consecuencias funcionales de las complejas interacciones entre la expresión génica, las modificaciones proteicas y la actividad proteica que controlan la dinámica mitocondrial neuronal. Utilizamos PPA para modelar la disfunción mitocondrial en un modelo celular neuronal para comprender mejor el componente mitocondrial del TEA. Las células SH-SY5Y tratadas con PPA mostraron cambios en la morfología mitocondrial: las mitocondrias se volvieron pequeñas y redondas, y las crestas estaban mal definidas cuando se observaron por TEM. El análisis MEL muestra que estos cambios ocurren concomitantemente con un aumento en los eventos de fisión y fusión para mantener la red mitocondrial en respuesta al estrés metabólico leve. Además, PPA altera significativamente la regulación transcripcional del metabolismo y la homeostasis mitocondrial. Identificamos cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 y OPA1 como reguladores mitocondriales clave alterados por el estrés de PPA y pueden desempeñar un papel en la mediación de los cambios inducidos por PPA en la morfología y la función mitocondriales. Se necesitan estudios futuros para caracterizar mejor los cambios temporales inducidos por la PPA en la expresión génica, la actividad proteica, la localización y las modificaciones postraduccionales. Nuestros datos resaltan la complejidad e interdependencia de los mecanismos reguladores que median la respuesta al estrés mitocondrial y demuestran la utilidad de la TEM y otras técnicas de imagen para estudios mecanísticos más específicos.
La línea celular SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) se adquirió de Sigma-Aldrich. Las células SH-SY5Y se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco/mezcla nutritiva F-12 (DMEM/F-12) y L-glutamina (SC09411, ScienCell) en matraces de 25 cm² suplementados con 20 % de suero fetal bovino (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) y 1 % de penicilina-estreptomicina (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) a 37 °C y 5 % de CO₂. Las células se subcultivaron hasta una confluencia del 80 % con tripsina-EDTA al 0,05 % (15400054, ThermoFisher Scientific), se centrifugaron a 300 g y se sembraron a una densidad aproximada de 7 × 10⁻¹ células/ml. Todos los experimentos se realizaron en células SH-SY5Y indiferenciadas entre los pases 19 y 22. El PPA se administra como NaP. Disuelva el polvo de NaP (n.º CAS 137-40-6, fórmula química C₃H₃NaO₂, P5436-100G, Sigma-Aldrich) en agua MilliQ tibia a una concentración de 1 M y consérvelo a 4 °C. El día del tratamiento, diluya esta solución con PPA 1 M a 3 mM y PPA 5 mM en medio sin suero (DMEM/F-12 con L-glutamina). Las concentraciones de tratamiento para todos los experimentos fueron sin PPA (0 mM, control), 3 mM y 5 mM. Los experimentos se realizaron en al menos tres réplicas biológicas.
Las células SH-SY5Y se sembraron en matraces de 25 cm³ a ​​una velocidad de 5,5 × 10 5 células/ml y se cultivaron durante 24 horas. El tratamiento con PPA se añadió al matraz antes de las 24 h de incubación. Recolectar los pellets celulares siguiendo los protocolos normales de subcultivo de tejido de mamíferos (descritos anteriormente). Resuspender el pellet celular en 100 µl de glutaraldehído al 2,5 %, solución de PBS 1× y almacenar a 4 °C hasta su procesamiento. Las células SH-SY5Y se centrifugaron brevemente para sedimentar las células y eliminar la solución de glutaraldehído al 2,5 %, solución de PBS 1×. Resuspender el sedimento en un gel de agarosa al 4 % preparado en agua destilada (la proporción de agarosa a volumen de sedimento es 1:1). Los fragmentos de agarosa se colocaron en rejillas sobre placas planas y se recubrieron con 1-hexadeceno antes de la congelación a alta presión. Las muestras se congelaron en acetona seca al 100 % a -90 °C durante 24 horas. Posteriormente, la temperatura se elevó a -80 °C y se añadió una solución de tetróxido de osmio al 1 % y glutaraldehído al 0,1 %. Las muestras se almacenaron a -80 °C durante 24 horas. Posteriormente, la temperatura se incrementó gradualmente hasta alcanzar la temperatura ambiente durante varios días: de –80 °C a –50 °C durante 24 horas, a –30 °C durante 24 horas, a –10 °C durante 24 horas y, finalmente, a temperatura ambiente.
Tras la preparación criogénica, las muestras se impregnaron con resina y se realizaron secciones ultrafinas (∼100 nm) con un ultramicrótomo Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Las secciones se tiñeron con acetato de uranilo al 2 % y citrato de plomo. Las muestras se observaron con un microscopio electrónico de transmisión FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (anteriormente FEI), Eindhoven, Países Bajos) operando a 200 kV (transmisor Lab6) y una cámara CCD Gatan (Gatan, Reino Unido) equipada con un filtro de energía Tridiem.
En cada réplica técnica, se adquirieron al menos 24 imágenes de células individuales, para un total de 266 imágenes. Todas las imágenes se analizaron utilizando la macro Región de Interés (ROI) y la macro Mitocondria. La macro mitocondrial se basa en métodos publicados17,31,32 y permite el procesamiento por lotes semiautomatizado de imágenes TEM en Fiji/ImageJ69. En resumen: la imagen se invierte mediante la sustracción de fondo de bola rodante (radio de 60 píxeles) y un filtro de paso de banda FFT (utilizando límites superior e inferior de 60 y 8 píxeles respectivamente) y supresión de línea vertical con una tolerancia de orientación del 5%. La imagen procesada se umbraliza automáticamente utilizando un algoritmo de máxima entropía y se genera una máscara binaria. Se extrajeron las regiones de imagen asociadas con ROI seleccionadas manualmente en imágenes TEM sin procesar, caracterizando las mitocondrias y excluyendo la membrana plasmática y otras regiones de alto contraste. Para cada ROI extraída, se analizaron partículas binarias mayores de 600 píxeles, y se midieron el área de la partícula, el perímetro, los ejes mayor y menor, el diámetro de Feret, la redondez y la circularidad utilizando las funciones de medición integradas de Fiji/ImageJ. Siguiendo a Merrill, Flippo y Strack (2017), el área 2, la relación de aspecto de la partícula (relación de los ejes mayor y menor) y el factor de forma (FF) se calcularon a partir de estos datos, donde FF = perímetro 2/4pi x área. La definición de la fórmula paramétrica se puede encontrar en Merrill, Flippo y Strack (2017). Las macros mencionadas están disponibles en GitHub (consulte la Declaración de Disponibilidad de Datos). En promedio, se analizaron aproximadamente 5600 partículas por tratamiento de PPA, para un total de aproximadamente 17 000 partículas (datos no mostrados).
Las células SH-SH5Y se colocaron en placas de cultivo de 8 cámaras (ThermoFisher, n.º 155411) para permitir la adhesión durante la noche y luego se incubaron con TMRE 1:1000 (ThermoFisher, n.º T669) y Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). teñido. Las imágenes se adquirieron utilizando láseres de 405 nm y 561 nm durante un entorno de 10 min, y las imágenes sin procesar se adquirieron como pilas z que contenían 10 micrografías de imagen con un paso z de 0,2 μm entre fotogramas de imagen en 12 puntos de tiempo posteriores. Las imágenes se recopilaron utilizando una plataforma de superresolución Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania) utilizando una lente LCI Plan Apochromate 100x/1,4 Oil DIC M27. Las imágenes se analizaron en ImageJ utilizando una secuencia descrita previamente y el complemento ImageJ para medir eventos de fusión y fisión, el número promedio de estructuras mitocondriales y el volumen mitocondrial promedio por célula33. Las macros MEL están disponibles en GitHub (consulte la Declaración de disponibilidad de datos).
Las células SH-SY5Y se cultivaron en placas de seis pocillos a una densidad de 0,3 × 106 células/ml durante 24 horas antes del tratamiento. El ARN se extrajo mediante el protocolo Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) con ligeras modificaciones: añadir 300 μl de tampón de lisis de ARN a cada pocillo antes de la extracción y lisar cada muestra como paso final con 30 μl de agua libre de elución de DNasa/RNasa. Se comprobó la cantidad y la calidad de todas las muestras con un espectrofotómetro UV-Vis NanoDrop ND-1000. La proteína total de los lisados ​​celulares se obtuvo utilizando 200 μl de tampón de lisis RIPA y la concentración de proteína se cuantificó mediante el ensayo de proteínas de Bradford70.
La síntesis de ADNc se realizó con el kit de síntesis de ADNc Tetro™ (BIO-65043, Meridian Bioscience), siguiendo las instrucciones del fabricante con algunas modificaciones. El ADNc se sintetizó en reacciones de 20 μl utilizando de 0,7 a 1 μg de ARN total. Los cebadores se seleccionaron de los artículos publicados previamente 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 y 78 (Tabla S1) y las sondas correspondientes se diseñaron con la herramienta PrimerQuest de Integrated DNA Technologies. Todos los genes de interés se normalizaron con respecto al gen nuclear B2M. La expresión génica de STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC y OPA1 se midió mediante RT-qPCR. La mezcla maestra incluyó LUNA Taq polimerasa (M3003L, New England Biolabs), cebadores directos e inversos 10 μM, ADNc y agua de grado PCR para producir un volumen final de 10 μL para cada reacción. La expresión de los genes de división y fisión (DRP1, MFN1/2) se midió utilizando ensayos multiplex TaqMan. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante con modificaciones menores. La mezcla maestra multiplex RT-qPCR incluye 1X LUNA Taq polimerasa, cebadores directos e inversos 10 μM, sonda 10 μM, ADNc y agua de grado PCR, lo que resulta en un volumen final de 20 μL para cada reacción. La RT-qPCR se realizó utilizando Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—número de serie: R0618110). Las condiciones de ciclado se muestran en la Tabla S1. Todas las muestras de ADNc se amplificaron por triplicado y se generó una curva estándar mediante una serie de diluciones décuples. Los valores atípicos en las muestras triplicadas con una desviación estándar (Ct) del umbral de ciclado > 0,5 se eliminaron del análisis para garantizar la reproducibilidad de los datos30,72. La expresión génica relativa se calculó mediante el método 2-ΔΔCt79.
Las muestras de proteína (60 μg) se mezclaron con tampón de carga Laemmli en una proporción 2:1 y se analizaron en un gel de proteína incoloro al 12 % (Bio-Rad n.° 1610184). Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (fluoruro de polivinilideno) (n.° 170-84156, Bio-Rad) mediante el sistema Trans-Blot Turbo (n.° 170-4155, Bio-Rad). La membrana se bloqueó y se incubó con los anticuerpos primarios adecuados (OPA1, MFN1, MFN2 y DRP1) (diluidos 1:1000) durante 48 horas, seguida de una incubación con anticuerpos secundarios (1:10 000) durante 1 hora. A continuación, se obtuvieron imágenes de las membranas con el sustrato Clarity Western ECL (n.° 170-5061, Bio-Rad) y se registraron con un sistema ChemiDoc MP de Bio-Rad. Se utilizó ImageLab versión 6.1 para el análisis Western blot. El gel y la transferencia originales se muestran en la Figura S1. La información sobre anticuerpos se proporciona en la Tabla S2.
Los conjuntos de datos se presentan como la media y el error estándar de la media (EEM) de al menos tres muestras independientes. Se evaluó la normalidad de los conjuntos de datos mediante la prueba de Shapiro-Wilks (salvo que se indique lo contrario) antes de asumir una distribución gaussiana con desviaciones estándar iguales y proceder con los análisis. Además, se analizó el conjunto de datos mediante la prueba MEL LSD de Fisher (p < 0,05), el ANOVA de una vía (media del tratamiento frente a la del control) y la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett para determinar la significancia (p < 0,05). Los valores p significativos se muestran en el gráfico como *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 y ****p < 0,0001. Todos los análisis estadísticos y gráficos se realizaron y generaron con GraphPad Prism 9.4.0.
Las macros Fiji/ImageJ para el análisis de imágenes TEM están disponibles públicamente en GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. La macro Localizador de Eventos Mitocondriales (MEL) está disponible públicamente en GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
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