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El ácido propiónico (PPA) se utiliza para estudiar el papel de la disfunción mitocondrial en trastornos del neurodesarrollo como el trastorno del espectro autista. Se sabe que el PPA altera la biogénesis, el metabolismo y el recambio mitocondrial. Sin embargo, los efectos del PPA sobre la dinámica, la fisión y la fusión mitocondriales siguen siendo problemáticos debido a la compleja naturaleza temporal de estos mecanismos. En este estudio, utilizamos técnicas de imagen cuantitativas complementarias para investigar cómo el PPA afecta la ultraestructura, la morfología y la dinámica mitocondrial en células SH-SY5Y similares a neuronas. El PPA (5 mM) causó una disminución significativa en el área mitocondrial (p < 0,01), el diámetro y la circunferencia de Feret (p < 0,05) y el área 2 (p < 0,01). El análisis del localizador de eventos mitocondriales mostró un aumento significativo (p < 0,05) en los eventos de fisión y fusión, manteniendo así la integridad de la red mitocondrial en condiciones de estrés. Además, la expresión de ARNm de cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) y OPA1 (p < 0,05) se redujo significativamente. 01). Esto ilustra la remodelación de la morfología, la biogénesis y la dinámica mitocondrial para mantener la función en condiciones de estrés. Nuestros datos proporcionan una nueva perspectiva sobre los efectos del PPA en la dinámica mitocondrial y resaltan la utilidad de las técnicas de imagen para estudiar los complejos mecanismos reguladores involucrados en las respuestas mitocondriales al estrés.
Las mitocondrias participan de manera integral en diversas funciones celulares, más allá de sus funciones típicas en la producción de energía y la biosíntesis. El metabolismo mitocondrial es un regulador clave de la señalización del calcio, la homeostasis metabólica y redox, la señalización inflamatoria, las modificaciones epigenéticas, la proliferación y diferenciación celular, y la muerte celular programada¹. En particular, el metabolismo mitocondrial es fundamental para el desarrollo, la supervivencia y la función neuronal, y está ampliamente implicado en diversas manifestaciones de neuropatología²,³,⁴.
En la última década, el estado metabólico ha surgido como un regulador central de la neurogénesis, la diferenciación, la maduración y la plasticidad5,6. Recientemente, la morfología y la dinámica mitocondrial se han convertido en componentes particularmente importantes de la mitosis, un proceso dinámico que mantiene una reserva de mitocondrias sanas dentro de las células. La dinámica mitocondrial está regulada por vías interdependientes complejas que abarcan desde la biogénesis y la bioenergética mitocondrial hasta la fisión, fusión, transporte y eliminación mitocondrial7,8. La alteración de cualquiera de estos mecanismos integradores perjudica el mantenimiento de redes mitocondriales sanas y tiene profundas consecuencias funcionales para el neurodesarrollo9,10. De hecho, la desregulación de la dinámica mitocondrial se observa en muchos trastornos psiquiátricos, neurodegenerativos y del neurodesarrollo, incluidos los trastornos del espectro autista (TEA)11,12.
El TEA es un trastorno del neurodesarrollo heterogéneo con una arquitectura genética y epigenética compleja. La heredabilidad del TEA es indiscutible, pero la etiología molecular subyacente sigue siendo poco comprendida. Los datos acumulados de modelos preclínicos, estudios clínicos y conjuntos de datos moleculares multiómicos proporcionan evidencia creciente de disfunción mitocondrial en el TEA13,14. Previamente realizamos un análisis de metilación del ADN a nivel genómico en una cohorte de pacientes con TEA e identificamos genes diferencialmente metilados agrupados a lo largo de las vías metabólicas mitocondriales15. Posteriormente, informamos sobre la metilación diferencial de reguladores centrales de la biogénesis y dinámica mitocondrial, que se asoció con un mayor número de copias de ADNmt y un perfil metabólico urinario alterado en el TEA16. Nuestros datos proporcionan evidencia creciente de que la dinámica y la homeostasis mitocondriales desempeñan un papel central en la fisiopatología del TEA. Por lo tanto, mejorar la comprensión mecanicista de la relación entre la dinámica, la morfología y la función mitocondrial es un objetivo clave de la investigación actual sobre enfermedades neurológicas caracterizadas por disfunción mitocondrial secundaria.
Las técnicas moleculares se utilizan a menudo para estudiar el papel de genes específicos en las respuestas al estrés mitocondrial. Sin embargo, este enfoque puede verse limitado por la naturaleza multifacética y temporal de los mecanismos de control mitótico. Además, la expresión diferencial de genes mitocondriales es un indicador indirecto de cambios funcionales, especialmente porque normalmente solo se analiza un número limitado de genes. Por lo tanto, se han propuesto métodos más directos para estudiar la función mitocondrial y la bioenergética17. La morfología mitocondrial está estrechamente relacionada con la dinámica mitocondrial. La forma, la conectividad y la estructura mitocondrial son fundamentales para la producción de energía y la supervivencia mitocondrial y celular5,18. Además, los diversos componentes de la mitosis se centran en los cambios en la morfología mitocondrial, que pueden servir como puntos finales útiles de la disfunción mitocondrial y proporcionar una base para estudios mecanísticos posteriores.
La morfología mitocondrial se puede observar directamente mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM), lo que permite un estudio detallado de la ultraestructura celular. La TEM visualiza directamente la morfología, la forma y la estructura de las crestas mitocondriales con la resolución de mitocondrias individuales, en lugar de depender únicamente de la transcripción génica, la expresión proteica o los parámetros funcionales mitocondriales en poblaciones celulares17,19,20. Además, la TEM facilita el estudio de las interacciones entre las mitocondrias y otros orgánulos, como el retículo endoplasmático y los autofagosomas, que desempeñan funciones clave en la función y la homeostasis mitocondrial21,22. Por lo tanto, esto convierte a la TEM en un buen punto de partida para estudiar la disfunción mitocondrial antes de centrarse en vías o genes específicos. A medida que la función mitocondrial adquiere mayor relevancia en neuropatología, existe una clara necesidad de poder estudiar de forma directa y cuantitativa la morfología y la dinámica mitocondrial en modelos neuronales in vitro.
En este artículo, examinamos la dinámica mitocondrial en un modelo neuronal de disfunción mitocondrial en el trastorno del espectro autista. Previamente informamos sobre la metilación diferencial de la propionil-CoA carboxilasa beta (PCCB) en el TEA15, una subunidad de la enzima mitocondrial propionil-CoA carboxilasa PCC. Se sabe que la desregulación de la PCC causa acumulación tóxica de derivados de propionilo, incluido el ácido propiónico (PPA)23,24,25. Se ha demostrado que el PPA altera el metabolismo neuronal y modifica el comportamiento in vivo, y es un modelo animal establecido para estudiar los mecanismos del neurodesarrollo involucrados en el TEA26,27,28. Además, se ha informado que el PPA altera el potencial de membrana mitocondrial, la biogénesis y la respiración in vitro, y se ha utilizado ampliamente para modelar la disfunción mitocondrial en neuronas29,30. Sin embargo, el impacto de la disfunción mitocondrial inducida por PPA en la morfología y la dinámica mitocondrial sigue siendo poco comprendido.
Este estudio utiliza técnicas de imagen complementarias para cuantificar los efectos del PPA en la morfología, la dinámica y la función mitocondrial en células SH-SY5Y. Primero, desarrollamos un método de TEM para visualizar los cambios en la morfología y la ultraestructura mitocondrial17,31,32. Dada la naturaleza dinámica de las mitocondrias33, también utilizamos el análisis de localización de eventos mitocondriales (MEL) para cuantificar los cambios en el equilibrio entre los eventos de fisión y fusión, el número y el volumen mitocondrial bajo estrés por PPA. Finalmente, examinamos si la morfología y la dinámica mitocondrial están asociadas con cambios en la expresión de genes involucrados en la biogénesis, la fisión y la fusión. En conjunto, nuestros datos ilustran el desafío de dilucidar la complejidad de los mecanismos que regulan la dinámica mitocondrial. Resaltamos la utilidad del TEM para estudiar la morfología mitocondrial como un punto final convergente medible de la mitosis en células SH-SY5Y. Además, destacamos que los datos de TEM proporcionan la información más completa cuando se combinan con técnicas de imagen que también capturan eventos dinámicos en respuesta al estrés metabólico. Una mayor caracterización de los mecanismos reguladores moleculares que sustentan la mitosis de las células neuronales podría aportar información importante sobre el componente mitocondrial del sistema nervioso y las enfermedades neurodegenerativas.
Para inducir estrés mitocondrial, las células SH-SY5Y se trataron con PPA utilizando propionato de sodio (NaP) de 3 mM y 5 mM. Antes de la TEM, las muestras se sometieron a preparación criogénica mediante congelación a alta presión (Fig. 1a). Desarrollamos un proceso automatizado de análisis de imágenes mitocondriales para medir ocho parámetros morfológicos de poblaciones mitocondriales en tres réplicas biológicas. Encontramos que el tratamiento con PPA cambió significativamente cuatro parámetros: área 2, área, perímetro y diámetro de Feret (Fig. 1b–e). El área 2 disminuyó significativamente con ambos tratamientos de PPA de 3 mM y 5 mM (p = 0,0183 y p = 0,002, respectivamente) (Fig. 1b), mientras que el área (p = 0,003), el perímetro (p = 0,0106) y el diámetro de Feret disminuyeron significativamente. Hubo una reducción significativa (p = 0,0172) en el grupo de tratamiento de 5 mM en comparación con el grupo control (Fig. 1c–e). Las reducciones significativas en el área y la circunferencia mostraron que las células tratadas con 5 mM de PPA tenían mitocondrias más pequeñas y redondeadas, y que estas mitocondrias eran menos alargadas que las de las células control. Esto también es consistente con una disminución significativa en el diámetro de Feret, un parámetro independiente que indica una disminución en la distancia máxima entre los bordes de las partículas. Se observaron cambios en la ultraestructura de las crestas: las crestas se volvieron menos pronunciadas bajo la influencia del estrés de PPA (Fig. 1a, panel B). Sin embargo, no todas las imágenes reflejaron claramente la ultraestructura de las crestas, por lo que no se realizó un análisis cuantitativo de estos cambios. Estos datos de TEM pueden reflejar tres posibles escenarios: (1) el PPA aumenta la fisión o inhibe la fusión, lo que provoca que las mitocondrias existentes se reduzcan de tamaño; (2) la biogénesis aumentada crea mitocondrias nuevas y más pequeñas; o (3) induce ambos mecanismos simultáneamente. Aunque estas condiciones no se pueden distinguir mediante TEM, los cambios morfológicos significativos indican cambios en la homeostasis y la dinámica mitocondrial bajo el estrés de PPA. Posteriormente, exploramos parámetros adicionales para caracterizar mejor estas dinámicas y los posibles mecanismos subyacentes.
El ácido propiónico (PPA) remodela la morfología mitocondrial. (a) Imágenes representativas de microscopía electrónica de transmisión (TEM) que muestran que el tamaño mitocondrial disminuye y las mitocondrias se vuelven más pequeñas y redondeadas con el aumento del tratamiento con PPA; 0 mM (sin tratamiento), 3 mM y 5 mM, respectivamente. Las flechas rojas indican mitocondrias. (b–e) Las células SH-SY5Y tratadas con PPA durante 24 h se prepararon para TEM y los resultados se analizaron usando Fiji/ImageJ. Cuatro de los ocho parámetros mostraron diferencias significativas entre las células control (sin tratamiento, 0 mM PPA) y tratadas (3 mM y 5 mM PPA). (b) Región 2, (c) Área, (d) Perímetro, (e) Diámetro de Feret. Se utilizó un análisis de varianza unidireccional (control vs. tratamiento) y la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett para determinar diferencias significativas (p < 0,05). Los puntos de datos representan el valor mitocondrial promedio para cada célula individual, y las barras de error representan la media ± SEM. Los datos mostrados representan n = 3, con al menos 24 células por réplica; se analizaron un total de 266 imágenes; * indica p < 0,05, ** indica p < 0,01.
Para caracterizar mejor cómo responden las dinámicas mitocondriales al PPA, teñimos las mitocondrias con éster etílico de tetrametilrodamina (TMRE) y utilizamos microscopía de lapso de tiempo y análisis MEL para localizar y cuantificar las mitocondrias después de 24 horas a 3 y 5 mM de PPA. Tratamiento de eventos de fisión y fusión. (Fig. 2a). Después del análisis MEL, las mitocondrias se analizaron más a fondo para cuantificar el número de estructuras mitocondriales y su volumen promedio. Observamos un pequeño pero significativo aumento en el número de eventos de fisión que ocurren a 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] en comparación con los eventos de fisión [5,6 ± 0,3 (p < 0,05) )] y fusión [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] y fusión [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] 0,05)] <0,05)] que aumentaron significativamente a 5 mM en comparación con el control (Fig. 3b). El número de mitocondrias aumentó significativamente tanto a 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] como a 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Fig. 3c), mientras que el volumen promedio de cada estructura mitocondrial permaneció sin cambios (Fig. 3c). 3d). En conjunto, esto sugiere que la remodelación de la dinámica mitocondrial actúa como una respuesta compensatoria que mantiene con éxito la integridad de la red mitocondrial. El aumento en el número de eventos de fisión a 3 mM de PPA sugiere que el incremento en el número de mitocondrias se debe en parte a la fisión mitocondrial, pero dado que el volumen mitocondrial promedio permanece prácticamente inalterado, no se puede descartar la biogénesis como una respuesta compensatoria adicional. Sin embargo, estos datos son consistentes con las estructuras mitocondriales más pequeñas y redondas observadas mediante TEM y también demuestran cambios significativos en la dinámica mitocondrial inducidos por PPA.
El ácido propiónico (PPA) induce una remodelación mitocondrial dinámica para mantener la integridad de la red. Se cultivaron células SH-SY5Y, se trataron con 3 y 5 mM de PPA durante 24 horas y se tiñeron con TMRE y Hoechst 33342, seguido de un análisis MEL. (a) Imágenes representativas de microscopía de lapso de tiempo que muestran proyecciones de intensidad máxima binarizadas y en color en el tiempo 2 (t2) para cada condición. Las regiones seleccionadas indicadas en cada imagen binaria se mejoran y se muestran en 3D en tres marcos de tiempo diferentes (t1-t3) para ilustrar la dinámica a lo largo del tiempo; los eventos de fusión se resaltan en verde; los eventos de fisión se resaltan en verde. Se muestran en rojo. (b) Número promedio de eventos dinámicos por condición. (c) Número promedio de estructuras mitocondriales por célula. (d) Volumen promedio (µm3) de cada estructura mitocondrial por célula. Los datos mostrados son representativos de n = 15 células por grupo de tratamiento. Las barras de error mostradas representan la media ± SEM, barra de escala = 10 μm, * p < 0,05.
El ácido propiónico (PPA) causa la supresión transcripcional de genes asociados con la dinámica mitocondrial. Las células SH-SY5Y se trataron con 3 y 5 mM de PPA durante 24 h. La cuantificación relativa de genes se realizó mediante RT-qPCR y se normalizó con B2M. Genes de biogénesis mitocondrial (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 y (d) NFE2L2. Genes de fusión y fisión mitocondrial (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 e (i) DRP1. Las diferencias significativas (p < 0,05) se probaron usando ANOVA de una vía (control vs. tratamiento) y la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett: * indica p < 0,05, ** indica p < 0,01 y **** indica p < 0,0001. Las barras representan la expresión media ± SEM. Los datos mostrados representan n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) y n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) réplicas biológicas.
Los datos de los análisis TEM y MEL indican que el PPA altera la morfología y la dinámica mitocondrial. Sin embargo, estas técnicas de imagen no proporcionan información sobre los mecanismos subyacentes que impulsan estos procesos. Por lo tanto, examinamos la expresión de ARNm de nueve reguladores clave de la dinámica, la biogénesis y la mitosis mitocondriales en respuesta al tratamiento con PPA. Cuantificamos el oncogén del mieloma celular (cMYC), el factor respiratorio nuclear (NRF1), el factor de transcripción mitocondrial 1 (TFAM), el factor de transcripción similar a NFE2 BZIP (NFE2L2), la proteína similar a la gastrina 2 (STOML2), la atrofia del nervio óptico 1 (OPA1), la mitofusina 1 (MFN1), la mitofusina 2 (MFN2) y la proteína relacionada con la dinamina 1 (DRP1) después de 24 horas de tratamiento con 3 mM y 5 mM de PPA. Observamos un tratamiento con PPA de 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 y p < 0,0001, respectivamente) y 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001). (Fig. 3a–c). La disminución en la expresión de ARNm fue dosis-dependiente: la expresión de cMYC, NRF1 y TFAM disminuyó 5,7, 2,6 y 1,9 veces a 3 mM, respectivamente, y 11,2, 3 y 2,2 veces a 5 mM. Por el contrario, el gen central de biogénesis redox NFE2L2 no se alteró en ninguna concentración de PPA, aunque se observó una tendencia dosis-dependiente similar de disminución de la expresión (Fig. 3d).
También examinamos la expresión de genes clásicos involucrados en la regulación de la fisión y fusión. Se cree que STOML2 está involucrado en la fusión, mitofagia y biogénesis, y su expresión se redujo significativamente (p < 0,0001) por 3 mM (cambio de 2,4 veces) y 5 mM (cambio de 2,8 veces) de PPA (Fig. 1). 3d). De manera similar, la expresión del gen de fusión OPA1 disminuyó a 3 mM (cambio de 1,6 veces) y 5 mM (cambio de 1,9 veces) de PPA (p = 0,006 y p = 0,0024, respectivamente) (Fig. 3f). Sin embargo, no encontramos diferencias significativas en la expresión de los genes de fusión MFN1, MFN2 o el gen de fisión DRP1 bajo estrés de PPA de 24 h (Fig. 3g–i). Además, observamos que los niveles de cuatro proteínas de fusión y fisión (OPA1, MFN1, MFN2 y DRP1) no variaron bajo las mismas condiciones (Fig. 4a–d). Es importante destacar que estos datos reflejan un momento puntual y podrían no reflejar los cambios en la expresión o actividad proteica durante las primeras etapas del estrés por PPA. Sin embargo, las reducciones significativas en la expresión de cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 y OPA1 indican una importante desregulación transcripcional del metabolismo, la biogénesis y la dinámica mitocondrial. Asimismo, estos datos resaltan la utilidad de las técnicas de imagen para estudiar directamente los cambios en la función mitocondrial en su estado final.
Los niveles de proteína de los factores de fusión y fisión no cambiaron después del tratamiento con ácido propiónico (PPA). Las células SH-SY5Y se trataron con 3 y 5 mM de PPA durante 24 h. Los niveles de proteína se cuantificaron mediante análisis de Western blot, y los niveles de expresión se normalizaron con respecto a la proteína total. Se muestra la expresión proteica promedio y los Western blots representativos de la proteína diana y la proteína total. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Las barras representan la media ± SEM, y los datos mostrados son representativos de n = 3 réplicas biológicas. Se realizaron comparaciones múltiples (p < 0,05) utilizando análisis de varianza unidireccional y la prueba de Dunnett. El gel y el blot originales se muestran en la Figura S1.
La disfunción mitocondrial se asocia con enfermedades multisistémicas que abarcan desde enfermedades metabólicas, cardiovasculares y musculares hasta enfermedades neurológicas1,10. Muchas enfermedades neurodegenerativas se asocian con la disfunción mitocondrial, lo que subraya la importancia de estos orgánulos a lo largo de la vida del cerebro. Estas enfermedades incluyen la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y el TEA3,4,18. Sin embargo, el acceso al tejido cerebral para estudiar estas enfermedades es difícil, especialmente a nivel mecanicista, lo que hace que los sistemas modelo celulares sean una alternativa necesaria. En este estudio, utilizamos un sistema modelo celular con células SH-SY5Y tratadas con PPA para reproducir la disfunción mitocondrial observada en enfermedades neuronales, en particular en los trastornos del espectro autista. El uso de este modelo de PPA para estudiar la dinámica mitocondrial en neuronas puede aportar información sobre la etiología del TEA.
Exploramos la posibilidad de usar TEM para ver cambios en la morfología mitocondrial. Es importante señalar que TEM debe usarse correctamente para maximizar su efectividad. La preparación de crioespecímenes permite una mejor preservación de las estructuras neuronales al fijar simultáneamente los componentes celulares y reducir la formación de artefactos34. En consonancia con esto, observamos que las células SH-SY5Y similares a neuronas tenían orgánulos subcelulares intactos y mitocondrias alargadas (Fig. 1a). Esto resalta la utilidad de las técnicas de preparación criogénica para estudiar la morfología mitocondrial en modelos de células neuronales. Aunque las mediciones cuantitativas son críticas para el análisis objetivo de datos TEM, todavía no hay consenso sobre qué parámetros específicos deben medirse para confirmar cambios morfológicos mitocondriales. Basándonos en una gran cantidad de estudios que han examinado cuantitativamente la morfología mitocondrial17,31,32, desarrollamos un flujo de trabajo automatizado de análisis de imágenes mitocondriales que mide ocho parámetros morfológicos, a saber: área, área2, relación de aspecto, perímetro, circularidad, grado, diámetro de Feret y redondez.
Entre ellos, PPA redujo significativamente el área 2, el área, el perímetro y el diámetro de Feret (Fig. 1b–e). Esto mostró que las mitocondrias se volvieron más pequeñas y redondeadas, lo cual es consistente con estudios previos que muestran una disminución en el área mitocondrial después de 72 horas de estrés mitocondrial inducido por PPA30. Estas características morfológicas pueden indicar fisión mitocondrial, un proceso necesario para secuestrar componentes dañados de la red mitocondrial para promover su degradación a través de la mitofagia35,36,37. Por otro lado, la disminución en el tamaño mitocondrial promedio puede estar asociada con un aumento de la biogénesis, lo que resulta en la formación de mitocondrias nacientes pequeñas. El aumento de la fisión o la biogénesis representa una respuesta compensatoria para mantener la mitosis frente al estrés mitocondrial. Sin embargo, no se pueden descartar la disminución del crecimiento mitocondrial, la fusión alterada u otras condiciones.
Aunque las imágenes de alta resolución creadas por TEM permiten determinar las características morfológicas a nivel de mitocondrias individuales, este método produce instantáneas bidimensionales en un único punto en el tiempo. Para estudiar las respuestas dinámicas al estrés metabólico, teñimos las mitocondrias con TMRE y utilizamos microscopía de lapso de tiempo con análisis MEL, que permite la visualización 3D de alto rendimiento de los cambios en la red mitocondrial a lo largo del tiempo33,38. Observamos cambios sutiles pero significativos en la dinámica mitocondrial bajo estrés por PPA (Fig. 2). A 3 mM, el número de eventos de fisión aumentó significativamente, mientras que los eventos de fusión se mantuvieron iguales que en el control. Se observó un aumento en el número de eventos de fisión y fusión a 5 mM de PPA, pero estos cambios fueron aproximadamente proporcionales, lo que sugiere que la cinética de fisión y fusión alcanza el equilibrio a concentraciones más altas (Fig. 2b). El volumen mitocondrial promedio se mantuvo sin cambios tanto a 3 como a 5 mM de PPA, lo que indica que la integridad de la red mitocondrial se conservó (Fig. 2d). Esto refleja la capacidad de las redes mitocondriales dinámicas para responder a un estrés metabólico leve y mantener la homeostasis de manera efectiva sin causar fragmentación de la red. A 3 mM de PPA, el aumento de la fisión es suficiente para promover la transición a un nuevo equilibrio, pero se requiere una remodelación cinética más profunda en respuesta al estrés inducido por concentraciones más altas de PPA.
El número de mitocondrias aumentó en ambas concentraciones de estrés de PPA, pero el volumen mitocondrial promedio no cambió significativamente (Fig. 2c). Esto podría deberse a un aumento de la biogénesis o de la división; sin embargo, en ausencia de una disminución significativa del volumen mitocondrial promedio, es más probable que aumente la biosíntesis. No obstante, los datos de la Figura 2 respaldan la existencia de dos mecanismos compensatorios: un aumento en el número de eventos de fisión, consistente con la regulación positiva de la fisión mitocondrial, y un aumento en el número de eventos, consistente con la biogénesis mitocondrial. En última instancia, la compensación dinámica para el estrés leve podría consistir en procesos simultáneos que involucran fisión, fusión, biogénesis y mitofagia. Si bien autores anteriores han demostrado que el PPA aumenta la mitosis30,39 y la mitofagia29, aportamos evidencia de la remodelación de la dinámica de fisión y fusión mitocondrial en respuesta al PPA. Estos datos confirman los cambios morfológicos observados mediante TEM y proporcionan una mayor comprensión de los mecanismos asociados con la disfunción mitocondrial inducida por PPA.
Dado que ni el análisis TEM ni el MEL proporcionaron evidencia directa de los mecanismos de regulación genética subyacentes a los cambios morfológicos observados, examinamos la expresión de ARN de genes involucrados en el metabolismo, la biogénesis y la dinámica mitocondrial. El protooncogén cMYC es un factor de transcripción involucrado en la regulación de las mitocondrias, la glucólisis y el metabolismo de aminoácidos y ácidos grasos40. Además, se sabe que cMYC regula la expresión de casi 600 genes mitocondriales involucrados en la transcripción, la traducción y el ensamblaje de complejos mitocondriales, incluidos NRF1 y TFAM41. NRF1 y TFAM son dos reguladores centrales de la mitosis, que actúan después de PGC-1α para activar la replicación del ADNmt. Esta vía se activa mediante la señalización de cAMP y AMPK y es sensible al gasto energético y al estrés metabólico. También examinamos NFE2L2, un regulador redox de la biogénesis mitocondrial, para determinar si los efectos de PPA podrían estar mediados por el estrés oxidativo.
Aunque la expresión de NFE2L2 permaneció sin cambios, encontramos una disminución constante dependiente de la dosis en la expresión de cMYC, NRF1 y TFAM después de 24 h de tratamiento con 3 mM y 5 mM de PPA (Fig. 3a–c). La regulación negativa de la expresión de cMYC se ha descrito previamente como una respuesta al estrés mitocondrial42, y, a la inversa, la regulación negativa de la expresión de cMYC puede causar disfunción mitocondrial al remodelar el metabolismo mitocondrial, la conectividad de la red y la polarización de la membrana43. Curiosamente, cMYC también participa en la regulación de la fisión y fusión mitocondrial42,43 y se sabe que aumenta la fosforilación de DRP1 y la localización mitocondrial durante la división celular44, así como que media la remodelación morfológica mitocondrial en células madre neuronales45. De hecho, los fibroblastos deficientes en cMYC exhiben un tamaño mitocondrial reducido, lo que concuerda con los cambios inducidos por el estrés de PPA43. Estos datos ilustran una relación interesante, aunque aún no clara, entre cMYC y la dinámica mitocondrial, lo que proporciona un objetivo interesante para futuros estudios sobre la remodelación inducida por el estrés de PPA.
La reducción de NRF1 y TFAM es consistente con el papel de cMYC como un importante activador transcripcional. Estos datos también son consistentes con estudios previos en células de cáncer de colon humano que muestran que PPA redujo la expresión de ARNm de NRF1 a las 22 horas, lo que se asoció con el agotamiento de ATP y el aumento de ROS46. Estos autores también informaron que la expresión de TFAM aumentó a las 8,5 horas, pero volvió a los niveles basales a las 22 horas. En contraste, Kim et al. (2019) mostraron que la expresión de ARNm de TFAM disminuyó significativamente después de 4 h de estrés por PPA en células SH-SY5Y; sin embargo, después de 72 horas, la expresión de la proteína TFAM aumentó significativamente y el número de copias de ADNmt aumentó significativamente. Por lo tanto, la disminución en el número de genes de biogénesis mitocondrial que observamos después de 24 horas no excluye la posibilidad de que el aumento en el número de mitocondrias esté asociado con la activación de la biogénesis en momentos más tempranos. Estudios previos han demostrado que el PPA aumenta significativamente la expresión de ARNm y proteína de PGC-1α en células SH-SY5Y a las 4 horas y 30 minutos, mientras que el ácido propiónico mejora la biogénesis mitocondrial en hepatocitos de ternero a través de PGC-1α a las 12 horas y 39 minutos. Curiosamente, PGC-1α no solo es un regulador transcripcional directo de NRF1 y TFAM, sino que también se ha demostrado que regula la actividad de MFN2 y DRP1 mediante la regulación de la fisión y la fusión47. En conjunto, esto resalta el estrecho acoplamiento de los mecanismos que regulan las respuestas compensatorias mitocondriales inducidas por el PPA. Además, nuestros datos reflejan una desregulación significativa de la regulación transcripcional de la biogénesis y el metabolismo bajo estrés por PPA.
Los genes STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 y DRP1 se encuentran entre los reguladores centrales de la fisión, fusión y dinámica mitocondrial37,48,49. Hay muchos otros genes involucrados en la dinámica mitocondrial; sin embargo, se ha encontrado previamente que STOML2, OPA1 y MFN2 están diferencialmente metilados en cohortes de TEA,16 y varios estudios independientes han informado cambios en estos factores de transcripción en respuesta al estrés mitocondrial50,51. 52. La expresión de OPA1 y STOML2 se redujo significativamente con el tratamiento con 3 mM y 5 mM de PPA (Fig. 3e, f). OPA1 es uno de los reguladores clásicos de la fusión mitocondrial a través de la interacción directa con MFN1 y 2 y juega un papel en la remodelación de las crestas y la morfología mitocondrial53. Aún no está claro el papel preciso de STOML2 en la dinámica mitocondrial, pero la evidencia sugiere que desempeña un papel en la fusión mitocondrial, la biogénesis y la mitofagia.
STOML2 participa en el mantenimiento del acoplamiento respiratorio mitocondrial y la formación de complejos de la cadena respiratoria54,55 y se ha demostrado que altera profundamente las características metabólicas de las células cancerosas56. Los estudios han demostrado que STOML2 promueve el potencial de membrana mitocondrial y la biogénesis a través de la interacción con BAN y cardiolipina 55, 57, 58. Además, estudios independientes han demostrado que la interacción entre STOML2 y PINK1 regula la mitofagia59,60. Cabe destacar que se ha informado que STOML2 interactúa directamente con MFN2 y lo estabiliza, y también desempeña un papel importante en la estabilización de isoformas largas de OPA1 al inhibir la proteasa responsable de la degradación de OPA153,61,62. La reducción en la expresión de STOML2 observada en las reacciones de PPA puede hacer que estas proteínas de fusión sean más susceptibles a la degradación a través de vías dependientes de ubiquitina y proteasoma48. Aunque el papel preciso de STOML2 y OPA1 en la respuesta dinámica al PPA no está claro, la disminución de la expresión de estos genes de fusión (Figura 3) puede alterar el equilibrio entre fisión y fusión y conducir a una disminución del tamaño mitocondrial (Figura 3). 1).
Por otro lado, la expresión de la proteína OPA1 permaneció sin cambios después de 24 h, mientras que los niveles de ARNm y proteína de MFN1, MFN2 o DRP1 no cambiaron significativamente después del tratamiento con PPA (Fig. 3g-i, Fig. 4). Esto puede indicar que no hay cambios en la regulación de estos factores involucrados en la fusión y fisión mitocondrial. Sin embargo, cabe destacar que cada uno de estos cuatro genes también está regulado por modificaciones postranscripcionales (PTM) que controlan la actividad proteica. OPA1 tiene ocho variantes de empalme alternativas que se escinden proteolíticamente en las mitocondrias para producir dos isoformas distintas 63. El equilibrio entre las isoformas largas y cortas determina en última instancia el papel de OPA1 en la fusión mitocondrial y el mantenimiento de la red mitocondrial64. La actividad de DRP1 está regulada por la fosforilación de la proteína quinasa II dependiente de calcio/calmodulina (CaMKII), mientras que la degradación de DRP1 está regulada por la ubiquitinación y la SUMOilación65. Finalmente, tanto DRP1 como MFN1/2 son GTPasas, por lo que su actividad puede verse influenciada por la tasa de producción de GTP en las mitocondrias 66. Por lo tanto, aunque la expresión de estas proteínas permanece constante, esto puede no reflejar una actividad o localización proteica inalterada67,68. De hecho, los repertorios de proteínas PTM existentes suelen servir como primera línea de defensa responsable de mediar las respuestas al estrés agudo. En presencia de estrés metabólico moderado en nuestro modelo, es probable que PTM promueva una mayor actividad de las proteínas de fusión y fisión para restaurar suficientemente la integridad mitocondrial sin requerir la activación adicional de estos genes a nivel de ARNm o proteína.
En conjunto, los datos anteriores resaltan la regulación compleja y dependiente del tiempo de la morfología mitocondrial y los desafíos para dilucidar estos mecanismos. Para estudiar la expresión génica, primero es necesario identificar genes diana específicos en la vía. Sin embargo, nuestros datos muestran que los genes en la misma vía no responden de la misma manera al mismo estrés. De hecho, estudios previos han demostrado que diferentes genes en la misma vía pueden exhibir diferentes perfiles de respuesta temporal30,46. Además, existen complejos mecanismos postranscripcionales que alteran la relación entre la transcripción y la función génica. Los estudios proteómicos pueden proporcionar información sobre el impacto de las PTM y la función de las proteínas, pero también plantean desafíos que incluyen métodos de bajo rendimiento, altas relaciones señal-ruido y baja resolución.
En este contexto, el estudio de la morfología mitocondrial mediante TEM y MEL tiene un gran potencial para abordar cuestiones fundamentales sobre la relación entre la dinámica y la función mitocondrial y cómo esto influye en las enfermedades. Lo más importante es que TEM proporciona un método directo para medir la morfología mitocondrial como un punto final convergente de la disfunción y la dinámica mitocondrial51. MEL también proporciona un método directo para visualizar los eventos de fisión y fusión en un entorno celular tridimensional, lo que permite cuantificar la remodelación mitocondrial dinámica incluso en ausencia de cambios en la expresión génica33. Aquí destacamos la utilidad de las técnicas de imagen mitocondrial en las enfermedades mitocondriales secundarias. Estas enfermedades se caracterizan típicamente por un estrés metabólico crónico leve, caracterizado por una remodelación sutil de las redes mitocondriales en lugar de un daño mitocondrial agudo. Sin embargo, la compensación mitocondrial necesaria para mantener la mitosis bajo estrés crónico tiene profundas consecuencias funcionales. En el contexto de la neurociencia, una mejor comprensión de estos mecanismos compensatorios puede proporcionar información importante sobre la neuropatología pleiotrópica asociada con la disfunción mitocondrial.
En definitiva, nuestros datos resaltan la utilidad de las técnicas de imagen para comprender las consecuencias funcionales de las complejas interacciones entre la expresión génica, las modificaciones proteicas y la actividad proteica que controlan la dinámica mitocondrial neuronal. Utilizamos PPA para modelar la disfunción mitocondrial en un modelo de célula neuronal y así comprender mejor el componente mitocondrial del TEA. Las células SH-SY5Y tratadas con PPA mostraron cambios en la morfología mitocondrial: las mitocondrias se volvieron pequeñas y redondas, y las crestas estaban mal definidas al observarlas mediante TEM. El análisis MEL muestra que estos cambios ocurren concomitantemente con un aumento en los eventos de fisión y fusión para mantener la red mitocondrial en respuesta a un estrés metabólico leve. Además, el PPA altera significativamente la regulación transcripcional del metabolismo y la homeostasis mitocondrial. Identificamos cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 y OPA1 como reguladores mitocondriales clave afectados por el estrés del PPA, que podrían desempeñar un papel en la mediación de los cambios inducidos por el PPA en la morfología y la función mitocondrial. Se necesitan estudios futuros para caracterizar mejor los cambios temporales inducidos por PPA en la expresión génica, la actividad proteica, la localización y las modificaciones postraduccionales. Nuestros datos resaltan la complejidad e interdependencia de los mecanismos reguladores que median la respuesta al estrés mitocondrial y demuestran la utilidad de la microscopía electrónica de transmisión (TEM) y otras técnicas de imagen para estudios mecanísticos más específicos.
La línea celular SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) se adquirió de Sigma-Aldrich. Las células SH-SY5Y se cultivaron en una mezcla de medio Eagle modificado de Dulbecco/nutrientes F-12 (DMEM/F-12) y L-glutamina (SC09411, ScienCell) en matraces de 25 cm2 suplementados con 20% de suero fetal bovino (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) y 1% de penicilina-estreptomicina (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) a 37 °C y 5% de CO2. Las células se subcultivaron hasta alcanzar una confluencia del 80% utilizando tripsina-EDTA al 0,05% (15400054, ThermoFisher Scientific), se centrifugaron a 300 g y se sembraron a una densidad aproximada de 7 × 10⁵ células/ml. Todos los experimentos se realizaron en células SH-SY5Y no diferenciadas entre los pasajes 19 y 22. El PPA se administra como NaP. Disuelva el polvo de NaP (CAS n.° 137-40-6, fórmula química C₃H₅NaO₂, P5436-100G, Sigma-Aldrich) en agua MilliQ tibia hasta una concentración de 1 M y almacene a 4 °C. El día del tratamiento, diluya esta solución con 1 M de PPA hasta 3 mM y 5 mM de PPA en medio libre de suero (DMEM/F-12 con L-glutamina). Las concentraciones de tratamiento para todos los experimentos fueron: sin PPA (0 mM, control), 3 mM y 5 mM de PPA. Los experimentos se realizaron con al menos tres réplicas biológicas.
Las células SH-SY5Y se sembraron en matraces de 25 cm5 a una tasa de 5,5 × 105 células/ml y se cultivaron durante 24 horas. El tratamiento con PPA se añadió al matraz antes de las 24 h de incubación. Se recolectaron los sedimentos celulares siguiendo los protocolos normales de subcultivo de tejido de mamíferos (descritos anteriormente). El sedimento celular se resuspendió en 100 µl de glutaraldehído al 2,5%, 1× PBS y se almacenó a 4 °C hasta su procesamiento. Las células SH-SY5Y se centrifugaron brevemente para sedimentar las células y eliminar la solución de glutaraldehído al 2,5%, 1× PBS. El sedimento se resuspendió en un gel de agarosa al 4% preparado en agua destilada (la proporción de volumen de agarosa a sedimento es 1:1). Los trozos de agarosa se colocaron en rejillas en placas planas y se recubrieron con 1-hexadeceno antes de la congelación a alta presión. Las muestras se congelaron en acetona seca al 100% a -90 °C durante 24 horas. Luego se elevó la temperatura a -80 °C y se añadió una solución de tetróxido de osmio al 1% y glutaraldehído al 0,1%. Las muestras se almacenaron a -80 °C durante 24 horas. Después, la temperatura se aumentó gradualmente hasta alcanzar la temperatura ambiente durante varios días: de -80 °C a -50 °C durante 24 horas, a -30 °C durante 24 horas, a -10 °C durante 24 horas y finalmente a temperatura ambiente.
Tras la preparación criogénica, las muestras se impregnaron con resina y se obtuvieron secciones ultrafinas (∼100 nm) mediante un ultramicrótomo Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Las secciones se tiñeron con acetato de uranilo al 2 % y citrato de plomo. Las muestras se observaron con un microscopio electrónico de transmisión FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (anteriormente FEI), Eindhoven, Países Bajos) que operaba a 200 kV (transmisor Lab6) y una cámara CCD Gatan (Gatan, Reino Unido) equipada con un filtro de energía Tridiem.
En cada réplica técnica, se adquirieron al menos 24 imágenes de células individuales, para un total de 266 imágenes. Todas las imágenes se analizaron utilizando la macro de Región de Interés (ROI) y la macro de Mitocondrias. La macro mitocondrial se basa en métodos publicados17,31,32 y permite el procesamiento por lotes semiautomático de imágenes TEM en Fiji/ImageJ69. En resumen: la imagen se invierte y se vuelve a invertir utilizando la sustracción de fondo de bola rodante (radio de 60 píxeles) y un filtro de paso de banda FFT (utilizando límites superior e inferior de 60 y 8 píxeles respectivamente) y supresión de línea vertical con una tolerancia de orientación del 5%. La imagen procesada se umbraliza automáticamente utilizando un algoritmo de entropía máxima y se genera una máscara binaria. Se extrajeron las regiones de la imagen asociadas con las ROI seleccionadas manualmente en las imágenes TEM sin procesar, caracterizando las mitocondrias y excluyendo la membrana plasmática y otras regiones de alto contraste. Para cada ROI extraída, se analizaron partículas binarias de más de 600 píxeles, y se midieron el área, el perímetro, los ejes mayor y menor, el diámetro de Feret, la redondez y la circularidad de las partículas utilizando las funciones de medición integradas de Fiji/ImageJ. Siguiendo a Merrill, Flippo y Strack (2017), se calculó el área 2, la relación de aspecto de la partícula (relación entre el eje mayor y el menor) y el factor de forma (FF) a partir de estos datos, donde FF = perímetro 2/4pi x área. La definición de la fórmula paramétrica se puede encontrar en Merrill, Flippo y Strack (2017). Las macros mencionadas están disponibles en GitHub (ver Declaración de disponibilidad de datos). En promedio, se analizaron aproximadamente 5600 partículas por tratamiento PPA, para un total de aproximadamente 17 000 partículas (datos no mostrados).
Las células SH-SH5Y se colocaron en placas de cultivo de 8 cámaras (ThermoFisher, n.° 155411) para permitir la adhesión durante la noche y luego se incubaron con TMRE 1:1000 (ThermoFisher, n.° T669) y Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Las imágenes se adquirieron utilizando láseres de 405 nm y 561 nm durante un entorno de 10 min, y las imágenes sin procesar se adquirieron como pilas z que contenían 10 micrografías de imágenes con un paso az de 0,2 μm entre fotogramas de imágenes en 12 puntos de tiempo subsiguientes. Las imágenes se recopilaron utilizando una plataforma de superresolución Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania) utilizando una lente LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Las imágenes se analizaron en ImageJ utilizando un flujo de trabajo descrito previamente y el complemento de ImageJ para medir los eventos de fusión y fisión, el número promedio de estructuras mitocondriales y el volumen mitocondrial promedio por célula33. Las macros MEL están disponibles en GitHub (consulte la Declaración de disponibilidad de datos).
Las células SH-SY5Y se cultivaron en placas de seis pocillos a una densidad de 0,3 × 10⁶ células/mL durante 24 horas antes del tratamiento. El ARN se extrajo utilizando el protocolo Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) con ligeras modificaciones: agregar 300 μl de tampón de lisis de ARN a cada pocillo antes de la extracción y lisar cada muestra como paso final con 30 μl de elución de DNasa/RNasa. Agua libre de -. Todas las muestras se verificaron en cuanto a cantidad y calidad utilizando un espectrofotómetro UV-Vis NanoDrop ND-1000. La proteína total de los lisados ​​celulares se obtuvo utilizando 200 μl de tampón de lisis RIPA, y la concentración de proteína se cuantificó utilizando el ensayo de proteínas de Bradford70.
La síntesis de ADNc se realizó utilizando el kit de síntesis de ADNc Tetro™ (BIO-65043, Meridian Bioscience) según las instrucciones del fabricante con algunas modificaciones. El ADNc se sintetizó en reacciones de 20 μl utilizando de 0,7 a 1 μg de ARN total. Los cebadores se seleccionaron de artículos publicados previamente 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tabla S1) y las sondas correspondientes se diseñaron utilizando la herramienta PrimerQuest de Integrated DNA Technologies. Todos los genes de interés se normalizaron con respecto al gen nuclear B2M. La expresión génica de STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC y OPA1 se midió mediante RT-qPCR. La mezcla maestra incluyó la polimerasa LUNA Taq (M3003L, New England Biolabs), cebadores directos e inversos de 10 μM, ADNc y agua de grado PCR para obtener un volumen final de 10 μL para cada reacción. La expresión de los genes de división y fisión (DRP1, MFN1/2) se midió utilizando ensayos multiplex TaqMan. La mezcla maestra Luna Universal Probe qPCR (M3004S, New England Biolabs) se utilizó según las instrucciones del fabricante con modificaciones menores. La mezcla maestra de RT-qPCR multiplex incluye 1X de polimerasa LUNA Taq, cebadores directos e inversos de 10 μM, sonda de 10 μM, ADNc y agua de grado PCR, lo que resulta en un volumen final de 20 μL para cada reacción. La RT-qPCR se realizó utilizando Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—número de serie: R0618110). Las condiciones de ciclado se muestran en la Tabla S1. Todas las muestras de ADNc se amplificaron por triplicado y se generó una curva estándar mediante una serie de diluciones de diez veces. Los valores atípicos en las muestras por triplicado con una desviación estándar del umbral de ciclo (Ct) >0,5 se eliminaron del análisis para garantizar la reproducibilidad de los datos30,72. La expresión génica relativa se calculó utilizando el método 2-ΔΔCt79.
Las muestras de proteína (60 μg) se mezclaron con tampón de carga de Laemmli en una proporción de 2:1 y se analizaron en un gel de proteína incoloro al 12 % (Bio-Rad #1610184). Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (fluoruro de polivinilideno) (#170-84156, Bio-Rad) utilizando el sistema Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). La membrana se bloqueó y se incubó con los anticuerpos primarios apropiados (OPA1, MFN1, MFN2 y DRP1) (diluidos 1:1000) durante 48 horas, seguido de una incubación con anticuerpos secundarios (1:10 000) durante 1 hora. Posteriormente, las membranas se visualizaron utilizando el sustrato Clarity Western ECL (#170-5061, Bio-Rad) y se registraron utilizando un sistema Bio-Rad ChemiDoc MP. Para el análisis de Western blot se utilizó ImageLab versión 6.1. El gel y la membrana originales se muestran en la Figura S1. La información sobre los anticuerpos se encuentra en la Tabla S2.
Los conjuntos de datos se presentan como la media y el error estándar de la media (SEM) de al menos tres muestras independientes. Se comprobó la normalidad de los conjuntos de datos mediante la prueba de Shapiro-Wilk (salvo que se indique lo contrario) antes de asumir una distribución gaussiana y desviaciones estándar iguales y proceder con los análisis. Además, se analizó el conjunto de datos mediante la prueba MEL LSD de Fisher (p < 0,05), ANOVA unidireccional (tratamiento vs. control) y la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett para determinar la significación (p < 0,05). Los valores p significativos se muestran en el gráfico como *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Todos los análisis estadísticos y gráficos se realizaron y generaron con GraphPad Prism 9.4.0.
Las macros de Fiji/ImageJ para el análisis de imágenes TEM están disponibles públicamente en GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. La macro Mitochondrial Event Locator (MEL) está disponible públicamente en GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
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