Presente *Dirección actual: Colonia 50931, Alemania, Clúster de Excelencia de Colonia para la Investigación sobre la Respuesta al Estrés Celular en Enfermedades Relacionadas con el Envejecimiento (CECAD).
La neurodegeneración de las enfermedades mitocondriales se considera irreversible debido a la limitada plasticidad metabólica de las neuronas, pero el efecto de la disfunción mitocondrial sobre la autonomía celular del metabolismo neuronal en el cuerpo es poco conocido. En este trabajo, presentamos el proteoma celular específico de las neuronas de Purkinje con deficiencia progresiva de fosforilación oxidativa (OXPHOS) causada por una dinámica de fusión mitocondrial alterada. Descubrimos que la disfunción mitocondrial desencadenó un cambio profundo en el campo de la proteómica, que finalmente condujo a la activación secuencial de programas metabólicos precisos antes de la muerte celular. Inesperadamente, determinamos la inducción obvia de la piruvato carboxilasa (PCx) y otras enzimas antienvejecimiento que complementan los intermediarios del ciclo del ácido tricarboxílico (ATC). La inhibición de la PCx exacerbó el estrés oxidativo y la neurodegeneración, lo que indica que la aterosclerosis tiene un efecto protector en las neuronas que carecen de fosforilación oxidativa (OXPHOS). La restauración de la fusión mitocondrial en neuronas con degeneración terminal revierte por completo estas características metabólicas, previniendo así la muerte celular. Nuestros hallazgos identifican vías previamente desconocidas que confieren resiliencia a la disfunción mitocondrial y muestran que la neurodegeneración puede revertirse incluso en las últimas etapas de la enfermedad.
El papel central de las mitocondrias en el mantenimiento del metabolismo energético neuronal se ve enfatizado por los extensos síntomas neurológicos asociados con las enfermedades mitocondriales humanas. La mayoría de estas enfermedades son causadas por mutaciones genéticas que regulan la expresión génica mitocondrial (1, 2) o la destrucción génica relacionada con la dinámica mitocondrial, lo que afecta indirectamente la estabilidad del ADN mitocondrial (ADNmt) (3, 4). Estudios en modelos animales han demostrado que, en respuesta a la disfunción mitocondrial en los tejidos circundantes, se pueden activar vías metabólicas conservadoras (5-7), lo que proporciona información importante para comprender en profundidad la patogénesis de estas enfermedades complejas. En marcado contraste, nuestra comprensión de los cambios metabólicos en tipos celulares específicos causados ​​por la falla general de la producción de trifosfato de adenosina (ATP) mitocondrial cerebral es fundamental (8), lo que enfatiza la necesidad de identificar dianas terapéuticas que puedan usarse para prevenir enfermedades o prevenir la neurodegeneración (9). La falta de información se debe a que se considera ampliamente que las células nerviosas tienen una flexibilidad metabólica muy limitada en comparación con los tipos celulares de los tejidos circundantes (10). Dado que estas células desempeñan un papel fundamental en la coordinación del suministro de metabolitos a las neuronas para promover la transmisión sináptica y responder a lesiones y enfermedades, la capacidad de adaptar el metabolismo celular a las condiciones adversas del tejido cerebral se limita prácticamente a las células gliales (11-14). Además, la heterogeneidad celular inherente al tejido cerebral dificulta en gran medida el estudio de los cambios metabólicos que ocurren en subgrupos neuronales específicos. En consecuencia, se conoce poco sobre las consecuencias celulares y metabólicas exactas de la disfunción mitocondrial en las neuronas.
Para comprender las consecuencias metabólicas de la disfunción mitocondrial, aislamos neuronas de Purkinje (PN) en diferentes etapas de neurodegeneración causada por la destrucción de la fusión de la membrana externa mitocondrial (Mfn2). Aunque las mutaciones de Mfn2 en humanos están asociadas con una forma de neuropatía sensitivo-motora hereditaria conocida como Charcot-Marie-Tooth tipo 2A (15), la destrucción condicional de Mfn2 en ratones es un método bien reconocido de inducción de la disfunción de la fosforilación oxidativa (OXPHOS). Los diversos subtipos neuronales (16-19) y el fenotipo neurodegenerativo resultante se acompañan de síntomas neurológicos progresivos, como trastornos del movimiento (18, 19) o ataxia cerebelosa (16). Mediante el uso de una combinación de proteómica cuantitativa sin etiqueta (LFQ), metabolómica, imágenes y métodos virológicos, demostramos que la neurodegeneración progresiva induce fuertemente la piruvato carboxilasa (PCx) y otros factores involucrados en la arteriosclerosis de las PN in vivo La expresión de enzimas. Para verificar la relevancia de este hallazgo, regulamos a la baja específicamente la expresión de PCx en las PN deficientes en Mfn2, y encontramos que esta operación agravó el estrés oxidativo y aceleró la neurodegeneración, probando así que la azoospermia confiere adaptabilidad metabólica a la muerte celular. La expresión severa de MFN2 puede rescatar por completo la PN de degeneración terminal con deficiencia severa de OXPHOS, consumo masivo de ADN mitocondrial y red mitocondrial aparentemente rota, lo que enfatiza aún más que esta forma de neurodegeneración puede incluso recuperarse en la etapa avanzada de la enfermedad antes de la muerte celular.
Para visualizar las mitocondrias en PNs knock out Mfn2, utilizamos una cepa de ratón que permite a las mitocondrias dependientes de Cre dirigirse a la proteína fluorescente amarilla (YFP) (mtYFP) (20) expresión de Cre y verificamos la morfología mitocondrial in vivo. Descubrimos que la destrucción del gen Mfn2 en PN conduciría a la división gradual de la red mitocondrial (Figura S1A), y el cambio más temprano se encontró a las 3 semanas de edad. Por el contrario, la degeneración sustancial de la capa celular de PN, como lo demuestra la pérdida de la inmunotinción de Calbindina, no comenzó hasta las 12 semanas de edad (Figura 1, A y B). El desajuste temporal entre los primeros cambios en la morfología mitocondrial y el inicio visible de la muerte neuronal nos impulsó a investigar los cambios metabólicos desencadenados por la disfunción mitocondrial antes de la muerte celular. Desarrollamos una estrategia basada en la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para aislar PN que expresan YFP (YFP+) (Figura 1C), y en ratones de control (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), en adelante denominados CTRL (Figura S1B). La optimización de la estrategia de activación basada en la intensidad relativa de la señal de YFP nos permite purificar el cuerpo YFP+ (YFPhigh) de las PN de las no PN (YFPneg) (Figura S1B) o supuestos fragmentos axónicos/dendríticos fluorescentes (YFPlow; Figura S1D, izquierda), confirmados por microscopio confocal (Figura S1D, derecha). Para verificar la identidad de la población clasificada, realizamos proteómica LFQ y luego análisis de componentes principales, y encontramos que hay una clara separación entre las células YFPhigh e YFPneg (Figura S1C). Las células YFPhigh mostraron un enriquecimiento neto de los marcadores de PN conocidos (es decir, Calb1, Pcp2, Grid2 e Itpr3) (21, 22), pero ningún enriquecimiento de las proteínas comúnmente expresadas en neuronas u otros tipos de células (Figura 1D). Una comparación entre muestras en células YFPhigh clasificadas recolectadas en experimentos independientes mostró un coeficiente de correlación > 0,9, lo que demuestra una buena reproducibilidad entre réplicas biológicas (Figura S1E). En resumen, estos datos validaron nuestro plan para el aislamiento agudo y específico de PN factible. Debido a que el sistema controlador L7-cre utilizado induce la recombinación en mosaico en la primera semana después del parto (23), comenzamos a sacrificar ratones de CTRL y recolectamos neuronas condicionales (Mfn2 loxP / loxP:: mtYFP loxP-stop-loxP:: L7-cre). Una vez completada la recombinación, se denomina Mfn2cKO a las 4 semanas de edad. Como punto final, elegimos 8 semanas de edad cuando la capa PN estaba intacta a pesar de la obvia fragmentación mitocondrial (Figura 1B y Figura S1A). En total, cuantificamos un total de 3013 proteínas, de las cuales alrededor del 22% se basaron en anotaciones de MitoCarta 2.0 basadas en el proteoma mitocondrial como mitocondrias (Figura 1E) (Figura 1E) (24). El análisis de expresión génica diferencial realizado en la semana 8 mostró que solo el 10,5% de todas las proteínas tuvieron cambios significativos (Figura 1F y Figura S1F), de las cuales 195 proteínas estaban reguladas a la baja y 120 proteínas estaban reguladas al alza (Figura 1F). Vale la pena señalar que el "análisis de vías innovadoras" de este conjunto de datos muestra que los genes expresados ​​diferencialmente pertenecen principalmente a un conjunto restringido de vías metabólicas específicas (Figura 1G). Curiosamente, aunque la regulación negativa de las vías relacionadas con la fosforilación oxidativa y la señalización del calcio confirma la inducción de la disfunción mitocondrial en las PN deficientes en fusión, otras categorías que involucran principalmente el metabolismo de los aminoácidos se regulan positivamente de manera significativa, lo que está en consonancia con el metabolismo que se produce en las PN mitocondriales. El recableado es consistente. disfunción.
(A) Fotografías confocales representativas de secciones cerebelosas de ratones CTRL y Mfn2cKO que muestran pérdida progresiva de PN (calbindina, gris); los núcleos se contratiñeron con DAPI. (B) Cuantificación de (A) (análisis de varianza unidireccional, ***P < 0,001; n = 4 a 6 círculos de tres ratones). (C) Flujo de trabajo experimental. (D) Distribución del mapa de calor de marcadores específicos de Purkinje (arriba) y otros tipos de células (centro). (E) Diagrama de Venn que muestra el número de proteínas mitocondriales identificadas en el PN clasificado. (F) Gráfico de volcán de proteínas expresadas diferencialmente en neuronas Mfn2cKO a las 8 semanas (valor de corte de significación de 1,3). (G) El análisis de la vía de la creatividad muestra las cinco vías de regulación positiva (roja) y negativa (azul) más importantes en el PN Mfn2cKO clasificado como de 8 semanas. Se muestra el nivel de expresión promedio de cada proteína detectada. Mapa de calor en escala de grises: valor P ajustado. ns, no importante.
Los datos proteómicos mostraron que la expresión proteica de los complejos I, III y IV disminuyó gradualmente. Los complejos I, III y IV contenían subunidades esenciales codificadas por el ADNmt, mientras que el complejo II, que solo tenía codificación nuclear, básicamente no se vio afectado (Figura 2A y Figura S2A). . En consonancia con los resultados proteómicos, la inmunohistoquímica de secciones de tejido cerebeloso mostró que el nivel de la subunidad MTCO1 (subunidad 1 de la citocromo C oxidasa mitocondrial) del complejo IV en PN disminuyó gradualmente (Figura 2B). La subunidad Mtatp8 codificada por el ADNmt se redujo significativamente (Figura S2A), mientras que el nivel en estado estacionario de la subunidad de la ATP sintasa codificada nuclear permaneció sin cambios, lo que es consistente con el complejo F1 del subconjunto de la ATP sintasa estable conocido cuando la expresión del ADNmt es estable. La formación es consistente. Interrumpir (7). La evaluación del nivel de ADNmt en las PN Mfn2cKO clasificadas mediante reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR) confirmó la disminución gradual del número de copias de ADNmt. En comparación con el grupo control, a las 8 semanas de edad, solo se retuvo alrededor del 20% del nivel de ADNmt (Figura 2C). En consonancia con estos resultados, se utilizó la tinción de microscopía confocal de las PN Mfn2cKO para detectar ADN, lo que mostró el consumo dependiente del tiempo de los nucleótidos mitocondriales (Figura 2D). Encontramos que solo algunos candidatos involucrados en la degradación de proteínas mitocondriales y la respuesta al estrés estaban regulados positivamente, incluidos Lonp1, Afg3l2 y Clpx, y los factores de ensamblaje del complejo OXPHOS. No se detectaron cambios significativos en los niveles de proteínas involucradas en la apoptosis (Figura S2B). De manera similar, encontramos que las mitocondrias y los canales del retículo endoplasmático involucrados en el transporte de calcio solo tienen cambios menores (Figura S2C). Además, la evaluación de las proteínas relacionadas con la autofagia no encontró cambios significativos, lo cual es consistente con la inducción visible de autofagosomas observada in vivo por inmunohistoquímica y microscopía electrónica (Figura S3). Sin embargo, la disfunción progresiva de OXPHOS en las PN está acompañada de cambios mitocondriales ultraestructurales obvios. Se pueden ver agrupaciones mitocondriales en los cuerpos celulares y árboles dendríticos de las PN Mfn2cKO de 5 y 8 semanas de edad, y la estructura de la membrana interna ha sufrido cambios profundos (Figura S4, A y B). En consonancia con estos cambios ultraestructurales y una disminución significativa en el ADNmt, el análisis de cortes cerebrales cerebelosos agudos con éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM) mostró que el potencial de membrana mitocondrial en las PN Mfn2cKO estaba significativamente disminuido (Figura S4C).
(A) Análisis de la evolución temporal del nivel de expresión del complejo OXPHOS. Solo considere las proteínas con P < 0,05 a las 8 semanas (ANOVA de dos vías). Línea punteada: Sin ajuste en comparación con CTRL. (B) Izquierda: Ejemplo de una sección cerebelosa marcada con anticuerpo anti-MTCO1 (barra de escala, 20 μm). El área ocupada por los cuerpos celulares de Purkinje está cubierta de amarillo. Derecha: Cuantificación de los niveles de MTCO1 (análisis de varianza unidireccional; n = 7 a 20 células analizadas de tres ratones). (C) Análisis qPCR del número de copias de ADNmt en el PN clasificado (análisis de varianza unidireccional; n = 3 a 7 ratones). (D) Izquierda: Ejemplo de un corte cerebeloso marcado con un anticuerpo anti-ADN (barra de escala, 20 μm). El área ocupada por los cuerpos celulares de Purkinje está cubierta de amarillo. Derecha: Cuantificación de lesiones de mtADN (análisis de varianza unidireccional; n = 5 a 9 células de tres ratones). (E) Un ejemplo de una sección cerebelosa aguda que muestra células mitoYFP + Purkinje (flecha) en un registro de fijación de parche de célula completa. (F) Cuantificación de la curva IV. (G) Registros representativos de inyección de corriente despolarizante en células de Purkinje CTRL y Mfn2cKO. Trazo superior: El primer pulso que desencadenó el PA. Trazo inferior: Frecuencia máxima del PA. (H) Cuantificación de entradas espontáneas postsinápticas (sPSP). El trazo de registro representativo y su relación de zoom se muestran en (I). El análisis de varianza unidireccional analizó n = 5 a 20 células de tres ratones. Los datos se expresan como media ± EEM; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001. (J) Trazos representativos de PA espontáneos registrados utilizando el modo de fijación de parche perforado. Trazo superior: Frecuencia máxima del PA. Trazo inferior: zoom de un solo PA. (K) Cuantifique la frecuencia promedio y máxima de PA según (J). Prueba de Mann-Whitney; se analizaron n = 5 células de cuatro ratones. Los datos se expresan como media ± EEM; no relevante.
Se detectó un daño evidente en la fosforilación oxidativa (OXPHOS) en la PN Mfn2cKO de 8 semanas de edad, lo que indica que la función fisiológica de las neuronas es gravemente anormal. Por lo tanto, analizamos las características eléctricas pasivas de las neuronas deficientes en OXPHOS a las 4-5 y 7-8 semanas mediante registros de fijación de parche de célula completa en cortes cerebelosos agudos (Figura 2E). Sorprendentemente, el potencial de membrana en reposo promedio y la resistencia de entrada de las neuronas Mfn2cKO fueron similares a los del control, aunque hubo diferencias sutiles entre las células (Tabla 1). De igual manera, a las 4-5 semanas de edad, no se encontraron cambios significativos en la relación corriente-voltaje (curva IV) (Figura 2F). Sin embargo, ninguna neurona Mfn2cKO de 7-8 semanas de edad sobrevivió al régimen IV (paso de hiperpolarización), lo que indica que existe una clara sensibilidad al potencial de hiperpolarización en esta etapa tardía. Por el contrario, en las neuronas Mfn2cKO, las corrientes despolarizantes que causan descargas repetitivas de potenciales de acción (PA) son bien toleradas, lo que indica que sus patrones generales de descarga no son significativamente diferentes de los de las neuronas de control de 8 semanas de edad (Tabla 1 y Figura 2G). De manera similar, la frecuencia y amplitud de las corrientes postsinápticas espontáneas (sPSC) fueron comparables a las del grupo de control, y la frecuencia de eventos aumentó de 4 semanas a 5 semanas a 7 semanas a 8 semanas con un incremento similar (Figura 2, H e I). El período de maduración sináptica en PN (25). Se obtuvieron resultados similares después de los parches de PN perforados. Esta configuración previene la posible compensación de los defectos celulares de ATP, como podría suceder en el registro de fijación de parche de célula completa. En particular, el potencial de membrana en reposo y la frecuencia de disparo espontáneo de las neuronas Mfn2cKO no se vieron afectados (Figura 2, J y K). En resumen, estos resultados indican que las PN con disfunción evidente de OXPHOS pueden afrontar bien los patrones de descarga de alta frecuencia, lo que indica que existe un mecanismo de compensación que les permite mantener respuestas electrofisiológicas casi normales.
Los datos se expresan como media ± EEM (análisis de varianza unidireccional, prueba de comparación múltiple de Holm-Sidak; *P < 0,05). El número de unidad se indica entre paréntesis.
Nos propusimos investigar si alguna categoría en el conjunto de datos de proteómica (Figura 1G) incluye vías que pueden contrarrestar la deficiencia grave de OXPHOS, explicando así por qué la PN afectada puede mantener una electrofisiología casi normal (Figura 2, E a K). El análisis proteómico mostró que las enzimas involucradas en el catabolismo de los aminoácidos de cadena ramificada (AACR) se regularon positivamente de manera significativa (Figura 3A y Figura S5A), y el producto final acetil-CoA (CoA) o succinil CoA puede complementar los tricarboxilatos en el ciclo del ácido arteriosclerótico (TCA). Encontramos que el contenido de BCAA transaminasa 1 (BCAT1) y BCAT2 aumentó. Catalizan el primer paso del catabolismo de BCAA al generar glutamato a partir de α-cetoglutarato (26). Todas las subunidades que componen el complejo de la cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada (BCKD) están sobreexpresadas (el complejo cataliza la descarboxilación posterior e irreversible del esqueleto carbonado de BCAA resultante) (Figura 3A y Figura S5A). Sin embargo, no se encontraron cambios evidentes en los propios BCAA en las PN clasificadas, lo que puede deberse a una mayor captación celular de estos aminoácidos esenciales o al uso de otras fuentes (glucosa o ácido láctico) para complementar el ciclo del TCA (Figura S5B). Las PN carentes de OXPHOS también mostraron un aumento de la descomposición de la glutamina y de las actividades de transaminación a las 8 semanas de edad, lo que puede reflejarse en la sobreexpresión de las enzimas mitocondriales glutaminasa (GLS) y glutamina piruvato transaminasa 2 (GPT2) (Figura 3, A y C). Vale la pena señalar que la regulación positiva de GLS se limita a la isoforma empalmada glutaminasa C (GLS-GAC) (el cambio de Mfn2cKO/CTRL es de aproximadamente 4,5 veces, P = 0,05), y su regulación positiva específica en los tejidos cancerosos puede respaldar la bioenergía mitocondrial. (27).
(A) El mapa de calor muestra el cambio en el nivel de proteína para la ruta especificada a las 8 semanas. (B) Ejemplo de un corte cerebeloso marcado con anticuerpo anti-PCx (barra de escala, 20 μm). La flecha amarilla apunta al cuerpo celular de Purkinje. (C) Análisis de la expresión de proteína en el curso temporal identificada como un candidato importante para la aterosclerosis (prueba t múltiple, *FDR <5%; n = 3-5 ratones). (D) Arriba: Un diagrama esquemático que muestra las diferentes formas de ingresar al carbono marcado contenido en el trazador [1-13C]piruvato (es decir, a través de PDH o ruta transarterial). Abajo: El gráfico de violín muestra el porcentaje de carbono marcado simple (M1) convertido en ácido aspártico, ácido cítrico y ácido málico después de marcar cortes cerebelosos agudos con [1-13C]piruvato (prueba t pareada; ** P <0,01). (E) Análisis exhaustivo del historial temporal de la ruta indicada. Considere solo las proteínas con P < 0,05 a las 8 semanas. Línea discontinua: sin valor de ajuste (análisis de varianza bidireccional; * P < 0,05; *** P < 0,001). Los datos se expresan como media ± EEM.
En nuestro análisis, el catabolismo de BCAA se ha convertido en una de las vías clave de regulación positiva. Este hecho sugiere firmemente que el volumen de ventilación que entra en el ciclo de los ATC puede estar modificado en las NP deficientes en OXPHOS. Esto puede representar una forma importante de reconexión metabólica neuronal, que puede tener un impacto directo en la fisiología neuronal y la supervivencia durante el mantenimiento de la disfunción grave de OXPHOS. En consonancia con esta hipótesis, encontramos que la principal enzima antiaterosclerótica PCx está regulada positivamente (Mfn2cKO/CTRL cambia aproximadamente 1,5 veces; Figura 3A), lo que cataliza la conversión de piruvato a oxaloacetato (28), que se cree que se encuentra en el tejido cerebral. La expresión en está restringida a los astrocitos (29, 30). En consonancia con los resultados de la proteómica, la microscopía confocal mostró que la expresión de PCx aumentó de forma específica y significativa en las NP deficientes en OXPHOS, mientras que la reactividad de PCx se restringió principalmente a las células gliales de Bergmann adyacentes del control (Figura 3B). Para evaluar funcionalmente la sobreexpresión observada de PCx, tratamos cortes cerebelosos agudos con el trazador [1-13C]piruvato. Cuando el piruvato fue oxidado por la piruvato deshidrogenasa (PDH), su isótopo desapareció, pero se incorpora a los intermediarios del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) cuando se metaboliza mediante reacciones vasculares (Figura 3D). En apoyo de nuestros datos proteómicos, observamos un gran número de marcadores de este trazador en el ácido aspártico de cortes con Mfn2cKO, mientras que el ácido cítrico y el ácido málico también mostraron una tendencia moderada, aunque no significativa (Figura 3D).
En las neuronas dopaminérgicas de ratones MitoPark con disfunción mitocondrial causada por neuronas dopaminérgicas que destruyen específicamente el gen del factor de transcripción mitocondrial A (Tfam) (Figura S6B), la expresión de PCx también aumentó significativamente (31), lo que indica que la arteriosclerosis ácida de acetona La aparición de la enfermedad se regula durante la disfunción de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) neuronal en el cuerpo. Vale la pena señalar que se ha encontrado que enzimas únicas (32-34) que pueden expresarse en neuronas que pueden estar asociadas con la arteriosclerosis se regulan significativamente en las PN que carecen de OXPHOS, como la propionil-CoA carboxilasa (PCC-A), la malonil-CoA convierte la propionil-CoA en succinil-CoA y la enzima málica mitocondrial 3 (ME3), cuyo papel principal es recuperar el piruvato del malato (Figura 3, A y C) (33, 35). Además, se observó un aumento significativo de la enzima Pdk3, que fosforila y, por lo tanto, inactiva la PDH (36), mientras que no se detectaron cambios en la enzima Pdp1, que activa la PDH, ni en el propio complejo enzimático PDH (Figura 3A). De forma consistente, en las PN Mern2cKO, se incrementó la fosforilación de la subunidad α1 (PDHE1α) del componente E1 de la piruvato deshidrogenasa del complejo PDH en Ser293 (que se sabe que inhibe la actividad enzimática de la PDH) (Figura S6C). El piruvato no tiene acceso vascular.
Finalmente, encontramos que la supervía de la biosíntesis de serina y glicina, el ciclo mitocondrial relacionado del folato (1C) y la biosíntesis de prolina (Figura 1G y Figura S5C) están significativamente sobreexpresadas, según informes, durante el proceso de activación. Los tejidos circundantes se activan con la disfunción mitocondrial (5-7). El análisis confocal que respalda estos datos proteómicos mostró que en PN con OXPHOS faltante, cortes cerebelosos de ratones de 8 semanas de edad se sometieron a serina hidroximetiltransferasa 2 (SHMT2), una enzima clave del ciclo mitocondrial del folato. Respuesta inmune significativa (Figura S5D). En 13 cortes cerebelosos agudos incubados con CU-glucosa, los experimentos de rastreo metabólico confirmaron además la sobreexpresión de la biosíntesis de serina y prolina, lo que indica que el flujo de isoformas de carbono en serina y prolina aumentó (Figura S5E). Dado que las reacciones promovidas por GLS y GPT2 son responsables de la síntesis de glutamato a partir de glutamina y la transaminación entre glutamato y α-cetoglutarato, su regulación positiva indica que las neuronas deficientes en OXPHOS tienen una mayor demanda de glutamato. Esto puede estar dirigido a mantener la mayor biosíntesis de prolina (Figura S5C). En contraste con estos cambios, un análisis proteómico de astrocitos cerebelosos de ratones Mfn2cKO específicos de PN mostró que estas vías (incluyendo todas las antiperoxidasas) no cambiaron significativamente en la expresión, lo que demuestra que esta redirección metabólica es selectiva para PN degradado (Fig. S6, D a G).
En resumen, estos análisis revelaron patrones significativamente diferentes de activación temporal de vías metabólicas específicas en PN. Si bien la función mitocondrial neuronal anormal puede conducir a aterosclerosis temprana y remodelación de 1C (Figura 3E y Figura S5C), e incluso cambios predecibles en la expresión de los complejos I y IV, los cambios en la síntesis de novo de serina solo se hicieron evidentes en las etapas tardías. Disfunción de OXPHOS (Figura 3E y Figura S5C). Estos hallazgos definen un proceso secuencial en el que la respuesta mitocondrial (ciclo de 1C) y citoplasmática (biosíntesis de serina) inducida por estrés se sinérgicamente con el aumento de la aterosclerosis en el ciclo del TCA para remodelar el metabolismo neuronal.
Las PN deficientes en OXPHOS de 8 semanas de edad pueden mantener una actividad de excitación de alta frecuencia y experimentar una reconexión metabólica significativa para compensar la disfunción mitocondrial. Este descubrimiento plantea una posibilidad interesante de que incluso en este momento, estas células también puedan recibir intervención terapéutica para retrasar o prevenir la neurodegeneración. Tardía. Resolvimos esta posibilidad a través de dos intervenciones independientes. En el primer método, diseñamos un vector de virus adenoasociado (AAV) dependiente de Cre para que MFN2 pueda expresarse selectivamente en PN deficientes en OXPHOS in vivo (Figura S7A). El AAV que codifica MFN2 y el gen reportero fluorescente mCherry (Mfn2-AAV) se verificaron en cultivos neuronales primarios in vitro, lo que provocó que MFN2 se expresara de manera dependiente de Cre y rescató la morfología mitocondrial, previniendo así la neuromutación en neuronas Mfn2cKO (Figura S7, B, D y E). A continuación, realizamos experimentos in vivo para administrar estereotácticamente Mfn2-AAV de 8 semanas de edad a la corteza cerebelosa de ratones Mfn2cKO y de control, y analizamos ratones de 12 semanas de edad (Figura 4A). Los ratones Mfn2cKO tratados murieron (Figura 1, A y B) (16). La transducción viral in vivo resultó en la expresión selectiva de PN en algunos círculos cerebelosos (Figura S7, G y H). La inyección del AAV de control que expresa solo mCherry (Ctrl-AAV) no tuvo un efecto significativo en el grado de neurodegeneración en animales Mfn2cKO. Por el contrario, el análisis de Mfn2cKO transducidos con Mfn2-AAV mostró un efecto protector significativo de la capa celular de PN (Figura 4, B y C). En particular, la densidad neuronal parece ser casi indistinguible de la de los animales de control (Figura 4, B y C, y Figura S7, H e I). La expresión de MFN1 pero no de MFN2 es igualmente eficaz para salvar la muerte neuronal (Figura 4C y Figura S7, C y F), lo que indica que la expresión de MFN1 ectópico puede complementar eficazmente la falta de MFN2. Un análisis posterior a nivel de PN único mostró que Mfn2-AAV rescató en gran medida la ultraestructura de las mitocondrias, normalizó los niveles de mtDNA y revirtió la alta expresión del marcador antiangiogénesis PCx ​​(Figura 4, C a E). La inspección visual de los ratones Mfn2cKO rescatados en un estado de reposo mostró que su postura y síntomas motores (movimiento S1 a S3) mejoraron. En conclusión, estos experimentos muestran que la reintroducción retardada de MFN2 en PN severamente deficientes en OXPHOS es suficiente para revertir el consumo de mtDNA e inducir aterosclerosis, previniendo así la degeneración axonal y la muerte neuronal in vivo.
(A) Esquema que muestra el programa experimental para inyectar AAV que codifica MFN2 cuando se activa la vía metabólica indicada. (B) Imágenes confocales representativas de cortes cerebelosos de 12 semanas de edad transducidos a las 8 semanas en ratones Mfn2cKO y marcados con anticuerpo anti-calbindina. Derecha: Escala de fibras axónicas. La escala del zoom axónico es de 450 y 75 μm. (C) Izquierda: Cuantificación de la densidad de células de Purkinje en el bucle de transducción de AAV (AAV+) (análisis de varianza unidireccional; n = 3 ratones). Derecha: Análisis del foco de ADNmt en PN transducido en la semana 12 (prueba t no pareada; n = 6 células de tres ratones). * P < 0,05; ** P < 0,01. (D) Micrografías electrónicas de transmisión representativas de PN de secciones cerebelosas Mfn2cKO transducidas con los vectores virales indicados. La máscara rosa ilustra el área ocupada por las dendritas, y el cuadrado punteado amarillo ilustra el zoom proporcionado a la derecha; n representa el núcleo. Barra de escala, 1 μm. (E) muestra un ejemplo de tinción de PCx en PN transducida a las 12 semanas. Barra de escala, 20 μm. OE: sobreexpresión; FC: cambio de factor.
Finalmente, investigamos la importancia de la supervivencia celular inducida por peroxidasa en PNs que han experimentado disfunción de OXPHOS. Generamos mCherry que codifica AAV-shRNA (ARN de horquilla corta) dirigido específicamente al ARNm de PCx de ratón (AAV-shPCx), e inyectamos el virus o su control codificado (AAV-scr) en el cerebelo de ratones Mfn2cKO. La inyección se realizó en la cuarta semana de edad (Figura 5A) para lograr una inhibición efectiva de PCx durante el período en que la expresión de PCx aumentó (Figura 3C) y la capa celular de PN aún estaba intacta (Figura 1A). Cabe destacar que la inhibición de PCx (Figura S8A) conduce a una aceleración significativa de la muerte de PN, que se limita al anillo infectado (Figura 5, B y C). Para comprender el mecanismo de los efectos metabólicos inducidos por la sobreexpresión de PCx, estudiamos el estado redox de las PN tras la inhibición de PCx y la expresión simultánea del biosensor óptico mediado por AAV Grx1-roGFP2 (Figuras S8, B a D) para evaluar el cambio relativo del potencial redox del péptido glutatión (38). A continuación, realizamos una microscopía de imágenes de tiempo de vida de fluorescencia de dos fotones (FLIM) en cortes cerebrales agudos de Mfn2cKO de 7 semanas de edad o de camadas de control para detectar posibles cambios en el estado redox citoplasmático tras verificar las condiciones de FLIM (Figuras S8, E a G). El análisis mostró un aumento significativo del estado de oxidación de una única PN Mfn2cKO que carecía de expresión de PCx, lo que es diferente de las neuronas de control o las PN Mfn2cKO que expresaban solo shRNA desordenado (Figuras 5, D y E). Cuando se reguló negativamente la expresión de PCx, el porcentaje de PN Mfn2cKO que mostraban un estado altamente oxidado aumentó más de tres veces (Figura 5E), lo que indica que la regulación positiva de PCx mantuvo la capacidad redox de las neuronas degeneradas.
(A) Esquema que muestra el programa experimental para inyectar AAV que codifica shPCx cuando se activa la vía metabólica indicada. (B) Fotografías confocales representativas de secciones cerebelosas de 8 semanas de edad en ratones Mfn2cKO transducidos y marcados con anticuerpo anticalcineurina a las 4 semanas. Barra de escala, 450 μm. (C) Cuantificación de la densidad de células de Purkinje en bucles transducidos con AAV (análisis de varianza unidireccional; n = 3 a 4 ratones). Los datos se expresan como media ± SEM; ***P < 0,001. (D) La imagen FLIM representativa muestra la esperanza de vida promedio de PN de 7 semanas de edad que expresa el sensor redox de glutatión Grx1-roGFP2 en las condiciones experimentales especificadas. Relación LUT (tabla de búsqueda): intervalo de tiempo de supervivencia (en picosegundos). Barra de escala, 25 μm. (E) El histograma muestra la distribución de los valores de vida de Grx1-roGFP2 de (D) (n = 158 a 368 células en dos ratones en cada condición). El gráfico circular sobre cada histograma muestra el número de células con valores de vida significativamente más largos (rojo, oxidados) o más cortos (azul, reducidos), que superan 1 DE del valor promedio de vida en CTRL-AAV-scr. (F) El modelo propuesto muestra el efecto protector de la sobreexpresión de PCx neuronal.
En resumen, los datos que presentamos aquí muestran que la reexpresión de MFN2 puede rescatar por completo la neuropatía periférica avanzada con deficiencia grave de fosforilación oxidativa (OXPHOS), depleción grave de ADNmt y morfología extremadamente anormal similar a la de ista, lo que permite un progreso continuo incluso en enfermedades avanzadas. La neurodegeneración proporciona evidencia reversible de la etapa previa a la muerte celular. Este grado de flexibilidad metabólica se ve reforzado por la capacidad de las neuronas para inducir aterosclerosis (una reconfiguración del ciclo del ácido tricarboxílico), que inhibe la expresión de PCx en neuropatías periféricas con deficiencia de fosforilación oxidativa (OXPHOS) y potencia la muerte celular, desempeñando así un papel protector (Figura 5F).
En este estudio, proporcionamos evidencia de que la respuesta de las PN a la disfunción de OXPHOS es converger gradualmente a la aterosclerosis del ciclo TCA a través de la vía de activación diferencial activada por programas metabólicos. Confirmamos el análisis proteómico con muchos métodos complementarios y revelamos que cuando se enfrentan a una disfunción mitocondrial grave, las neuronas tienen una forma previamente desconocida de elasticidad metabólica. Para nuestra sorpresa, todo el proceso de recableado no marca necesariamente el estado metabólico terminal que acompaña a la neurodegeneración de manera gradual e irreversible, pero nuestros datos sugieren que puede constituir una neurona de mantenimiento incluso en la etapa anterior a la muerte celular Mecanismo de compensación funcional. Este hallazgo indica que las neuronas tienen un grado considerable de plasticidad metabólica en el cuerpo. Este hecho prueba que la reintroducción posterior de MFN2 puede revertir la expresión de marcadores metabólicos clave y prevenir la degeneración de las PN. Por el contrario, inhibe la aterosclerosis y acelera los nervios. transexual.
Uno de los hallazgos más fascinantes de nuestra investigación es que las PN que carecen de OXPHOS pueden modificar el metabolismo del ciclo del TCA al regular positivamente las enzimas que estimulan específicamente la arteriosclerosis. El reordenamiento metabólico es una característica común de las células cancerosas, algunas de las cuales dependen de la glutamina para complementar los intermediarios del ciclo del TCA para producir equivalentes reductores, que impulsan la cadena respiratoria y mantienen la producción de precursores de la biosíntesis de lípidos y nucleótidos (39, 40). Un estudio reciente mostró que en los tejidos periféricos que experimentan disfunción de OXPHOS, la reconexión del metabolismo de glutamina/glutamato también es una característica destacada (5, 41), donde la dirección de la entrada de la glutamina en el ciclo del TCA depende de Debido a la gravedad de la lesión de OXPHOS (41). ). Sin embargo, hay una falta de evidencia clara sobre cualquier similitud de la plasticidad metabólica neuronal en el cuerpo y su posible relevancia en el contexto de la enfermedad. En un estudio in vitro reciente, se demostró que las neuronas corticales primarias movilizan reservas de glutamato para la neurotransmisión, promoviendo así el metabolismo oxidativo y la aterosclerosis en condiciones de estrés metabólico (42). Cabe destacar que, bajo la inhibición farmacológica de la enzima succinato deshidrogenasa del ciclo del TCA, se cree que la carboxilación del piruvato mantiene la síntesis de oxaloacetato en neuronas granulares cerebelosas cultivadas (34). Sin embargo, la relevancia fisiológica de estos mecanismos para el tejido cerebral (donde se cree que la aterosclerosis se limita principalmente a los astrocitos) aún tiene un significado fisiológico importante (43). En este caso, nuestros datos muestran que las PN dañadas por la fosforilación oxidativa (OXPHOS) en el cuerpo pueden cambiarse a la degradación de BCAA y la carboxilación del piruvato, que son las dos principales fuentes de suplementación de intermediarios de las reservas de TCA. Aunque se ha propuesto la supuesta contribución del catabolismo de BCAA al metabolismo energético neuronal, además del papel del glutamato y GABA para la neurotransmisión (44), aún no hay evidencia de estos mecanismos in vivo. Por lo tanto, es fácil especular que las PN disfuncionales pueden compensar automáticamente el consumo de intermediarios de TCA impulsado por el proceso de asimilación al aumentar la aterosclerosis. En particular, la regulación positiva de PCx puede ser necesaria para mantener una mayor demanda de ácido aspártico, lo que se sugiere en células proliferantes con disfunción mitocondrial (45). Sin embargo, nuestro análisis metabolómico no reveló ningún cambio significativo en el nivel de estado estacionario de ácido aspártico en las PN Mfn2cKO (Figura S6A), lo que presumiblemente refleja la diferente utilización metabólica del ácido aspártico entre las células proliferantes y las neuronas postmitóticas. Aunque el mecanismo exacto de la sobreexpresión de PCx en neuronas disfuncionales in vivo aún no se ha caracterizado, demostramos que esta respuesta prematura desempeña un papel importante en el mantenimiento del estado redox de las neuronas, lo cual se demostró en experimentos FLIM en cortes cerebelosos. En particular, impedir que las PN sobreexpriman PCx puede conducir a un estado más oxidado y acelerar la muerte celular. La activación de la degradación de BCAA y la carboxilación del piruvato no son formas de caracterizar los tejidos periféricos de disfunción mitocondrial (7). Por lo tanto, parecen ser una característica prioritaria de las neuronas deficientes en fosforilación oxidativa (OXPHOS), aunque no la única característica, lo cual es importante para la neurodegeneración.
La enfermedad cerebelosa es un tipo heterogéneo de enfermedad neurodegenerativa que generalmente se manifiesta como ataxia y a menudo daña las neuronas cerebelosas (46). Esta población neuronal es particularmente vulnerable a la disfunción mitocondrial porque su degeneración selectiva en ratones es suficiente para reproducir muchos de los síntomas motores que caracterizan la ataxia espinocerebelosa humana (16, 47, 48). Según informes, un modelo de ratón transgénico con un gen mutante está asociado con la ataxia espinocerebelosa humana y presenta disfunción mitocondrial (49, 50), lo que enfatiza la importancia de estudiar las consecuencias de la deficiencia de OXPHOS en la HPPN. Por lo tanto, es particularmente adecuado aislar y estudiar eficazmente esta población neuronal única. Sin embargo, dado que las neuronas cerebelosas son muy sensibles a la presión y representan una baja proporción de toda la población celular cerebelosa, para muchos estudios basados ​​en ómicas, la separación selectiva de ellas como células completas sigue siendo un aspecto desafiante. Aunque es casi imposible lograr una falta absoluta de contaminación de otros tipos de células (especialmente tejidos adultos), combinamos un paso de disociación eficaz con FACS para obtener un número suficiente de neuronas viables para el análisis proteómico posterior y tenemos una cobertura de proteínas bastante alta (alrededor de 3000 proteínas) en comparación con el conjunto de datos existente de todo el cerebelo (51). Al preservar la viabilidad de las células completas, el método que proporcionamos aquí nos permite no solo verificar los cambios en las vías metabólicas en las mitocondrias, sino también verificar los cambios en sus contrapartes citoplasmáticas, lo que complementa el uso de etiquetas de membrana mitocondrial para enriquecer el tipo de célula El nuevo método para el número de mitocondrias en tejidos complejos (52, 53). El método que describimos no solo está relacionado con el estudio de las células de Purkinje, sino que se puede aplicar fácilmente a cualquier tipo de célula para abordar los cambios metabólicos en los cerebros enfermos, incluidos otros modelos de disfunción mitocondrial.
Finalmente, hemos identificado una ventana terapéutica durante este proceso de reorganización metabólica que puede revertir por completo los signos clave del estrés celular y prevenir la degeneración neuronal. Por lo tanto, comprender las implicaciones funcionales de la reorganización descrita aquí puede proporcionar información fundamental sobre posibles tratamientos para mantener la viabilidad neuronal durante la disfunción mitocondrial. Se requieren futuras investigaciones dirigidas a analizar los cambios en el metabolismo energético en otros tipos de células cerebrales para revelar plenamente la aplicabilidad de este principio a otras enfermedades neurológicas.
Los ratones MitoPark se han descrito previamente (31). Los ratones C57BL/6N con genes Mfn2 flanqueantes de loxP se han descrito previamente (18) y se cruzaron con ratones L7-Cre (23). La progenie doble heterocigota resultante se cruzó entonces con ratones homocigotos Mfn2loxP/Mfn2loxP para generar knockouts génicos específicos de Purkinje para Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). En un subconjunto de apareamiento, el alelo Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) se introdujo mediante cruces adicionales (20). Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices europeas, nacionales e institucionales y fueron aprobados por LandesamtfürNatur de Umwelt y Verbraucherschutz, Renania del Norte-Westfalia, Alemania. El trabajo con animales también sigue la guía de la Federación Europea de Asociaciones de Ciencias de Animales de Laboratorio.
Tras anestesiar la dislocación cervical de la gestante, se aisló el embrión de ratón (E13). La corteza se diseccionó en solución salina balanceada de Hanks (HBSS) suplementada con 10 mM de Hepes y se pasó por medio de Eagle modificado por Dulbecco que contenía papaína (20 U/ml) y cisteína (1 μg/ml). El tejido se incubó en DMEM) y se disoció mediante digestión enzimática. Ml) a 37 °C durante 20 minutos, y luego se molió mecánicamente en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10 %. Las células se sembraron en cubreobjetos de vidrio recubiertos con polilisina a una densidad de 2 × 106 por placa de cultivo de 6 cm o a una densidad de 0,5 × 105 células/cm2 para el análisis de imágenes. Después de 4 horas, el medio se sustituyó por medio Neurobasal sin suero que contenía suplemento B27 al 1 % y GlutaMax 0,5 mM. Las neuronas se mantuvieron a 37 °C y 5 % de CO₂ durante todo el experimento, y se alimentaron una vez por semana. Para inducir la recombinación in vitro, se utilizaron 3 μl (placa de cultivo de 24 pocillos) o 0,5 μl (placa de 24 pocillos) del siguiente vector viral AAV9 para tratar las neuronas el segundo día in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, número de catálogo 105530-AAV9) y AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, número de catálogo 105545-AAV9).
El ADN complementario de ratón Mfn1 y Mfn2 (obtenido de los plásmidos Addgene n.° 23212 y n.° 23213, respectivamente) está marcado con la secuencia V5 (GKPIPNPLLGLDST) en el extremo C-terminal y se fusiona con mCherry en marco a través de la secuencia T2A. Grx1-roGFP2 es un obsequio de Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Mediante la sustitución del casete tdTomato mediante métodos de clonación convencionales, este se subclonó en la estructura pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (número de referencia Addgene 28306) para generar los vectores pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 y pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Se utilizó una estrategia similar para generar el vector de control pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Para generar la construcción AAV-shPCx, se requiere un vector AAV plasmídico (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), que contiene la secuencia de ADN que codifica el shRNA dirigido a PCx de ratón (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Bajo el control del promotor U6, mCherry se utiliza bajo el control del promotor CMV. La producción de vectores AAV auxiliares se realizó según las instrucciones del fabricante (Cell Biolabs). En resumen, utilice un plásmido de transferencia que transporta mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) transitoriamente Transfección de células 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) o Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) gen codificante, así como proteína de la cápside AAV1 codificante y plásmido de empaquetamiento de proteína accesoria, utilizando el método de fosfato de calcio. El sobrenadante del virus crudo se obtuvo mediante ciclos de congelación-descongelación en un baño de hielo seco/etanol y células lisadas en solución salina tamponada con fosfato (PBS). El vector AAV se purificó mediante ultracentrifugación discontinua en gradiente de iodixanol (24 horas a 32 000 rpm y 4 °C) y se concentró utilizando un filtro centrífugo Amicon ultra-15. El título genómico de AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9 × 10 13 copias de genoma (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 10 12 GC/ml) y AAV1-CAG-FLEX se midió, como se describió previamente (54), mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) para MFN1-V5 (1,9 × 10 13 GC/ml) y AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 10 12 GC/ml).
Las neuronas primarias se rasparon en PBS 1x helado, se sedimentaron y luego se homogeneizaron en un tampón de lisis Triton X-100 al 0,5 % / desoxicolato de sodio al 0,5 %/PBS que contenía fosfatasa e inhibidor de proteasa (Roche). La cuantificación de proteínas se realizó utilizando el ensayo de ácido bicinconínico (Thermo Fisher Scientific). Luego, las proteínas se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y luego se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (GE Healthcare). Bloquee los sitios no específicos e incube con el anticuerpo primario (consulte la Tabla S1 para obtener más información) en leche al 5 % en TBST (solución salina tamponada con Tris y Tween), pasos de lavado y anticuerpo secundario en TBST Incubar. Incubar con el anticuerpo primario durante la noche a +4 °C. Después del lavado, aplicar el anticuerpo secundario durante 2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, incubando la misma transferencia con un anticuerpo anti-β-actina, se confirmó la misma carga. Detección mediante conversión a quimioluminiscencia y mejora de la quimioluminiscencia (GE Healthcare).
Las neuronas, previamente sembradas en cubreobjetos de vidrio, se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 4 %/PBS a la hora especificada, a temperatura ambiente, durante 10 minutos. Los cubreobjetos se impregnaron primero con Triton X-100 al 0,1 %/PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, en tampón de bloqueo [albúmina de suero bovino (BSA) al 3 %/PBS]. Al segundo día, los cubreobjetos se lavaron con tampón de bloqueo y se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo adecuado durante 2 horas a temperatura ambiente. Finalmente, las muestras se lavaron a fondo en PBS con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), se contratiñeron y, a continuación, se fijaron en el portaobjetos con Aqua-Poly/Mount.
Se anestesiaron ratones (machos y hembras) mediante inyección intraperitoneal de ketamina (130 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) y se les administró por vía subcutánea el analgésico carprofeno (5 mg/kg). Se colocaron en un instrumento estereotáctico (Kopf) equipado con una almohadilla térmica. Se expuso el cráneo y se utilizó un taladro dental para adelgazar la parte de la corteza cerebelosa correspondiente al hueso mis (de lambda: cola 1.8, lateral 1, correspondiente a los lóbulos IV y V). Se utilizó una aguja de jeringa curva para crear con cuidado un pequeño orificio en el cráneo para evitar interrumpir la vasculatura subyacente. A continuación, se inserta lentamente el capilar de vidrio delgado en el microorificio (de -1,3 a -1 en la cara ventral de la duramadre) y se inyectan de 200 a 300 nl de AAV en el microinyector (Narishige) con jeringas manuales (Narishige) varias veces a baja presión durante un período de 10 a 20 minutos. Tras la infusión, se deja el capilar durante otros 10 minutos para permitir que el virus se propague por completo. Tras retirar los capilares, se sutura cuidadosamente la piel para minimizar la inflamación de la herida y permitir la recuperación del animal. Los animales fueron tratados con analgésicos (caspofeno) durante varios días después de la operación, durante los cuales se monitoreó cuidadosamente su estado físico y se les practicó la eutanasia en el momento indicado. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices europeas, nacionales e institucionales y fueron aprobados por LandesamtfürNatur de Umwelt y Verbraucherschutz, Renania del Norte-Westfalia, Alemania.
Los animales fueron anestesiados con ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg), y el corazón fue perfundido primero con 0,1 M PBS, y luego con 4% PFA en PBS. El tejido fue disecado y fijado en 4% PFA/PBS durante la noche a 4°C. Se utilizó un bisturí vibratorio (Leica Microsystems GmbH, Viena, Austria) para preparar cortes sagitales (50 μm de espesor) del cerebro fijado en PBS. A menos que se especifique lo contrario, la tinción de los cortes libres se realizó como se describió anteriormente (13) a temperatura ambiente y agitando. En resumen, primero, los cortes obtenidos fueron permeabilizados con 0,5% Triton X-100/PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente; para algunos epítopos (Pcx y Shmt2), por en tampón tris-EDTA a 80°C (PH 9) calentar los cortes durante 25 minutos en lugar de este paso. A continuación, las secciones se incubaron con el anticuerpo primario (véase la Tabla S1) en tampón de bloqueo (BSA al 3 %/PBS) a 4 °C durante la noche con agitación. Al día siguiente, las secciones se lavaron con tampón de bloqueo y se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo adecuado durante 2 horas a temperatura ambiente. Finalmente, las secciones se lavaron a fondo con PBS, se contratiñeron con DAPI y se fijaron con AquaPolymount en un portaobjetos.
Se utilizó un microscopio confocal de barrido láser (TCS SP8-X o TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) equipado con un láser de luz blanca y un láser ultravioleta de diodo 405 para obtener imágenes de la muestra. Mediante la excitación del fluoróforo y la captura de la señal con el detector híbrido (HyDs), se utilizó el software LAS-X para obtener imágenes apiladas según el muestreo de Nyquist en modo secuencial. Para paneles no cuantitativos, se utilizan señales altamente dinámicas (por ejemplo, en células somáticas y dendritas [mtYFP]). Se utiliza el HyD para detectar el número de PN en modo BrightR. Se aplica una puerta de 0,3 a 6 ns para reducir el fondo.
Imágenes en tiempo real de células clasificadas. Tras la clasificación en medio Neurobasal-A con 1 % de suplemento B27 y 0,5 mM de GlutaMax, las células se sembraron inmediatamente en portaobjetos de vidrio recubiertos con poli-L-lisina (μ-Slide8 Well, Ibidi, número de catálogo 80826). Posteriormente, se mantuvieron a 37 °C y 5 % de CO₂ durante 1 hora para permitir la sedimentación celular. Las imágenes en tiempo real se obtuvieron en un microscopio confocal de barrido láser Leica SP8 equipado con un láser blanco, HyD, un objetivo de aceite de 63× [1,4 de apertura numérica (AN)] y una platina de calentamiento.
El ratón fue rápidamente anestesiado con dióxido de carbono y decapitado, el cerebro fue rápidamente retirado del cráneo y cortado en una sección sagital de 200 μm de espesor (para el experimento de marcado con 13C) o 275 μm de espesor (para experimentos con dos fotones) llena de los siguientes materiales El helado (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemania) está lleno de las siguientes sustancias: 125 mM de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) bajo en Ca2 + helado y saturado de carbono (95% de O2 y 5% de CO2) NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de tampón de fosfato de sodio, 25 mM de NaHCO3, 25 mM de glucosa, 0,5 mM de CaCl2 y 3,5 mM de MgCl2 (presión osmótica de 310 a 330 mmol). Transfiera los cortes de cerebro obtenidos a una cámara de preincubación que contenga un medio con una concentración superior de Ca2+ ACSF (125,0 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de tampón de fosfato de sodio, 25,0 mM de NaHCO3, 25,0 mM de d-glucosa, 1,0 mM de CaCl2 y 2,0 mM de MgCl2) pH 7,4 y 310 a 320 mmol).
Durante el proceso de obtención de imágenes, los cortes se trasladaron a una sala específica para ello, y el experimento se realizó bajo perfusión continua de ACSF a una temperatura constante de 32 a 33 °C. Para la obtención de imágenes de los cortes se utilizó un microscopio láser de barrido multifotón (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) equipado con un objetivo Leica de 25x (NA 0,95, agua) y un láser de Ti:zafiro (Chameleon Vision II, Coherent). El módulo FLIM (PicoHarp300, PicoQuant) fue el módulo.
FLIM de Grx1-roGFP2. Los cambios en el estado redox citoplasmático de las NP se midieron mediante FLIM de dos fotones en cortes sagitales de cerebro, donde el biosensor Grx1-roGFP2 se dirigió a las NP. En la capa de NP, el campo de adquisición se selecciona entre 50 y 80 μm por debajo de la superficie del corte para garantizar la viabilidad de la NP (es decir, la ausencia de estructura en forma de perla o cambios morfológicos neuronales a lo largo de las dendritas) y el sensor roGFP2 doblemente positivo y el ARNhc PCx que codifica AAV o su secuencia de control (ambos coexpresan mCherry). Obtenga imágenes de una sola pila con zoom digital 2x [longitud de onda de excitación: 890 nm; 512 nm 512 píxeles]. Detección: Se utiliza HyD interno, grupo de filtros de isotiocianato de fluoresceína (FITC) y promediado de imágenes en un periodo de 2 a 3 minutos para garantizar la captura de suficientes fotones (1000 en total) para el ajuste de la curva. La sensibilidad de la sonda Grx1-roGFP2 y la verificación de las condiciones FLIM se realizaron mediante la monitorización del valor de vida útil de roGFP2 al añadir 10 mM de H₂O₂ exógeno al ACSF de perfusión (para maximizar la oxidación, lo que resulta en un aumento de la vida útil) y, posteriormente, añadir 2 mM de ditiotreitol (que minimiza el grado de reducción, lo que resulta en una disminución de la vida útil) (Figura S8, D a G). Utilice el software FLIMfit 5.1.1 para analizar los resultados adquiridos, ajuste la curva de decaimiento exponencial única de toda la imagen a la IRF medida (función de respuesta del instrumento), y χ2 es aproximadamente 1. Para calcular la vida útil de una sola PN, se dibujó manualmente la máscara alrededor del cuerpo del nervio y se utilizó la vida útil promedio en cada máscara para la cuantificación.
Análisis del potencial mitocondrial. Tras incubar la sección aguda con 100 nM de TMRM añadido directamente al ACSF perfundido durante 30 minutos, se midieron los cambios en el potencial mitocondrial de las PN mediante un microscopio de dos fotones. La obtención de imágenes de TMRM se realizó excitando la sonda a 920 nm y utilizando HyD interno (isotiocianato de tetrametilrodamina: 585/40 nm) para recopilar las señales; utilizando la misma longitud de onda de excitación, pero con un HyD interno diferente (FITC: 525/50), para obtener imágenes de mtYFP. Utilice el complemento Image Calculator de ImageJ para evaluar el potencial mitocondrial a nivel de célula individual. En resumen, la ecuación del complemento: señal = min (mtYFP, TMRM) se utiliza para identificar la región mitocondrial que muestra la señal de TMRM en el somalí de Purkinje en la imagen confocal de pila única del canal correspondiente. Luego, se cuantifica el área de píxeles en la máscara resultante y luego se normaliza en la imagen de pila única de umbral correspondiente del canal mtYFP para obtener la fracción mitocondrial que muestra el potencial mitocondrial.
La imagen se deconvolucionó con el software Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Para las imágenes escaneadas de las baldosas, el montaje de una sola baldosa se realiza mediante el algoritmo de unión automática del software LAS-X. Tras la calibración de la imagen, utilice ImageJ y Adobe Photoshop para procesarla y ajustar uniformemente el brillo y el contraste. Utilice Adobe Illustrator para la preparación gráfica.
Análisis de focos de ADNmt. El número de lesiones de ADNmt se cuantificó en secciones cerebelosas marcadas con anticuerpos anti-ADN mediante microscopio confocal. Se creó cada área diana para el cuerpo celular y el núcleo de cada célula, y el área respectiva se calculó utilizando el complemento Multi Measure (software ImageJ). Reste el área nuclear del área del cuerpo celular para obtener el área citoplasmática. Finalmente, se utilizó el complemento Analyze Particles (software ImageJ) para cuantificar automáticamente los puntos de ADN citoplasmático que indicaban ADNmt en la imagen umbral. Los resultados obtenidos se normalizaron al promedio de PN de ratones CTRL. Los resultados se expresan como el promedio de nucleósidos por célula.
Análisis de la expresión proteica. Utilice el complemento Calculadora de Imágenes de ImageJ para evaluar la expresión proteica en PN a nivel de célula individual. En resumen, en la imagen confocal monocapa del canal correspondiente, mediante la ecuación: señal = min (mtYFP, anticuerpo), se identifica la región mitocondrial inmunorreactiva a un anticuerpo específico en Purkina. A continuación, se cuantifica el área de píxeles en la máscara resultante y se normaliza con la imagen monocapa umbral correspondiente del canal mtYFP para obtener la fracción mitocondrial de la proteína mostrada.
Análisis de la densidad celular de Purkinje. Se utilizó el complemento Cell Counter de ImageJ para evaluar la densidad de Purkinje dividiendo el número de células de Purkinje contadas entre la longitud del anillo cerebeloso ocupado por dichas células.
Preparación y recolección de muestras. Los cerebros del grupo control y de ratones Mfn2cKO se fijaron en PFA al 2%/glutaraldehído al 2,5% en tampón de fosfato (PB) 0,1 M, y luego se prepararon secciones coronales utilizando ciliados (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Austria) (Espesor de 50 a 60 μm). Después, se fijaron en tampón PB en tetraóxido de sodio al 1% y ferrocianuro de potasio al 1,5% a temperatura ambiente durante 1 hora. Las secciones se lavaron tres veces con agua destilada y luego se tiñeron con etanol al 70% que contenía acetato de uranilo al 1% durante 20 minutos. Luego, las secciones se deshidrataron en alcohol graduado y se incluyeron en resina epoxi Durcupan ACM (resina de colada Araldite M) (Electron Microscopy Sciences, número de catálogo 14040) entre portaobjetos de vidrio recubiertos de silicona, y finalmente a 60 °C. Polimerizar en el horno durante 48 horas. Se seleccionó el área de la corteza cerebelosa y se cortaron secciones ultrafinas de 50 nm con Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Austria) y se colocaron en una rejilla de cobre de 2×1 mm recubierta con una película de poliestireno. Las secciones se tiñeron con una solución de acetato de uranilo al 4 % en H₂O durante 10 minutos, se lavaron con H₂O varias veces, luego con citrato de plomo Reynolds en H₂O durante 10 minutos y, finalmente, se lavaron con H₂O varias veces. Se tomaron micrografías con un microscopio electrónico de transmisión Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) utilizando una cámara digital TVIPS (Sistema de Procesamiento de Imágenes y Vídeo Tietz) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, EE. UU., Alemania).
Para ratones infectados con AAV, el cerebro se separó y se cortó en una sección sagital de 1 mm de espesor, y el cerebelo se examinó utilizando un microscopio de fluorescencia para identificar el anillo infectado con AAV (es decir, que expresa mCherry). Solo se utilizan experimentos en los que la inyección de AAV da como resultado una eficiencia de transducción muy alta de la capa de células de Purkinje (es decir, casi toda la capa) en al menos dos anillos cerebelosos consecutivos. El asa transducida con AAV se microdiseccionó para la fijación posterior durante la noche (4% PFA y 2,5% glutaraldehído en tampón de cocoato 0,1 M) y se procesó adicionalmente. Para la inclusión de EPON, el tejido fijado se lavó con tampón de cocoato de sodio 0,1 M (Applichem) y se incubó con 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) en tampón de cocoato de sodio 0,1 M (Applichem) 4 horas, luego lavar durante 2 horas. Repetir 3 veces con tampón de cocamida 0,1 M. Posteriormente, se utilizó la serie ascendente de etanol para incubar cada solución de etanol a 4 °C durante 15 minutos para deshidratar el tejido. El tejido se transfirió a óxido de propileno y se incubó durante la noche en EPON (Sigma-Aldrich) a 4 °C. Coloque el tejido en EPON fresco a temperatura ambiente durante 2 horas y luego inclúyalo a 62 °C durante 72 horas. Utilice un ultramicrótomo (Leica Microsystems, UC6) y un cuchillo de diamante (Diatome, Biel, Suiza) para cortar secciones ultrafinas de 70 nm y teñir con acetato de uranilo al 1,5 % durante 15 minutos a 37 °C, y teñir con solución de citrato de plomo 4 minutos. Las micrografías electrónicas se tomaron utilizando un microscopio electrónico de transmisión JEM-2100 Plus (JEOL) equipado con Camera OneView 4K de 16 bits (Gatan) y software DigitalMicrograph (Gatan). Para el análisis se adquirieron micrografías electrónicas con zoom digital de 5000× o 10 000×.
Análisis morfológico de las mitocondrias. Para todos los análisis, los contornos de cada mitocondria se delinearon manualmente en imágenes digitales mediante el software ImageJ. Se analizaron diferentes parámetros morfológicos. La densidad mitocondrial se expresa como un porcentaje obtenido al dividir el área mitocondrial total de cada célula entre el área del citoplasma (área del citoplasma = área celular - área del núcleo celular) × 100. La redondez de las mitocondrias se calcula mediante la fórmula [4π∙(área/perímetro²)]. Se analizó la morfología ista de las mitocondrias y se dividió en dos categorías («tubular» y «ampolla») según sus formas principales.
Análisis del número y la densidad de autofagosomas/lisosomas. Utilice el software ImageJ para delinear manualmente los contornos de cada autofagosoma/lisosoma en la imagen digital. El área de autofagosoma/lisosoma se expresa como un porcentaje que se calcula dividiendo el área total de la estructura de autofagosoma/lisosoma de cada célula entre el área del citoplasma (área del citoplasma = área celular - área nuclear) × 100. La densidad de autofagosomas/lisosomas se calcula dividiendo el número total entre el número de estructuras de autofagosoma/lisosoma por célula (en términos de área citoplasmática) (área citoplasmática = área celular - área nuclear).
Marcaje para cortes agudos y preparación de muestras. Para experimentos que requieren marcaje de glucosa, transfiera los cortes cerebrales agudos a una cámara de preincubación que contenga carbono saturado (95 % de O₂ y 5 % de CO₂), ACSF con alto contenido de Ca₂+ (125,0 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de tampón de fosfato de sodio, 25,0 mM de NaHCO₃, 25,0 mM de D-glucosa, 1,0 mM de CaCl₂ y 2,0 mM de MgCl₂, ajustado a pH 7,4 y de 310 a 320 mOsm), en el que la glucosa se sustituye por 13 C 6-glucosa (Eurisotop, número de catálogo CLM-1396). Para experimentos que requieren marcaje de piruvato, transfiera los cortes cerebrales agudos a una solución de Ca2+ ACSF más alta (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampón de fosfato de sodio, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosa, 1,0 mM CaCl2 y agregue 2,0 mM MgCl2, ajuste a pH 7,4 y 310 a 320 mOsm) y agregue 1 mM 1-[1-13C]piruvato (Eurisotop, número de catálogo CLM-1082). Incube las secciones durante 90 minutos a 37 °C. Al finalizar el experimento, las secciones se lavaron rápidamente con una solución acuosa (pH 7,4) que contenía 75 mM de carbonato de amonio y se homogeneizaron en una mezcla de acetonitrilo (ACN): metanol: agua en proporción 40:40:20 (v:v:v). Tras incubar las secciones en hielo durante 30 minutos, las muestras se centrifugaron a 21 000 g durante 10 minutos a 4 °C y el sobrenadante transparente se secó en un concentrador SpeedVac. El pellet de metabolito seco resultante se conservó a -80 °C hasta su análisis.
Análisis de aminoácidos marcados con 13 C mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). Para el análisis por cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), el pellet de metabolito se resuspendió en 75 μl de agua de grado LC-MS (Honeywell). Tras centrifugar a 21 000 g durante 5 minutos a 4 °C, se utilizaron 20 μl del sobrenadante clarificado para el análisis de flujo de aminoácidos, mientras que el resto del extracto se utilizó inmediatamente para el análisis de aniones (véase más adelante). El análisis de aminoácidos se realizó utilizando el protocolo de derivatización con cloruro de benzoilo descrito previamente (55, 56). En el primer paso, se añadieron 10 μl de carbonato de sodio 100 mM (Sigma-Aldrich) a 20 μl de extracto de metabolito y, a continuación, 10 μl de cloruro de benzoilo al 2 % (Sigma-Aldrich) al ACN de grado LC. La muestra se agitó brevemente en vórtex y luego se centrifugó a 21.000 g durante 5 minutos a 20 °C. Transfiera el sobrenadante clarificado a un vial de muestreador automático de 2 ml con un inserto de vidrio cónico (volumen de 200 μl). Las muestras se analizaron utilizando el sistema LC de ultra alto rendimiento Acquity iClass (Waters) conectado al espectrómetro de masas de precisión de alta resolución Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Para el análisis, se inyectaron 2 μl de la muestra derivatizada en una columna T3 de sílice de alta resistencia de 100 × 1,0 mm (Waters) que contenía partículas de 1,8 μm. El caudal es de 100 μl/min y el sistema tampón consta del tampón A (formiato de amonio 10 mM y ácido fórmico al 0,15 % en agua) y el tampón B (ACN). El gradiente es el siguiente: 0 % B a los 0 minutos; 0%B. 0 a 15% B a los 0 a 0,1 minutos; 15 a 17% B a los 0,1 a 0,5 minutos; B a los 17 a 55% a los 0,5 a 14 minutos; B a los 55 a 70% a los 14 a 14,5 minutos; a los 14,5 a 70 a 100% B a los 18 minutos; 100% B a los 18 a 19 minutos; 100 a 0% B a los 19 a 19,1 minutos; 0% B a los 19,1 a 28 minutos (55, 56). El espectrómetro de masas QE-HF opera en modo de ionización positiva con un rango de masas de m/z (relación masa/carga) de 50 a 750. La resolución aplicada es de 60 000, el objetivo iónico con control de ganancia (AGC) obtenido es de 3 × 10 6 y el tiempo máximo de ionización es de 100 milisegundos. La fuente de ionización por electrospray (ESI) calentada opera a un voltaje de pulverización de 3,5 kV, una temperatura capilar de 250 °C, un flujo de aire envolvente de 60 AU (unidades arbitrarias) y un flujo de aire auxiliar de 20 AU. La lente S está ajustada a 60 AU.
Análisis por cromatografía de aniones-MS de ácidos orgánicos marcados con 13C. El precipitado de metabolito restante (55 μl) se analizó con un sistema de cromatografía iónica Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) conectado a un espectrómetro de masas QE-HF (Thermo Fisher Scientific). En resumen, se inyectaron 5 μl de extracto de metabolito en una columna Dionex IonPac AS11-HC equipada con HPLC (2 mm × 250 mm, tamaño de partícula 4 μm, Thermo Fisher Scientific) en modo de bucle parcial de inserción con una relación de llenado de 1. ) Precolumna Dionex IonPac AG11-HC (2 mm × 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). La temperatura de la columna se mantiene a 30 °C y el muestreador automático se ajusta a 6 °C. Utilice un cartucho de hidróxido de potasio con agua desionizada para generar un gradiente de hidróxido de potasio a través del generador de eluyente. Separación de metabolitos a un caudal de 380 μl/min, aplicando el siguiente gradiente: 0 a 3 minutos, 10 mM KOH; 3 a 12 minutos, 10 a 50 mM KOH; 12 a 19 minutos, 50 a 100 mM KOH; 19 a 21 minutos, 100 mM KOH; 21 a 21,5 minutos, 100 a 10 mM KOH. La columna se reequilibró con 10 mM KOH durante 8,5 minutos.
Los metabolitos eluidos se combinan con una corriente suplementaria de isopropanol de 150 μl/min después de la columna y se dirigen a un espectrómetro de masas de alta resolución que opera en modo de ionización negativa. El espectrofotómetro de masas (MS) monitorea el rango de masas de m/z 50 a 750 con una resolución de 60 000. El AGC se ajusta a 1×10 6 y el tiempo máximo de ionización se mantiene en 100 ms. La fuente de iones calentada se opera a un voltaje de pulverización de 3,5 kV. Los demás ajustes de la fuente de iones son los siguientes: temperatura capilar: 275 °C; flujo de gas envolvente: 60 AU; flujo de gas auxiliar: 20 AU a 300 °C; y ajuste de la lente S a 60 AU.
Análisis de datos de metabolitos marcados con 13C. Utilice el software TraceFinder (versión 4.2, Thermo Fisher Scientific) para el análisis de datos de la relación isotópica. La identidad de cada compuesto se verificó mediante un compuesto de referencia fiable y se analizó de forma independiente. Para realizar el análisis de enriquecimiento isotópico, el área del cromatograma iónico extraído (XIC) de cada isótopo 13C (Mn) se extrajo de [M + H] +, donde n es el número de carbonos del compuesto diana, utilizado para analizar aminoácidos o [ MH] + se utiliza para analizar aniones. La precisión de masa de XIC es inferior a cinco partes por millón y la precisión de RT es de 0,05 minutos. El análisis de enriquecimiento se realiza calculando la relación de cada isótopo detectado con la suma de todos los isótopos del compuesto correspondiente. Estas relaciones se dan como valores porcentuales para cada isótopo, y los resultados se expresan como porcentaje molar de enriquecimiento (MPE), como se describió anteriormente (42).
El pellet neuronal congelado se homogeneizó en metanol al 80 % (v/v) helado, se agitó en vórtex y se incubó a -20 °C durante 30 minutos. Se volvió a agitar la muestra en vórtex y se agitó a +4 °C durante 30 minutos. La muestra se centrifugó a 21 000 g durante 5 minutos a 4 °C, y posteriormente se recogió el sobrenadante resultante y se secó con un concentrador SpeedVac a 25 °C para su posterior análisis. Como se describió anteriormente, se realizó un análisis LC-MS de los aminoácidos de las células clasificadas. Se utilizó TraceFinder (versión 4.2, Thermo Fisher Scientific) para el análisis de datos, utilizando la masa monoisotópica de cada compuesto. La normalización cuantil de los datos de metabolitos se realizó con el paquete de software preprocessCore (57).
Preparación de cortes. El ratón se anestesió rápidamente con dióxido de carbono y se decapitó. El cerebro se extrajo rápidamente del cráneo y se utilizó un bisturí vibratorio con hielo (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemania) para cortarlo en secciones sagitales de 300 a 375 μm. Gasificación de carbono frío (95 % de O₂ y 5 % de CO₂). Bajo contenido de Ca₂ + ACSF (125,0 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de tampón de fosfato de sodio, 25,0 mM de NaHCO₃, 25,0 mM de D-glucosa, 1,0 mM de CaCl₂ y 6,0 mM de MgCl₂. Ajuste a pH 7,4 y de 310 a 330 mOsm). Transfiera los cortes cerebrales obtenidos a una cámara con una concentración más alta de Ca₂ + ACSF (125,0 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de tampón de fosfato de sodio, 25,0 mM de NaHCO₃, 25,0 mM de D-glucosa, 4,0 mM de CaCl₂ y 3,5 mM de MgCl₂), pH 7,4 y 310 a 320 mOsm. Conserve los cortes durante 20 a 30 minutos para que se puedan restaurar antes de registrarlos.
Registro. Se utilizó una platina de microscopio equipada con una cámara de registro fija y un objetivo de inmersión en agua de 20x (Scientifica) para todos los registros. Las supuestas células de Purkinje se identificaron por (i) tamaño corporal, (ii) ubicación anatómica del cerebelo y (iii) expresión del gen reportero fluorescente mtYFP. La pipeta de parche con una resistencia en la punta de 5 a 11 megaohmios se extrae mediante un capilar de vidrio de borosilicato (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Alemania) y una pipeta horizontal Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Todos los registros se realizaron con el amplificador de pinza de parche ELC-03XS npi (npi electronic GmbH, Tam, Alemania), que fue controlado por el software Signal (versión 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Reino Unido). El experimento se registró a una frecuencia de muestreo de 12,5 kHz. La señal se filtra con dos filtros Bessel de paso corto con frecuencias de corte de 1,3 y 10 kHz, respectivamente. La capacitancia de la membrana y la pipeta se compensa mediante el circuito de compensación que utiliza el amplificador. Todos los experimentos se realizaron con una cámara Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Alemania), controlada por el software Hokawo (versión 2.8, Hamamatsu, Gerden, Alemania).
Configuración y análisis de rutina de células completas. Inmediatamente antes del registro, llene la pipeta con la solución interna que contiene las siguientes sustancias: 4,0 mM de KCl, 2,0 mM de NaCl, 0,2 mM de EGTA, 135,0 mM de gluconato de potasio, 10,0 mM de Hepes, 4,0 mM de ATP (Mg), 0,5 mM de guanosina trifosfato (GTP) (Na) y 10,0 mM de fosfato de creatinina. El pH se ajustó a 7,25 y la presión osmótica fue de 290 mOsm (sacarosa). Inmediatamente después de aplicar una fuerza de 0 pA para romper la membrana, se midió el potencial de membrana en reposo. La resistencia de entrada se mide aplicando corrientes hiperpolarizadas de -40, -30, -20 y -10 pA. Mida la magnitud de la respuesta de voltaje y utilice la ley de Ohm para calcular la resistencia de entrada. La actividad espontánea se registró con una pinza de voltaje durante 5 minutos, y la sPSC se identificó y midió en Igor Pro (versión 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregón, EE. UU.) utilizando un script de reconocimiento semiautomático. La curva IV y la corriente de estado estable se miden fijando la batería a diferentes potenciales (comenzando desde -110 mV) y aumentando el voltaje en pasos de 5 mV. La producción de PA se probó aplicando una corriente despolarizante. Fije la celda a -70 mV mientras aplica un pulso de corriente despolarizante. Ajuste el tamaño del paso de cada unidad de registro por separado (de 10 a 60 pA). Calcule la frecuencia máxima de PA contando manualmente los picos de pulso que causan la frecuencia de PA más alta. El umbral de PA se analiza utilizando la segunda derivada del pulso de despolarización que primero activa uno o más PA.
Configuración y análisis del parche perforado. Realice el registro del parche perforado utilizando protocolos estándar. Utilice una pipeta sin ATP ni GTP que no contenga los siguientes ingredientes: gluconato K 128 mM, KCl 10 mM, Hepes 10 mM, EGTA 0,1 mM y MgCl₂ 2 mM, y ajuste el pH a 7,2 (utilizando KOH). El ATP y el GTP se omiten de la solución intracelular para evitar la permeabilidad incontrolada de la membrana celular. La pipeta del parche se llena con una solución interna que contiene anfotericina (aproximadamente de 200 a 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) para obtener un registro del parche perforado. La anfotericina se disolvió en dimetilsulfóxido (concentración final: del 0,1 al 0,3 %; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). La concentración de DMSO utilizada no tuvo un efecto significativo en las neuronas estudiadas. Durante el proceso de punzonado, se monitoreó continuamente la resistencia del canal (Ra) y el experimento se inició tras la estabilización de la amplitud de Ra y el PA (entre 20 y 40 minutos). La actividad espontánea se mide con una pinza de tensión o corriente durante 2 a 5 minutos. El análisis de datos se realizó con Igor Pro (versión 7.05.2, WaveMetrics, EE. UU.), Excel (versión 2010, Microsoft Corporation, Redmond, EE. UU.) y GraphPad Prism (versión 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE. UU.). Para identificar los PA espontáneos, se utiliza el complemento NeuroMatic v3.0c de IgorPro. Los PA se identifican automáticamente mediante un umbral determinado, que se ajusta individualmente para cada registro. Mediante el intervalo de pico, se determina la frecuencia de pico con la frecuencia máxima instantánea de pico y la frecuencia media de pico.
Aislamiento de PN. Siguiendo el protocolo publicado previamente, se purificó PN del cerebelo de ratón en una etapa específica (58). En resumen, el cerebelo se diseccionó y se trituró en un medio de disociación helado [sin HBSS Ca₂₄ ni Mg₂₄, suplementado con glucosa 20 mM, penicilina (50 U/ml) y estreptomicina (0,05 mg/ml)], y posteriormente se digirió el medio en papaína [HBSS, suplementado con 1-cisteína·HCl (1 mg/ml), papaína (16 U/ml) y desoxirribonucleasa I (DNasa I; 0,1 mg/ml)]. Se trató durante 30 minutos a 30 °C. Primero lavar los tejidos en medio HBSS que contiene moco de huevo (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) y DNasa (0,1 mg/ml) a temperatura ambiente para evitar la digestión enzimática, y luego en el medio HBSS que contiene glucosa 20 mM Moliendo suavemente en HBSS, penicilina (50 U/ml), estreptomicina (0,05 mg/ml) y DNasa (0,1 mg/ml) liberan células individuales. La suspensión celular resultante se filtró a través de un colador de células de 70 μm, luego las células se sedimentaron por centrifugación (1110 rpm, 5 minutos, 4 °C) y se resuspendieron en medio de clasificación [HBSS, suplementado con glucosa 20 mM, 20% suero bovino fetal, penicilina (50 U/ml) y estreptomicina (0,05 mg/ml)]; Se evaluó la viabilidad celular con yoduro de propidio y se ajustó la densidad celular a 1×10⁻⁴ a 2×10⁻⁴ células/ml. Antes de la citometría de flujo, la suspensión se filtró a través de un filtro celular de 50 μm.
Citómetro de flujo. La clasificación celular se realizó a 4 °C utilizando la máquina FACSAria III (BD Biosciences) y el software FACSDiva (BD Biosciences, versión 8.0.1). La suspensión celular se clasificó utilizando una boquilla de 100 μm bajo una presión de 20 psi a una velocidad de ~2800 eventos/s. Dado que los criterios tradicionales de selección (tamaño celular, discriminación bimodal y características de dispersión) no pueden garantizar el aislamiento correcto de PN de otros tipos celulares, la estrategia de selección se establece en base a la comparación directa de la intensidad de YFP y la autofluorescencia en mitoYFP+ ​​​​y el control mitoYFP − Ratones. YFP se excita irradiando la muestra con una línea láser de 488 nm, y la señal se detecta utilizando un filtro de paso de banda de 530/30 nm. En ratones mitoYFP+ ​​​​, la fuerza relativa del gen reportero Rosa26-mitoYFP también se utiliza para distinguir el cuerpo neuronal y los fragmentos axónicos. El 7-AAD se excita con un láser amarillo de 561 nm y se detecta con un filtro de paso de banda de 675/20 nm para excluir las células muertas. Para separar simultáneamente los astrocitos, la suspensión celular se tiñó con ACSA-2-APC, luego la muestra se irradió con una línea láser de 640 nm y se utilizó un filtro de paso de banda de 660/20 nm para detectar la señal.
Las células recolectadas se sedimentaron mediante centrifugación (1110 rpm, 5 minutos, 4 °C) y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Los ratones Mfn2cKO y sus crías se clasificaron el mismo día para minimizar la variabilidad del procedimiento. La presentación y el análisis de los datos FACS se realizaron con el software FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregón, EE. UU.).
Como se mencionó anteriormente (59), la PCR en tiempo real se utiliza para aislar el ADN de las neuronas clasificadas para la posterior cuantificación del ADNmt. La linealidad y la sensibilidad umbral se probaron inicialmente ejecutando qPCR en diferentes números de células. En resumen, se recolectaron 300 PN en un tampón de lisis compuesto por 50 mM de tris-HCl (pH 8,5), 1 mM de EDTA, 0,5 % de Tween 20 y proteinasa K (200 ng/ml) y se incubó a 55 °C durante 120 minutos. Las células se incubaron adicionalmente a 95 °C durante 10 minutos para asegurar la inactivación completa de la proteinasa K. Utilizando una sonda TaqMan (Thermo Fisher) específica para mt-Nd1, el ADNmt se midió mediante PCR semicuantitativa en el sistema de PCR en tiempo real 7900HT (Thermo Fisher Scientific). Science, número de catálogo Mm04225274_s1), genes mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, número de catálogo AIVI3E8) y 18S (Thermo Fisher Scientific, número de catálogo Hs99999901_s1).
Preparación de la muestra del proteoma. Calentando la solución a 95 °C durante 10 minutos y sonicando, en el tampón de lisis [cloruro de guanidina 6 M, clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina 10 mM, cloroacetamida 10 mM y tris- 100 mM Lise los pellets de neuronas congeladas en HCl]. En Bioruptor (Diagenode) durante 10 minutos (30 segundos de pulso / 30 segundos de pausa). La muestra se diluyó 1:10 en tris-HCl 20 mM (pH 8,0), se mezcló con 300 ng de tripsina de oro (Promega) y se incubó durante la noche a 37 °C para lograr una digestión completa. El segundo día, la muestra se centrifugó a 20.000 g durante 20 minutos. El sobrenadante se diluyó con ácido fórmico al 0,1 % y la solución se desalinizó con StageTips de fabricación propia. La muestra se secó en un instrumento SpeedVac (concentrador Eppendorf plus 5305) a 45 °C y, a continuación, el péptido se suspendió en ácido fórmico al 0,1 %. Todas las muestras fueron preparadas simultáneamente por la misma persona. Para analizar las muestras de astrocitos, se marcaron 4 μg de péptidos desalinizados con un marcador de masa en tándem (TMT10plex, número de catálogo 90110, Thermo Fisher Scientific) con una proporción de péptido a reactivo TMT de 1:20. Para el marcaje de TMT, se resuspendieron 0,8 mg de reactivo TMT en 70 μl de ACN anhidro y el péptido seco se reconstituyó en 9 μl de TEAB (bicarbonato de trietilamonio) 0,1 M, al que se añadieron 7 μl de reactivo TMT en ACN. La concentración fue del 43,75 %. Tras 60 minutos de incubación, la reacción se extinguió con 2 μl de hidroxilamina al 5%. Los péptidos marcados se recogieron, se secaron, se resuspendieron en 200 μl de ácido fórmico (AF) al 0,1%, se dividieron en dos y se desalinizaron con StageTips de fabricación propia. Mediante un cromatógrafo de líquidos de ultraalta resolución UltiMate 3000 (cromatógrafo de líquidos de ultraalta resolución UltiMate 3000), una de las dos mitades se fraccionó en una columna cromatográfica Acquity de 1 mm x 150 mm con partículas C18 de 130 Å1,7 μm (Waters, n.º de catálogo: 186006935). Thermo Fisher Scientific. Separe los péptidos a un caudal de 30 μl/min, separe del tampón B al 1 % al 50 % durante 85 minutos con un gradiente escalonado de 96 minutos, del tampón B al 50 % al 95 % durante 3 minutos y, posteriormente, 8 minutos para el tampón B al 95 %; el tampón A contiene 5 % de ACN y 10 mM de bicarbonato de amonio (ABC), y el tampón B contiene 80 % de ACN y 10 mM de ABC. Recoja las fracciones cada 3 minutos, combínelas en dos grupos (1 + 17, 2 + 18, etc.) y séquelas en una centrífuga de vacío.
Análisis LC-MS/MS. Para la espectrometría de masas, los péptidos (número r119.aq) se separaron en una columna analítica PicoFrit de 25 cm y 75 μm de diámetro interior (nueva lente de objetivo, número de pieza PF7508250) equipada con medio ReproSil-Pur 120 C18-AQ de 1,9 μm (Dr. Maisch, mat). Se utilizó el sistema EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Alemania). La columna se mantuvo a 50 °C. Los tampones A y B son ácido fórmico al 0,1 % en agua y ácido fórmico al 0,1 % en ACN al 80 %, respectivamente. Los péptidos se separaron del tampón B al 6 % al 31 % durante 65 minutos y del tampón B al 31 % al 50 % durante 5 minutos con un gradiente de 200 nl/min. Los péptidos eluidos se analizaron en un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). La medición de la relación m/z del precursor peptídico se realizó con una resolución de 120 000 en un rango de 350 a 1500 m/z. Utilizando una energía de colisión normalizada del 27 %, se seleccionó el precursor más potente con un estado de carga de 2 a 6 para la escisión por disociación de trampa de C de alta energía (HCD). El tiempo de ciclo se estableció en 1 s. El valor de m/z del fragmento peptídico se midió en la trampa de iones utilizando el objetivo de AGC más pequeño de 5×10⁻¹ y un tiempo de inyección máximo de 86 ms. Tras la fragmentación, el precursor se incluyó en la lista de exclusión dinámica durante 45 s. Los péptidos marcados con TMT se separaron en una columna Acclaim PepMap de 50 cm y 75 μm (Thermo Fisher Scientific, número de catálogo 164942), y los espectros de migración se analizaron en un espectrómetro de masas Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) equipado con un equipo de iones de forma de onda asimétrica de alto campo (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) que opera a dos voltajes de compensación de -50 y -70 V. El MS3 seleccionado con base en el precursor de sincronización se utiliza para la medición de la señal iónica del informe de TMT. La separación de péptidos se llevó a cabo en un EASY-nLC 1200, utilizando una elución de gradiente lineal del 90%, con una concentración de tampón del 6% al 31%; el tampón A fue 0,1% FA, y el tampón B fue 0,1% FA y 80% ACN. La columna analítica opera a 50 °C. Utilice FreeStyle (versión 1.6, Thermo Fisher Scientific) para dividir el archivo original según el voltaje de compensación FAIMS.
Identificación y cuantificación de proteínas. Utilizando el motor de búsqueda integrado Andromeda, los datos originales se analizaron utilizando MaxQuant versión 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Además de las secuencias de Cre recombinasa y YFP obtenidas de Aequorea victoria, se buscaron espectros de fragmentos peptídicos para la secuencia canónica y la secuencia de isoformas del proteoma de referencia de ratón (ID de proteoma UP000000589, descargado de UniProt en mayo de 2017). La oxidación de metionina y la acetilación N-terminal de la proteína se establecieron como modificaciones variables; la metilación de carbamoil de cisteína se estableció como modificaciones fijas. Los parámetros de digestión se establecen en "especificidad" y "tripsina/P". El número mínimo de péptidos y péptidos razor utilizados para la identificación de proteínas es 1; el número mínimo de péptidos únicos es 0. Bajo las condiciones de coincidencia del mapa de péptidos, la tasa de identificación de proteínas fue de 0,01. La opción "Segundo péptido" está habilitada. Utilice la opción "coincidencia entre ejecuciones" para transferir identificaciones exitosas entre diferentes archivos originales. Utilice el recuento mínimo de razón LFQ 1 para la cuantificación sin etiqueta (LFQ) (60). La intensidad de LFQ se filtra para al menos dos valores válidos en al menos un grupo de genotipo en cada punto de tiempo, y se extrapola de una distribución normal con un ancho de 0,3 y se mueve hacia abajo 1,8. Utilice la plataforma informática Perseus (https://maxquant.net/perseus/) y R (https://r-project.org/) para analizar los resultados de LFQ. Se utilizó una prueba t moderada de dos vías del paquete de software limma para el análisis de expresión diferencial (61). El análisis exploratorio de datos se realiza utilizando ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally y pheatmap. Los datos de proteómica basados ​​en TMT se analizaron utilizando MaxQuant versión 1.6.10.43. Busque datos proteómicos sin procesar en la base de datos de proteómica humana de UniProt, descargada en septiembre de 2018. El análisis incluye el factor de corrección de pureza isotópica proporcionado por el fabricante. Utilice limma en R para el análisis de expresión diferencial. Los datos originales, los resultados de la búsqueda en la base de datos, el flujo de trabajo y los resultados del análisis de datos se almacenan en la alianza ProteomeXchange a través del repositorio de socios PRIDE con el identificador de conjunto de datos PXD019690.
Las anotaciones funcionales enriquecen el análisis. Se utilizó la herramienta Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) para determinar la riqueza de los términos de anotación funcional del conjunto de datos a las 8 semanas (Figura 1). En resumen, la lista cuantitativa de proteínas obtenida del análisis de datos LC-MS/MS (espectrometría de masas en tándem) se utiliza con los siguientes criterios de filtro: se selecciona Mus musculus como especie y fondo, y la categoría muestra el valor P ajustado por Benjamini para enriquecimiento de 0,05 o inferior se considera significativo. Para este gráfico, se muestran las cinco categorías de exceso principales en cada grupo con base en el valor P ajustado. Utilizando la prueba t múltiple, utilizando el programa de refuerzo lineal de dos etapas de Benjamini, Krieger y Yekutieli (Q = 5%), se realiza un análisis de la expresión de proteínas en el curso del tiempo en los candidatos importantes identificados en cada categoría, y cada fila se analiza por separado. No es necesario adoptar una DE consistente.
Para comparar los resultados de este estudio con las bases de datos publicadas y generar un diagrama de Venn en la Figura 1, combinamos la lista cuantitativa de proteínas con las anotaciones de MitoCarta 2.0 (24). Utilice la herramienta en línea "Dibujar diagrama de Venn" (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) para generar el diagrama.
Para obtener información detallada sobre los procedimientos estadísticos utilizados en el análisis proteómico, consulte la sección correspondiente de Materiales y Métodos. Para todos los demás experimentos, encontrará información detallada en la leyenda correspondiente. Salvo que se especifique lo contrario, todos los datos se expresan como media ± EEM y todos los análisis estadísticos se realizaron con el software GraphPad Prism 8.1.2.
Para obtener materiales complementarios para este artículo, consulte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
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Por E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. larson
El análisis proteómico de neuronas disfuncionales reveló que los programas metabólicos se activan para contrarrestar la neurodegeneración.
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