Actual *Dirección actual: Colonia 50931, Alemania, Colonia, Clúster de Excelencia en Investigación sobre la Respuesta al Estrés Celular en Enfermedades Relacionadas con el Envejecimiento (CECAD).
La neurodegeneración de las enfermedades mitocondriales se considera irreversible debido a la limitada plasticidad metabólica de las neuronas, pero el efecto de la disfunción mitocondrial en la autonomía celular del metabolismo neuronal en el organismo es poco conocido. En este estudio, presentamos el proteoma específico de las neuronas de Purkinje con deficiencia progresiva de OXPHOS causada por la alteración de la dinámica de fusión mitocondrial. Descubrimos que la disfunción mitocondrial desencadenó un cambio profundo en el campo de la proteómica, que finalmente condujo a la activación secuencial de programas metabólicos precisos antes de la muerte celular. Inesperadamente, determinamos la inducción evidente de la piruvato carboxilasa (PCx) y otras enzimas antienvejecimiento que complementan los intermediarios del ciclo de Krebs. La inhibición de la PCx exacerbó el estrés oxidativo y la neurodegeneración, lo que indica que la aterosclerosis tiene un efecto protector en las neuronas que carecen de OXPHOS. La restauración de la fusión mitocondrial en neuronas con degeneración terminal revierte completamente estas características metabólicas, previniendo así la muerte celular. Nuestros hallazgos identifican vías previamente desconocidas que confieren resistencia a la disfunción mitocondrial y demuestran que la neurodegeneración puede revertirse incluso en las etapas avanzadas de la enfermedad.
El papel central de las mitocondrias en el mantenimiento del metabolismo energético neuronal se ve reforzado por los extensos síntomas neurológicos asociados a las enfermedades mitocondriales humanas. La mayoría de estas enfermedades son causadas por mutaciones genéticas que regulan la expresión génica mitocondrial (1, 2) o por la destrucción de genes relacionados con la dinámica mitocondrial, que afectan indirectamente la estabilidad del ADN mitocondrial (ADNmt) (3, 4). Estudios en modelos animales han demostrado que, en respuesta a la disfunción mitocondrial en los tejidos circundantes, se pueden activar vías metabólicas conservadoras (5-7), lo que proporciona información importante para una comprensión profunda de la patogénesis de estas enfermedades complejas. Por el contrario, nuestra comprensión de los cambios metabólicos de tipos celulares específicos causados ​​por el fallo general de la producción de adenosín trifosfato (ATP) mitocondrial cerebral es fundamental (8), lo que subraya la necesidad de identificar dianas terapéuticas que puedan utilizarse para prevenir la enfermedad o la neurodegeneración (9). La falta de información radica en que se considera que las células nerviosas tienen una flexibilidad metabólica muy limitada en comparación con los tipos celulares de los tejidos circundantes (10). Dado que estas células desempeñan un papel fundamental en la coordinación del suministro de metabolitos a las neuronas para promover la transmisión sináptica y responder a lesiones y enfermedades, la capacidad de adaptar el metabolismo celular a las condiciones adversas del tejido cerebral se limita casi exclusivamente a las células gliales (11-14). Además, la heterogeneidad celular inherente al tejido cerebral dificulta en gran medida el estudio de los cambios metabólicos que ocurren en subgrupos neuronales específicos. En consecuencia, se sabe poco sobre las consecuencias celulares y metabólicas exactas de la disfunción mitocondrial en las neuronas.
Para comprender las consecuencias metabólicas de la disfunción mitocondrial, aislamos neuronas de Purkinje (PN) en diferentes etapas de neurodegeneración causada por la destrucción de la proteína de fusión de la membrana externa mitocondrial (Mfn2). Si bien las mutaciones de Mfn2 en humanos se asocian con una forma de neuropatía sensitivomotora hereditaria conocida como enfermedad de Charcot-Marie-Tooth tipo 2A (15), la destrucción condicional de Mfn2 en ratones es un método bien reconocido para inducir la disfunción de la fosforilación oxidativa (OXPHOS). Los diversos subtipos neuronales (16-19) y el fenotipo neurodegenerativo resultante se acompañan de síntomas neurológicos progresivos, como trastornos del movimiento (18, 19) o ataxia cerebelosa (16). Mediante una combinación de proteómica cuantitativa sin marcadores (LFQ), metabolómica, imágenes y métodos virológicos, demostramos que la neurodegeneración progresiva induce fuertemente la expresión de enzimas de la piruvato carboxilasa (PCx) y otros factores involucrados en la arteriosclerosis de los PN in vivo. Para verificar la relevancia de este hallazgo, regulamos a la baja específicamente la expresión de PCx en PN deficientes en Mfn2, y encontramos que esta operación agravó el estrés oxidativo y aceleró la neurodegeneración, lo que demuestra que la azoospermia confiere adaptabilidad metabólica a la muerte celular. La expresión severa de MFN2 puede rescatar completamente la degeneración terminal de PN con deficiencia severa de OXPHOS, consumo masivo de ADN mitocondrial y red mitocondrial aparentemente rota, lo que enfatiza aún más que esta forma de neurodegeneración puede incluso recuperarse en la etapa avanzada de la enfermedad antes de la muerte celular.
Para visualizar las mitocondrias en las neuronas PN con deleción del gen Mfn2, utilizamos una cepa de ratón que permite que las mitocondrias dependientes de Cre dirijan la expresión de la proteína fluorescente amarilla (YFP) (mtYFP) (20) Cre y comprobamos la morfología mitocondrial in vivo. Descubrimos que la destrucción del gen Mfn2 en las neuronas PN conduciría a la división gradual de la red mitocondrial (Figura S1A), y el cambio más temprano se observó a las 3 semanas de edad. En contraste, la degeneración sustancial de la capa celular de las neuronas PN, como lo demuestra la pérdida de la inmunotinción de calbindina, no comenzó hasta las 12 semanas de edad (Figura 1, A y B). El desfase temporal entre los primeros cambios en la morfología mitocondrial y el inicio visible de la muerte neuronal nos impulsó a investigar los cambios metabólicos desencadenados por la disfunción mitocondrial antes de la muerte celular. Desarrollamos una estrategia basada en la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para aislar PN que expresan YFP (YFP+) (Figura 1C), y en ratones control (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), en adelante denominados CTRL (Figura S1B). La optimización de la estrategia de compuerta basada en la intensidad relativa de la señal YFP nos permite purificar el cuerpo YFP+ (YFPhigh) de PN de no PN (YFPneg) (Figura S1B) o fragmentos de axones/dendríticos fluorescentes putativos (YFPlow; Figura S1D, izquierda), confirmado por microscopía confocal (Figura S1D, derecha). Para verificar la identidad de la población clasificada, realizamos proteómica LFQ y luego análisis de componentes principales, y encontramos que hay una clara separación entre las células YFPhigh y YFPneg (Figura S1C). Las células YFPhigh mostraron un enriquecimiento neto de marcadores PN conocidos (es decir, Calb1, Pcp2, Grid2 e Itpr3) (21, 22), pero no un enriquecimiento de proteínas comúnmente expresadas en neuronas u otros tipos de células (Figura 1D) ). Una comparación entre muestras en células YFPhigh clasificadas recolectadas en experimentos independientes mostró un coeficiente de correlación > 0,9, lo que demuestra una buena reproducibilidad entre réplicas biológicas (Figura S1E). En resumen, estos datos validaron nuestro plan para el aislamiento agudo y específico de PN factibles. Debido a que el sistema de impulsor L7-cre utilizado induce recombinación mosaico en la primera semana después de la entrega (23), comenzamos a sacrificar ratones de CTRL y condicional (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Recolectar neuronas. Después de que se completa la recombinación, se denomina Mfn2cKO a las 4 semanas de edad. Como punto final, elegimos 8 semanas de edad cuando la capa PN estaba intacta a pesar de la evidente fragmentación mitocondrial (Figura 1B y Figura S1A). En total, cuantificamos un total de 3013 proteínas, de las cuales aproximadamente el 22% se basaron en anotaciones de MitoCarta 2.0 basadas en el proteoma mitocondrial como mitocondrias (Figura 1E) (Figura 1E) (24). El análisis de expresión génica diferencial realizado en la semana 8 mostró que solo el 10,5% de todas las proteínas tuvieron cambios significativos (Figura 1F y Figura S1F), de las cuales 195 proteínas fueron reguladas a la baja y 120 proteínas fueron reguladas al alza (Figura 1F). Cabe destacar que el “análisis de vías innovadoras” de este conjunto de datos muestra que los genes expresados ​​diferencialmente pertenecen principalmente a un conjunto restringido de vías metabólicas específicas (Figura 1G). Curiosamente, aunque la regulación negativa de las vías relacionadas con la fosforilación oxidativa y la señalización del calcio confirma la inducción de disfunción mitocondrial en las neuronas PN deficientes en fusión, otras categorías que involucran principalmente el metabolismo de los aminoácidos están significativamente reguladas positivamente, lo que está en línea con el metabolismo que ocurre en la disfunción de las neuronas PN. La reorganización mitocondrial es consistente.
(A) Fotografías confocales representativas de secciones cerebelosas de ratones CTRL y Mfn2cKO que muestran la pérdida progresiva de PN (calbindina, gris); los núcleos se contratiñeron con DAPI. (B) Cuantificación de (A) (análisis de varianza unidireccional, ***P<0,001; n = 4 a 6 círculos de tres ratones). (C) Flujo de trabajo experimental. (D) Distribución del mapa de calor de marcadores específicos de Purkinje (arriba) y otros tipos de células (medio). (E) Diagrama de Venn que muestra el número de proteínas mitocondriales identificadas en la PN clasificada. (F) Gráfico de volcán de proteínas expresadas diferencialmente en neuronas Mfn2cKO a las 8 semanas (valor de corte de significancia de 1,3). (G) El análisis de la vía de la creatividad muestra las cinco vías de regulación positiva (rojo) y negativa (azul) más importantes en la PN Mfn2cKO clasificada a las 8 semanas. Se muestra el nivel de expresión promedio de cada proteína detectada. Mapa de calor en escala de grises: valor P ajustado. ns, no importante.
Los datos de proteómica mostraron que la expresión de proteínas de los complejos I, III y IV disminuyó gradualmente. Los complejos I, III y IV contenían subunidades esenciales codificadas por el ADNmt, mientras que el complejo II, que solo estaba codificado nuclearmente, no se vio afectado básicamente (Figura 2A y Figura S2A). . De acuerdo con los resultados de proteómica, la inmunohistoquímica de secciones de tejido cerebeloso mostró que el nivel de la subunidad MTCO1 (subunidad 1 de la citocromo C oxidasa mitocondrial) del complejo IV en PN disminuyó gradualmente (Figura 2B). La subunidad Mtatp8 codificada por el ADNmt se redujo significativamente (Figura S2A), mientras que el nivel de estado estacionario de la subunidad de la ATP sintasa codificada nuclearmente permaneció sin cambios, lo que es consistente con el conocido complejo F1 de subensamblaje estable de la ATP sintasa cuando la expresión del ADNmt es estable. La formación es consistente. Interrupción (7). La evaluación del nivel de ADNmt en los PN Mfn2cKO clasificados mediante reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR) confirmó la disminución gradual en el número de copias de ADNmt. En comparación con el grupo control, a las 8 semanas de edad, solo se retuvo alrededor del 20% del nivel de ADNmt (Figura 2C). De acuerdo con estos resultados, se utilizó la tinción por microscopía confocal de los PN Mfn2cKO para detectar ADN, mostrando el consumo dependiente del tiempo de nucleótidos mitocondriales (Figura 2D). Encontramos que solo algunos candidatos involucrados en la degradación de proteínas mitocondriales y la respuesta al estrés estaban regulados positivamente, incluyendo Lonp1, Afg3l2 y Clpx, y factores de ensamblaje del complejo OXPHOS. No se detectaron cambios significativos en los niveles de proteínas involucradas en la apoptosis (Figura S2B). De manera similar, encontramos que los canales mitocondriales y del retículo endoplasmático involucrados en el transporte de calcio tienen solo cambios menores (Figura S2C). Además, la evaluación de las proteínas relacionadas con la autofagia no encontró cambios significativos, lo cual es consistente con la inducción visible de autofagosomas observada in vivo por inmunohistoquímica y microscopía electrónica (Figura S3). Sin embargo, la disfunción progresiva de OXPHOS en PN se acompaña de cambios mitocondriales ultraestructurales evidentes. Se pueden ver cúmulos mitocondriales en los cuerpos celulares y árboles dendríticos de PN Mfn2cKO de 5 y 8 semanas de edad, y la estructura de la membrana interna ha sufrido cambios profundos (Figura S4, A y B). En consonancia con estos cambios ultraestructurales y una disminución significativa del mtDNA, el análisis de cortes cerebelosos cerebrales agudos con éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM) mostró que el potencial de membrana mitocondrial en PN Mfn2cKO estaba significativamente disminuido (Figura S4C).
(A) Análisis del curso temporal del nivel de expresión del complejo OXPHOS. Solo se consideran las proteínas con P<0,05 a las 8 semanas (ANOVA de dos vías). Línea punteada: Sin ajuste comparado con CTRL. (B) Izquierda: Ejemplo de una sección cerebelosa marcada con anticuerpo anti-MTCO1 (barra de escala, 20 μm). El área ocupada por los cuerpos celulares de Purkinje está cubierta de amarillo. Derecha: Cuantificación de los niveles de MTCO1 (análisis de varianza de una vía; n = 7 a 20 células analizadas de tres ratones). (C) Análisis de qPCR del número de copias de ADNmt en el PN ordenado (análisis de varianza de una vía; n = 3 a 7 ratones). (D) Izquierda: Ejemplo de una sección cerebelosa marcada con un anticuerpo anti-ADN (barra de escala, 20 μm). El área ocupada por los cuerpos celulares de Purkinje está cubierta de amarillo. Derecha: Cuantificación de lesiones de ADNmt (análisis de varianza unidireccional; n = 5 a 9 células de tres ratones). (E) Ejemplo de una sección cerebelosa aguda que muestra células de Purkinje mitoYFP+ ​​(flecha) en un registro de pinzamiento de parche de célula completa. (F) Cuantificación de la curva IV. (G) Registros representativos de inyección de corriente despolarizante en células de Purkinje CTRL y Mfn2cKO. Traza superior: El primer pulso que desencadenó el AP. Traza inferior: Frecuencia máxima del AP. (H) Cuantificación de entradas espontáneas postsinápticas (sPSP). La traza de registro representativa y su relación de zoom se muestran en (I). Análisis de varianza unidireccional analizado n = 5 a 20 células de tres ratones. Los datos se expresan como media ± SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Trazas representativas de AP espontáneo registrado utilizando el modo de pinzamiento de parche perforado. Traza superior: Frecuencia máxima del AP. Trazo inferior: zoom de un único AP. (K) Cuantifique la frecuencia promedio y máxima de AP según (J). Prueba de Mann-Whitney; se analizaron n = 5 células de cuatro ratones. Los datos se expresan como media ± SEM; no es importante.
Se detectó un daño evidente en la fosforilación oxidativa (OXPHOS) en las neuronas PN Mfn2cKO de 8 semanas de edad, lo que indica que la función fisiológica de las neuronas es gravemente anormal. Por lo tanto, analizamos las características eléctricas pasivas de las neuronas deficientes en OXPHOS a las 4-5 semanas y a las 7-8 semanas mediante registros de patch clamp de célula completa en cortes cerebelosos agudos (Figura 2E). Inesperadamente, el potencial de membrana en reposo promedio y la resistencia de entrada de las neuronas Mfn2cKO fueron similares al control, aunque hubo diferencias sutiles entre las células (Tabla 1). De manera similar, a las 4-5 semanas de edad, no se encontraron cambios significativos en la relación corriente-voltaje (curva IV) (Figura 2F). Sin embargo, ninguna neurona Mfn2cKO de 7-8 semanas de edad sobrevivió al régimen IV (paso de hiperpolarización), lo que indica que hay una clara sensibilidad al potencial de hiperpolarización en esta etapa tardía. En contraste, en las neuronas Mfn2cKO, las corrientes despolarizantes que causan descargas repetitivas de potencial de acción (PA) son bien toleradas, lo que indica que sus patrones de descarga generales no son significativamente diferentes de los de las neuronas de control de 8 semanas de edad (Tabla 1 y Figura 2G). De manera similar, la frecuencia y amplitud de las corrientes postsinápticas espontáneas (sPSC) fueron comparables a las del grupo de control, y la frecuencia de eventos aumentó de 4 semanas a 5 semanas a 7 semanas a 8 semanas con un aumento similar (Figura 2, H e I). El período de maduración sináptica en PN (25). Se obtuvieron resultados similares después de parches de PN perforados. Esta configuración evita la posible compensación de defectos de ATP celular, como podría ocurrir en el registro de pinzamiento de parche de célula completa. En particular, el potencial de membrana en reposo y la frecuencia de disparo espontáneo de las neuronas Mfn2cKO no se vieron afectados (Figura 2, J y K). En resumen, estos resultados indican que las neuronas piramidales con disfunción evidente de la fosforilación oxidativa pueden hacer frente bien a los patrones de descarga de alta frecuencia, lo que indica que existe un mecanismo de compensación que les permite mantener respuestas electrofisiológicas casi normales.
Los datos se expresan como media ± error estándar de la media (análisis de varianza unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Holm-Sidak; *P<0,05). El número de unidad se indica entre corchetes.
Nos propusimos investigar si alguna categoría en el conjunto de datos de proteómica (Figura 1G) incluye vías que pueden contrarrestar la deficiencia grave de OXPHOS, lo que explicaría por qué la PN afectada puede mantener una electrofisiología casi normal (Figura 2, E a K). . El análisis de proteómica mostró que las enzimas involucradas en el catabolismo de los aminoácidos de cadena ramificada (BCAA) estaban significativamente reguladas al alza (Figura 3A y Figura S5A), y el producto final acetil-CoA (CoA) o succinil CoA puede complementar los tricarboxilatos en el ciclo del ácido arteriosclerótico (TCA). Encontramos que el contenido de BCAA transaminasa 1 (BCAT1) y BCAT2 aumentó. Estas catalizan el primer paso del catabolismo de BCAA al generar glutamato a partir de α-cetoglutarato (26). Todas las subunidades que componen el complejo de la deshidrogenasa de cetoácidos de cadena ramificada (BCKD) están reguladas positivamente (el complejo cataliza la descarboxilación subsiguiente e irreversible del esqueleto de carbono de BCAA resultante) (Figura 3A y Figura S5A). Sin embargo, no se encontraron cambios obvios en los BCAA en sí mismos en el PN clasificado, lo que puede deberse al aumento de la captación celular de estos aminoácidos esenciales o al uso de otras fuentes (glucosa o ácido láctico) para complementar el ciclo de TCA (Figura S5B). Los PN que carecían de OXPHOS también mostraron un aumento de las actividades de descomposición y transaminación de glutamina a las 8 semanas de edad, lo que puede reflejarse en la regulación positiva de las enzimas mitocondriales glutaminasa (GLS) y glutamina piruvato transaminasa 2 (GPT2) (Figura 3, A y C). Cabe destacar que la regulación positiva de GLS se limita a la isoforma empalmada glutaminasa C (GLS-GAC) (el cambio de Mfn2cKO/CTRL es aproximadamente 4,5 veces, P = 0,05), y su regulación positiva específica en tejidos cancerosos puede sustentar la bioenergía mitocondrial. (27).
(A) El mapa de calor muestra el cambio de pliegue en el nivel de proteína para la ruta especificada a las 8 semanas. (B) Ejemplo de una sección cerebelosa marcada con anticuerpo anti-PCx (barra de escala, 20 μm). La flecha amarilla apunta al cuerpo de la célula de Purkinje. (C) Análisis de la expresión de proteínas en el curso del tiempo identificado como un candidato importante para la aterosclerosis (prueba t múltiple, *FDR <5%; n = 3-5 ratones). (D) Arriba: Un diagrama esquemático que muestra las diferentes formas de ingresar al carbono marcado contenido en el trazador [1-13C]piruvato (es decir, a través de PDH o ruta transarterial). Abajo: El gráfico de violín muestra el porcentaje de carbono marcado individualmente (M1) convertido en ácido aspártico, ácido cítrico y ácido málico después de marcar secciones cerebelosas agudas con [1-13C]piruvato (prueba t pareada; ** P <0,01). (E) Análisis completo del historial temporal de la ruta indicada. Solo se consideran las proteínas con P<0,05 a las 8 semanas. Línea discontinua: sin ajuste (análisis de varianza bidireccional; * P <0,05; *** P <0,001). Los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM).
En nuestro análisis, el catabolismo de BCAA se ha convertido en una de las vías de regulación positiva clave. Este hecho sugiere fuertemente que el volumen de ventilación que ingresa al ciclo de TCA puede cambiar en PN que carecen de OXPHOS. Esto puede representar una forma importante de reconfiguración metabólica neuronal, que puede tener un impacto directo en la fisiología neuronal y la supervivencia durante el mantenimiento de una disfunción grave de OXPHOS. De acuerdo con esta hipótesis, encontramos que la principal enzima antiaterosclerótica PCx está regulada positivamente (Mfn2cKO/CTRL cambia aproximadamente 1,5 veces; Figura 3A), que cataliza la conversión de piruvato a oxalacetato (28), que se cree que está en el tejido cerebral La expresión en está restringida a los astrocitos (29, 30). De acuerdo con los resultados de proteómica, la microscopía confocal mostró que la expresión de PCx estaba específica y significativamente aumentada en PN deficientes en OXPHOS, mientras que la reactividad de PCx estaba principalmente restringida a las células gliales de Bergmann adyacentes del control (Figura 3B). Para probar funcionalmente la regulación positiva observada de PCx, tratamos cortes cerebelosos agudos con el trazador [1-13C]piruvato. Cuando el piruvato fue oxidado por la piruvato deshidrogenasa (PDH), su marca isotópica desapareció, pero se incorpora a los intermediarios del ciclo de Krebs cuando el piruvato es metabolizado por reacciones vasculares (Figura 3D). En apoyo de nuestros datos proteómicos, observamos una gran cantidad de marcadores de este trazador en el ácido aspártico de los cortes Mfn2cKO, mientras que el ácido cítrico y el ácido málico también mostraron una tendencia moderada, aunque no significativa (Figura 3D).
En las neuronas dopaminérgicas de ratones MitoPark con disfunción mitocondrial causada por la destrucción específica de las neuronas dopaminérgicas del gen del factor de transcripción mitocondrial A (Tfam) (Figura S6B), la expresión de PCx también se reguló positivamente de manera significativa (31), lo que indica que la arteriosclerosis ácida acetona La aparición de la enfermedad está regulada durante la disfunción de la OXPHOS neuronal en el cuerpo. Vale la pena señalar que se ha encontrado que enzimas únicas (32-34) que pueden expresarse en neuronas que pueden estar asociadas con la arteriosclerosis se regulan positivamente de manera significativa en PN que carecen de OXPHOS, como la propionil-CoA carboxilasa (PCC-A), Malonil-CoA convierte propionil-CoA en succinil-CoA y la enzima málica mitocondrial 3 (ME3), cuyo papel principal es recuperar piruvato del malato (Figura 3, A y C) (33, 35). Además, encontramos un aumento significativo en la enzima Pdk3, que fosforila y por lo tanto inactiva la PDH (36), mientras que no se detectaron cambios en la enzima Pdp1 que activa la PDH o el complejo enzimático PDH en sí (Figura 3A). De manera consistente, en las PN Mern2cKO, la fosforilación de la subunidad α1 (PDHE1α) de la subunidad E1 de la piruvato deshidrogenasa del complejo PDH en Ser293 (conocida por inhibir la actividad enzimática de la PDH) se incrementó (Figura S6C) (Figura S6C). El piruvato no tiene acceso vascular.
Finalmente, encontramos que la vía principal de biosíntesis de serina y glicina, el ciclo mitocondrial de folato (1C) relacionado y la biosíntesis de prolina (Figura 1G y Figura S5C) están significativamente regulados positivamente, según informes, durante el proceso de activación. Los tejidos circundantes se activan con disfunción mitocondrial (5-7). El análisis confocal que respalda estos datos proteómicos mostró que en PN con ausencia de OXPHOS, cortes cerebelosos de ratones de 8 semanas de edad fueron sometidos a serina hidroximetiltransferasa 2 (SHMT2), una enzima clave del ciclo mitocondrial de folato. Respuesta inmune significativa (Figura S5D). En 13 cortes cerebelosos agudos incubados con CU-glucosa, los experimentos de rastreo metabólico confirmaron aún más la regulación positiva de la biosíntesis de serina y prolina, lo que indica que el flujo de isoformas de carbono hacia serina y prolina aumentó (Figura S5E). Dado que las reacciones promovidas por GLS y GPT2 son responsables de la síntesis de glutamato a partir de glutamina y la transaminación entre glutamato y α-cetoglutarato, su regulación positiva indica que las neuronas deficientes en OXPHOS tienen una mayor demanda de glutamato. Esto puede estar dirigido a mantener la mayor biosíntesis de prolina (Figura S5C). En contraste con estos cambios, un análisis proteómico de astrocitos cerebelosos de ratones Mfn2cKO específicos de PN mostró que estas vías (incluidas todas las antiperoxidasas) no cambiaron significativamente en su expresión, lo que demuestra que esta redirección metabólica es selectiva para PN degradado (Fig. S6, D a G).
En resumen, estos análisis revelaron patrones significativamente diferentes de activación temporal de vías metabólicas específicas en las PN. Aunque la función mitocondrial neuronal anormal puede conducir a aterosclerosis temprana y remodelación 1C (Figura 3E y Figura S5C), e incluso cambios predecibles en la expresión de los complejos I y IV, los cambios en la síntesis de novo de serina solo se hicieron evidentes en las etapas tardías. Disfunción de OXPHOS (Figura 3E y Figura S5C). Estos hallazgos definen un proceso secuencial en el que la respuesta mitocondrial (ciclo 1C) y citoplasmática (biosíntesis de serina) inducida por estrés actúa sinérgicamente con el aumento de la aterosclerosis en el ciclo de Krebs para remodelar el metabolismo neuronal.
Las neuronas PN deficientes en OXPHOS de 8 semanas de edad pueden mantener una actividad de excitación de alta frecuencia y experimentar una reconexión metabólica significativa para compensar la disfunción mitocondrial. Este descubrimiento plantea una posibilidad interesante: que incluso en este momento, estas células también puedan recibir una intervención terapéutica para retrasar o prevenir la neurodegeneración. Tardíamente. Resolvimos esta posibilidad a través de dos intervenciones independientes. En el primer método, diseñamos un vector de virus adenoasociado (AAV) dependiente de Cre para que MFN2 pueda expresarse selectivamente en neuronas PN deficientes en OXPHOS in vivo (Figura S7A). El AAV que codifica MFN2 y el gen reportero fluorescente mCherry (Mfn2-AAV) se verificaron en cultivos de neuronas primarias in vitro, lo que provocó que MFN2 se expresara de manera dependiente de Cre y rescató la morfología mitocondrial, previniendo así la neuromutación en neuronas Mfn2cKO (Figura S7, B, D y E). A continuación, realizamos experimentos in vivo para administrar estereotácticamente Mfn2-AAV de 8 semanas de edad a la corteza cerebelosa de ratones Mfn2cKO y de control, y analizamos ratones de 12 semanas de edad (Figura 4A). Los ratones Mfn2cKO tratados murieron (Figura 1, A y B) (16). La transducción viral in vivo resultó en la expresión selectiva de PN en algunos círculos cerebelosos (Figura S7, G y H). La inyección del AAV de control que expresa solo mCherry (Ctrl-AAV) no tuvo un efecto significativo en el grado de neurodegeneración en los animales Mfn2cKO. Por el contrario, el análisis de los Mfn2cKO transducidos con Mfn2-AAV mostró un efecto protector significativo de la capa de células PN (Figura 4, B y C). En particular, la densidad neuronal parece ser casi indistinguible de la de los animales de control (Figura 4, B y C, y Figura S7, H e I). La expresión de MFN1, pero no de MFN2, es igualmente eficaz para evitar la muerte neuronal (Figura 4C y Figura S7, C y F), lo que indica que la expresión de MFN1 ectópica puede suplir eficazmente la falta de MFN2. Un análisis posterior a nivel de PN individual mostró que Mfn2-AAV rescató en gran medida la ultraestructura de las mitocondrias, normalizó los niveles de ADNmt y revirtió la alta expresión del marcador antiangiogénico PCx (Figura 4, C a E). La inspección visual de los ratones Mfn2cKO rescatados en estado de reposo mostró que su postura y síntomas motores (movimiento S1 a S3) mejoraron. En conclusión, estos experimentos muestran que la reintroducción tardía de MFN2 en PN con deficiencia grave de OXPHOS es suficiente para revertir el consumo de ADNmt e inducir aterosclerosis, previniendo así la degeneración axonal y la muerte neuronal in vivo.
(A) Esquema que muestra el cronograma experimental para la inyección de AAV que codifica MFN2 cuando se activa la vía metabólica indicada. (B) Imágenes confocales representativas de cortes cerebelosos de 12 semanas de edad transducidos a las 8 semanas en ratones Mfn2cKO y marcados con anticuerpo anti-Calbindina. Derecha: Escalado de fibras axónicas. La escala del zoom del axón es de 450 y 75 μm. (C) Izquierda: Cuantificación de la densidad de células de Purkinje en el bucle de transducción de AAV (AAV+) (análisis de varianza unidireccional; n = 3 ratones). Derecha: Análisis del foco de ADNmt en PN transducidos en la semana 12 (prueba t no pareada; n = 6 células de tres ratones). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Micrografías electrónicas de transmisión representativas de PN de secciones cerebelosas Mfn2cKO transducidas con los vectores virales indicados. La máscara rosa ilustra el área ocupada por las dendritas, y el cuadrado amarillo punteado ilustra el zoom proporcionado a la derecha; n representa el núcleo. Barra de escala: 1 μm. (E) muestra un ejemplo de tinción de PCx en PN transducido a las 12 semanas. Barra de escala: 20 μm. OE: sobreexpresión; FC: cambio de pliegue.
Finalmente, investigamos la importancia de la supervivencia celular inducida por peroxidasa en PN que han experimentado disfunción de OXPHOS. Generamos AAV-shRNA (ARN de horquilla corta) que codifica mCherry dirigido específicamente al ARNm de PCx de ratón (AAV-shPCx), e inyectamos el virus o su control aleatorio (AAV-scr) en el cerebelo de ratones Mfn2cKO. La inyección se realizó en la cuarta semana de edad (Figura 5A) para lograr una supresión efectiva de PCx durante el período en que la expresión de PCx aumentó (Figura 3C) y la capa de células PN aún estaba intacta (Figura 1A). Cabe destacar que la supresión de PCx (Figura S8A) conduce a una aceleración significativa de la muerte de PN, que se limita al anillo infectado (Figura 5, B y C). Para comprender el mecanismo de los efectos metabólicos inducidos por la regulación positiva de PCx, estudiamos el estado redox de las PN después de la inhibición de PCx y la expresión simultánea del biosensor óptico mediado por AAV Grx1-roGFP2 (Figura S8, B a D) para evaluar el cambio relativo del potencial redox del péptido glutatión (38). Luego, realizamos microscopía de imágenes de tiempo de vida de fluorescencia de dos fotones (FLIM) en cortes cerebrales agudos de Mfn2cKO de 7 semanas de edad o hermanos de camada de control para detectar posibles cambios en el estado redox citoplasmático después de verificar las condiciones de FLIM (Figura S8, E a G). El análisis mostró un aumento significativo en el estado de oxidación de una sola PN Mfn2cKO que carece de expresión de PCx, que es diferente de las neuronas de control o las PN Mfn2cKO que expresan solo shRNA aleatorio (Figura 5, D y E). Cuando se redujo la expresión de PCx, el porcentaje de neuronas PN Mfn2cKO que mostraban un estado altamente oxidado aumentó en más del triple (Figura 5E), lo que indica que la regulación positiva de PCx mantuvo la capacidad redox de las neuronas degeneradas.
(A) Esquema que muestra el cronograma experimental para inyectar AAV que codifica shPCx cuando se activa la vía metabólica indicada. (B) Fotografías confocales representativas de secciones cerebelosas de ratones Mfn2cKO de 8 semanas de edad transducidos y marcados con anticuerpo anticalcineurina a las 4 semanas. Barra de escala, 450 μm. (C) Cuantificación de la densidad de células de Purkinje en bucles transducidos con AAV (análisis de varianza unidireccional; n = 3 a 4 ratones). Los datos se expresan como media ± SEM; ***P < 0,001. (D) Imagen FLIM representativa que muestra la vida útil promedio de PN de 7 semanas de edad que expresan el sensor redox de glutatión Grx1-roGFP2 bajo las condiciones experimentales especificadas. Relación LUT (tabla de búsqueda): intervalo de tiempo de supervivencia (en picosegundos). Barra de escala, 25 μm. (E) El histograma muestra la distribución de los valores de vida útil de Grx1-roGFP2 de (D) (n=158 a 368 células en dos ratones bajo cada condición). El gráfico circular sobre cada histograma muestra el número de células con valores de vida útil significativamente más largos (rojo, oxidado) o más cortos (azul, reducido), que superan 1 DE del valor de vida útil promedio en CTRL-AAV-scr. (F) El modelo propuesto muestra el efecto protector de la regulación positiva de PCx neuronal.
En resumen, los datos que presentamos aquí demuestran que la reexpresión de MFN2 puede rescatar completamente la neuropatía periférica avanzada con deficiencia grave de OXPHOS, agotamiento severo de ADN mitocondrial y morfología extremadamente anormal similar a la de la isoforma ista, lo que permite un progreso continuo incluso en enfermedades avanzadas. La neurodegeneración proporciona evidencia reversible de la etapa previa a la muerte celular. Este grado de flexibilidad metabólica se ve reforzado por la capacidad de las neuronas para inducir aterosclerosis (una reorganización del ciclo de Krebs), que inhibe la expresión de PCx en las neuronas periféricas que carecen de OXPHOS y aumenta la muerte celular, desempeñando así un papel protector (Figura 5F).
En este estudio, proporcionamos evidencia de que la respuesta de las PN a la disfunción de OXPHOS es converger gradualmente hacia la aterosclerosis del ciclo de TCA a través de la vía de activación diferencial activada por programas metabólicos. Confirmamos el análisis proteómico con muchos métodos complementarios y revelamos que cuando se enfrentan a una disfunción mitocondrial severa, las neuronas tienen una forma previamente desconocida de elasticidad metabólica. Para nuestra sorpresa, todo el proceso de reconfiguración no necesariamente marca el estado metabólico terminal que acompaña a la neurodegeneración de forma gradual e irreversible, sino que nuestros datos sugieren que puede constituir un mecanismo de compensación funcional de mantenimiento neuronal incluso en la etapa previa a la muerte celular. Este hallazgo indica que las neuronas tienen un grado considerable de plasticidad metabólica en el cuerpo. Este hecho prueba que la posterior reintroducción de MFN2 puede revertir la expresión de marcadores metabólicos clave y prevenir la degeneración de las PN. Por el contrario, inhibe la aterosclerosis y acelera la neurodegeneración.
Uno de los hallazgos más fascinantes de nuestra investigación es que las PN que carecen de OXPHOS pueden modificar el metabolismo del ciclo de TCA al regular positivamente enzimas que estimulan específicamente la arteriosclerosis. El reordenamiento metabólico es una característica común de las células cancerosas, algunas de las cuales dependen de la glutamina para complementar los intermediarios del ciclo de TCA para producir equivalentes reductores, que impulsan la cadena respiratoria y mantienen la producción de precursores de la biosíntesis de lípidos y nucleótidos (39, 40). Un estudio reciente mostró que en los tejidos periféricos que experimentan disfunción de OXPHOS, la reconexión del metabolismo de glutamina/glutamato también es una característica prominente (5, 41), donde la dirección de la entrada de glutamina en el ciclo de TCA depende de Debido a la gravedad de la lesión de OXPHOS (41). Sin embargo, hay una falta de evidencia clara sobre cualquier similitud de la plasticidad metabólica neuronal en el cuerpo y su posible relevancia en el contexto de la enfermedad. En un estudio in vitro reciente, se demostró que las neuronas corticales primarias movilizan reservas de glutamato para la neurotransmisión, promoviendo así el metabolismo oxidativo y la aterosclerosis en condiciones de estrés metabólico (42). Cabe destacar que, bajo la inhibición farmacológica de la enzima succinato deshidrogenasa del ciclo de Krebs, se cree que la carboxilación del piruvato mantiene la síntesis de oxalacetato en neuronas granulares cerebelosas cultivadas (34). Sin embargo, la relevancia fisiológica de estos mecanismos para el tejido cerebral (donde se cree que la aterosclerosis se limita principalmente a los astrocitos) sigue teniendo una importancia fisiológica significativa (43). En este caso, nuestros datos muestran que las PN dañadas por la fosforilación oxidativa en el cuerpo pueden cambiar a la degradación de BCAA y la carboxilación del piruvato, que son las dos principales fuentes de suplementación de intermediarios de la reserva de Krebs. Aunque se ha propuesto la contribución putativa del catabolismo de BCAA al metabolismo energético neuronal, además del papel del glutamato y GABA para la neurotransmisión (44), todavía no hay evidencia de estos mecanismos in vivo. Por lo tanto, es fácil especular que las PN disfuncionales pueden compensar automáticamente el consumo de intermediarios de TCA impulsado por el proceso de asimilación al aumentar la aterosclerosis. En particular, la regulación positiva de PCx puede ser necesaria para mantener una mayor demanda de ácido aspártico, lo que se sugiere en células proliferantes con disfunción mitocondrial (45). Sin embargo, nuestro análisis metabolómico no reveló ningún cambio significativo en el nivel de estado estacionario de ácido aspártico en las PN Mfn2cKO (Figura S6A), lo que presumiblemente refleja la diferente utilización metabólica del ácido aspártico entre las células proliferantes y las neuronas postmitóticas. Aunque el mecanismo exacto de la regulación positiva de PCx en neuronas disfuncionales in vivo aún no se ha caracterizado, demostramos que esta respuesta prematura juega un papel importante en el mantenimiento del estado redox de las neuronas, lo cual se demostró en experimentos FLIM en cortes cerebelosos. En particular, impedir que las PN regulen positivamente PCx puede conducir a un estado más oxidado y acelerar la muerte celular. La activación de la degradación de BCAA y la carboxilación del piruvato no son formas de caracterizar los tejidos periféricos de la disfunción mitocondrial (7). Por lo tanto, parecen ser una característica prioritaria de las neuronas deficientes en OXPHOS, aunque no la única característica, que es importante para la neurodegeneración.
La enfermedad cerebelosa es un tipo heterogéneo de enfermedad neurodegenerativa que generalmente se manifiesta como ataxia y a menudo daña las PN (46). Esta población neuronal es particularmente vulnerable a la disfunción mitocondrial porque su degeneración selectiva en ratones es suficiente para reproducir muchos de los síntomas motores que caracterizan la ataxia espinocerebelosa humana (16, 47, 48). Según informes, un modelo de ratón transgénico con un gen mutante está asociado con la ataxia espinocerebelosa humana y tiene disfunción mitocondrial (49, 50), lo que enfatiza la importancia de estudiar las consecuencias de la deficiencia de OXPHOS en la PNPH. Por lo tanto, es particularmente adecuado para aislar y estudiar eficazmente esta población neuronal única. Sin embargo, dado que las PN son muy sensibles a la presión y representan una baja proporción de la población celular cerebelosa total, para muchos estudios basados ​​en ómicas, la separación selectiva de ellas como células completas sigue siendo un aspecto desafiante. Aunque es casi imposible lograr una ausencia absoluta de contaminación de otros tipos de células (especialmente tejidos adultos), combinamos un paso de disociación eficaz con FACS para obtener un número suficiente de neuronas viables para el análisis proteómico posterior, y tenemos una cobertura de proteínas bastante alta (alrededor de 3000 proteínas) en comparación con el conjunto de datos existente del cerebelo completo (51). Al preservar la viabilidad de las células completas, el método que proporcionamos aquí nos permite no solo verificar los cambios en las vías metabólicas en las mitocondrias, sino también verificar los cambios en sus contrapartes citoplasmáticas, lo que complementa el uso de marcadores de membrana mitocondrial para enriquecer el tipo celular El nuevo método para el número de mitocondrias en tejidos complejos (52, 53). El método que describimos no solo está relacionado con el estudio de las células de Purkinje, sino que puede aplicarse fácilmente a cualquier tipo de célula para abordar los cambios metabólicos en cerebros enfermos, incluidos otros modelos de disfunción mitocondrial.
Finalmente, hemos identificado una ventana terapéutica durante este proceso de reorganización metabólica que puede revertir por completo los signos clave de estrés celular y prevenir la degeneración neuronal. Por lo tanto, comprender las implicaciones funcionales de la reorganización descrita aquí podría brindar información fundamental para posibles tratamientos que permitan mantener la viabilidad neuronal durante la disfunción mitocondrial. Se necesitan futuras investigaciones dirigidas a analizar los cambios en el metabolismo energético en otros tipos de células cerebrales para revelar plenamente la aplicabilidad de este principio a otras enfermedades neurológicas.
Los ratones MitoPark se han descrito previamente (31). Los ratones C57BL/6N con genes Mfn2 flanqueados por loxP se han descrito previamente (18) y se cruzaron con ratones L7-Cre (23). La progenie doble heterocigota resultante se cruzó con ratones Mfn2loxP/Mfn2loxP homocigotos para generar knockouts génicos específicos de Purkinje para Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). En un subconjunto de apareamientos, el alelo Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) se introdujo mediante cruces adicionales (20). Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices europeas, nacionales e institucionales y fueron aprobados por LandesamtfürNatur de Umwelt y Verbraucherschutz, Renania del Norte-Westfalia, Alemania. El trabajo con animales también sigue las directrices de la Federación Europea de Asociaciones de Ciencias de Animales de Laboratorio.
Después de anestesiar la dislocación cervical de la mujer embarazada, se aísla el embrión de ratón (E13). La corteza se disecó en solución salina balanceada de Hanks (HBSS) suplementada con 10 mM de Hepes y se pasó a medio de Eagle modificado de Dulbecco que contenía papaína (20 U/ml) y cisteína (1 μg/ml). Incubar el tejido en DMEM) y disociarlo por digestión enzimática. Ml) a 37 °C durante 20 minutos, y luego moler mecánicamente en DMEM suplementado con 10 % de suero fetal bovino. Las células se sembraron en cubreobjetos de vidrio recubiertos con polilisina a una densidad de 2 × 10⁶ por placa de cultivo de 6 cm o a una densidad de 0,5 × 10⁵ células/cm² para análisis de imágenes. Después de 4 horas, el medio se reemplazó con medio Neurobasal sin suero que contenía 1 % de suplemento B27 y 0,5 mM de GlutaMax. Las neuronas se mantuvieron a 37 °C y 5 % de CO2 durante todo el experimento y se alimentaron una vez por semana. Para inducir la recombinación in vitro, se utilizaron 3 μl (placa de cultivo de 24 pocillos) o 0,5 μl (placa de 24 pocillos) del siguiente vector viral AAV9 para tratar las neuronas el segundo día in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, número de catálogo 105530-AAV9) y AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, número de catálogo 105545-AAV9).
El ADN complementario de Mfn1 y Mfn2 de ratón (obtenido de los plásmidos Addgene n.° 23212 y n.° 23213, respectivamente) está marcado con la secuencia V5 (GKPIPNPLLGLDST) en el extremo C-terminal y se fusiona con mCherry en fase a través de la secuencia T2A. Grx1-roGFP2 es un obsequio del Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Al reemplazar el casete tdTomato mediante métodos de clonación convencionales, el casete se subclonó en el vector pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (número de referencia Addgene 28306) para generar los vectores pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 y pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Se utilizó una estrategia similar para generar el vector de control pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Para generar el constructo AAV-shPCx, se requiere un vector AAV plasmídico (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), que contiene la secuencia de ADN que codifica el shRNA dirigido a PCx de ratón (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) bajo el control del promotor U6, y mCherry bajo el control del promotor CMV. La producción de vectores AAV auxiliares se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante (Cell Biolabs). En resumen, utilice un plásmido de transferencia que contenga mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) para la transfección transitoria de células 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) o Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) y el plásmido de empaquetamiento de proteínas accesorias, utilizando el método de fosfato de calcio. El sobrenadante del virus crudo se obtuvo mediante ciclos de congelación-descongelación en un baño de hielo seco/etanol y las células lisadas en solución salina tamponada con fosfato (PBS). El vector AAV se purificó mediante ultracentrifugación en gradiente discontinuo de iodixanol (24 horas a 32.000 rpm y 4 °C) y se concentró utilizando un filtro centrífugo Amicon ultra-15. El título genómico de AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9 × 10¹³ copias genómicas (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 10¹² GC/ml), AAV1-CAG-FLEX se midió como se describió previamente (54) mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) -MFN1-V5 (1,9 × 10¹³ GC/ml) y AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 10¹² GC/ml).
Las neuronas primarias se rasparon en PBS 1x helado, se centrifugaron y luego se homogeneizaron en tampón de lisis de PBS con 0,5 % de Triton X-100 / 0,5 % de desoxicolato de sodio que contenía inhibidor de fosfatasa y proteasa (Roche). La cuantificación de proteínas se realizó utilizando el ensayo de ácido bicinchonínico (Thermo Fisher Scientific). Luego las proteínas se separaron por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y luego se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (GE Healthcare). Bloquear los sitios no específicos e incubar con el anticuerpo primario (ver Tabla S1 para más detalles) en leche al 5 % en TBST (solución salina tamponada con Tris y Tween), pasos de lavado y anticuerpo secundario en TBST Incubar. Incubar con el anticuerpo primario durante la noche a +4 °C. Después del lavado, aplicar el anticuerpo secundario durante 2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, al incubar la misma membrana con un anticuerpo anti-β-actina, se confirmó la misma carga. Detección mediante conversión a quimioluminiscencia y mejora de la quimioluminiscencia (GE Healthcare).
Las neuronas previamente sembradas en cubreobjetos de vidrio se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS en el punto de tiempo especificado a temperatura ambiente durante 10 minutos. Los cubreobjetos se permeabilizaron primero con Triton X-100 al 0,1% en PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente, y luego en tampón de bloqueo [albúmina de suero bovino (BSA) al 3% en PBS]. Al segundo día, los cubreobjetos se lavaron con tampón de bloqueo y se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado durante 2 horas a temperatura ambiente; finalmente, las muestras se lavaron a fondo en PBS con 4′,6-diamidino-2′-fenilindol (DAPI) se contratiñeron y luego se fijaron en el portaobjetos con Aqua-Poly/Mount.
Se anestesiaron ratones (machos y hembras) mediante inyección intraperitoneal de ketamina (130 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg), y se les administró carprofeno analgésico (5 mg/kg) por vía subcutánea. Posteriormente, se colocaron en un instrumento estereotáctico (Kopf) equipado con una almohadilla térmica. Se expuso el cráneo y se utilizó un taladro dental para adelgazar la parte de la corteza cerebelosa correspondiente al hueso ilíaco (desde lambda: cola 1.8, lateral 1, correspondiente a los lóbulos IV y V). Con una aguja de jeringa curva, se creó cuidadosamente un pequeño orificio en el cráneo para evitar dañar la vasculatura subyacente. Luego, el capilar de vidrio delgado estirado se inserta lentamente en el microorificio (de -1.3 a -1 en el lado ventral de la duramadre), y se inyectan de 200 a 300 nl de AAV en el microinyector (Narishige) con jeringas manuales (Narishige) varias veces a baja presión durante un período de tiempo de 10 a 20 minutos. Después de la infusión, se coloca el capilar durante otros 10 minutos para permitir que el virus se propague completamente. Después de retirar los capilares, la piel se sutura cuidadosamente para minimizar la inflamación de la herida y permitir que el animal se recupere. Los animales fueron tratados con analgésicos (caspofeno) durante varios días después de la operación, tiempo durante el cual se monitorizó cuidadosamente su estado físico y luego se les practicó la eutanasia en el momento indicado. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices europeas, nacionales e institucionales y fueron aprobados por LandesamtfürNatur de Umwelt y Verbraucherschutz, Renania del Norte-Westfalia, Alemania.
Los animales fueron anestesiados con ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg), y el corazón fue perfundido primero con PBS 0,1 M, y luego con PFA al 4% en PBS. El tejido fue disecado y fijado en PFA al 4%/PBS durante la noche a 4 °C. Se utilizó un bisturí vibratorio (Leica Microsystems GmbH, Viena, Austria) para preparar secciones sagitales (50 μm de espesor) del cerebro fijado en PBS. A menos que se especifique lo contrario, la tinción de las secciones flotantes se realizó como se describió anteriormente (13) a temperatura ambiente y agitación. En resumen, primero, las secciones obtenidas fueron permeabilizadas con Triton X-100 al 0,5%/PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente; para algunos epítopos (Pcx y Shmt2), en tampón tris-EDTA a 80 °C (pH 9) calentar las secciones durante 25 minutos en lugar de este paso. A continuación, las secciones se incubaron con el anticuerpo primario (véase la Tabla S1) en tampón de bloqueo (BSA al 3 % en PBS) a 4 °C durante toda la noche con agitación. Al día siguiente, las secciones se lavaron con tampón de bloqueo y se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado durante 2 horas a temperatura ambiente; finalmente, las secciones se lavaron a fondo con PBS, se contratiñeron con DAPI y se fijaron con AquaPolymount en un portaobjetos de microscopio.
Se utilizó un microscopio confocal de barrido láser (TCS SP8-X o TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) equipado con un láser de luz blanca y un láser ultravioleta de diodo de 405 para obtener imágenes de la muestra. Al excitar el fluoróforo y recoger la señal con el detector híbrido (HyDs), se utilizó el software LAS-X para recoger imágenes apiladas conforme al muestreo de Nyquist en modo secuencial: para paneles no cuantitativos, se utilizan señales altamente dinámicas (por ejemplo, en células somáticas y dendritas) mtYFP) Utilice HyD para detectar el número de PN en modo BrightR). Se aplica una puerta de 0,3 a 6 ns para reducir el fondo.
Imágenes en tiempo real de células clasificadas. Tras la clasificación en medio Neurobasal-A con un 1 % de suplemento B27 y 0,5 mM de GlutaMax, las células se sembraron inmediatamente en portaobjetos de vidrio recubiertos con poli-L-lisina (μ-Slide8 Well, Ibidi, número de catálogo 80826) y se mantuvieron a 37 °C y 5 % de CO2 durante 1 hora para permitir la sedimentación celular. Las imágenes en tiempo real se obtuvieron con un microscopio confocal de barrido láser Leica SP8 equipado con un láser blanco, HyD, objetivo de inmersión en aceite de 63× [1,4 de apertura numérica (NA)] y platina calefactora.
El ratón fue anestesiado rápidamente con dióxido de carbono y decapitado, el cerebro fue extraído rápidamente del cráneo y cortado en una sección sagital de 200 μm de espesor (para el experimento de marcaje con 13C) o de 275 μm de espesor (para experimentos de dos fotones) rellena con los siguientes materiales. El helado (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemania) está relleno con las siguientes sustancias: 125 mM de líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) frío, saturado de carbono (95 % O2 y 5 % CO2) con bajo contenido de Ca2+, NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampón de fosfato de sodio, 25 mM NaHCO3, 25 mM glucosa, 0,5 mM CaCl2 y 3,5 mM MgCl2 (presión osmótica de 310 a 330 mmol). Transfiera las rebanadas de cerebro obtenidas a una cámara de preincubación que contenga un medio ACSF con mayor concentración de Ca2+ (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampón de fosfato de sodio, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosa, 1,0 mM CaCl2 y 2,0 mM MgCl2) pH 7,4 y de 310 a 320 mmol).
Durante el proceso de obtención de imágenes, las secciones se trasladaron a una sala de imágenes dedicada y el experimento se realizó bajo perfusión continua de ACSF a una temperatura constante de 32° a 33°C. Para la obtención de imágenes de las secciones se utilizó un microscopio de escaneo láser multifotónico (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) equipado con un objetivo Leica de 25x (NA 0,95, agua) y un láser de Ti:Zafiro (Chameleon Vision II, Coherent). Módulo FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM de Grx1-roGFP2. Los cambios en el estado redox citoplasmático de las PN se midieron mediante FLIM de dos fotones en cortes sagitales del cerebro, donde el biosensor Grx1-roGFP2 se dirigió a las PN. En la capa de PN, el campo de adquisición se seleccionó aproximadamente de 50 a 80 μm por debajo de la superficie del corte para asegurar que haya una PN viable (es decir, la ausencia de estructura perlada o cambios morfológicos neuronales a lo largo de las dendritas) y el sensor roGFP2 doble positivo y AAV que codifica shRNA PCx o su secuencia de control (cada uno coexpresando mCherry). Recopile imágenes de pila única con zoom digital 2x [longitud de onda de excitación: 890 nm; 512 nm 512 píxeles]. Detección: HyD interno, grupo de filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC) y promediado de imágenes en 2 a 3 minutos para asegurar que se recolecten suficientes fotones (1000 fotones en total) para el ajuste de curvas. La sensibilidad de la sonda Grx1-roGFP2 y la verificación de las condiciones FLIM se realizaron monitoreando el valor de vida útil de roGFP2 cuando se agregaba H2O2 exógeno 10 mM a la ACSF de perfusión (para maximizar la oxidación, lo que resulta en una vida útil aumentada), y luego se agregaba ditiotreitol 2 mM (minimiza el grado de reducción, lo que resulta en una disminución de la vida útil) (Figura S8, D a G). Utilice el software FLIMfit 5.1.1 para analizar los resultados adquiridos, ajuste la curva de decaimiento exponencial simple de toda la imagen a la IRF (función de respuesta del instrumento) medida, y χ2 es aproximadamente 1. Para calcular la vida útil de un solo PN, se dibujó manualmente la máscara alrededor del cuerpo del nervio, y se utilizó la vida útil promedio en cada máscara para la cuantificación.
Análisis del potencial mitocondrial. Después de que la sección aguda se incubó con 100 nM de TMRM añadido directamente al ACSF perfundido durante 30 minutos, los cambios del potencial mitocondrial de las PN se midieron mediante un microscopio de dos fotones. La imagen de TMRM se realizó excitando la sonda a 920 nm y utilizando HyD interno (isotiocianato de tetrametilrodamina: 585/40 nm) para recoger las señales; utilizando la misma longitud de onda de excitación pero utilizando un HyD interno diferente (FITC: 525/50) para obtener imágenes de mtYFP. Utilice el complemento Calculadora de imágenes de ImageJ para evaluar el potencial mitocondrial a nivel de célula individual. En resumen, la ecuación del complemento: señal = min (mtYFP, TMRM) se utiliza para identificar la región mitocondrial que muestra la señal de TMRM en Purkinje Somali en la imagen confocal de pila única del canal correspondiente. A continuación, se cuantifica el área de píxeles en la máscara resultante y se normaliza con respecto a la imagen de pila única umbral correspondiente del canal mtYFP para obtener la fracción mitocondrial que muestra el potencial mitocondrial.
La imagen se desconvolucionó con el software Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Para las imágenes escaneadas de las baldosas, se realizó el montaje de una sola baldosa mediante el algoritmo de unión automática del software LAS-X. Tras la calibración de la imagen, se utilizaron ImageJ y Adobe Photoshop para procesarla y ajustar uniformemente el brillo y el contraste. Se empleó Adobe Illustrator para la preparación gráfica.
Análisis de focos de ADNmt. El número de lesiones de ADNmt se cuantificó en secciones cerebelosas marcadas con anticuerpos contra el ADN mediante microscopía confocal. Se creó un área objetivo para el cuerpo celular y el núcleo de cada célula, y el área correspondiente se calculó utilizando el complemento Multi Measure (software ImageJ). Se restó el área nuclear del área del cuerpo celular para obtener el área citoplasmática. Finalmente, se utilizó el complemento Analyze Particles (software ImageJ) para cuantificar automáticamente los puntos de ADN citoplasmático que indican ADNmt en la imagen umbral, y los resultados obtenidos se normalizaron con respecto al promedio de PN de ratones CTRL. Los resultados se expresan como el número promedio de nucleósidos por célula.
Análisis de la expresión proteica. Utilice el complemento Calculadora de imágenes de ImageJ para evaluar la expresión proteica en PN a nivel de célula individual. En resumen, en la imagen confocal de una sola capa del canal correspondiente, mediante la ecuación: señal = min (mtYFP, anticuerpo), se identifica la región mitocondrial que muestra inmunorreactividad a un anticuerpo específico en Purkina. A continuación, se cuantifica el área de píxeles en la máscara resultante y se normaliza con respecto a la imagen de pila única umbral correspondiente del canal mtYFP para obtener la fracción mitocondrial de la proteína mostrada.
Análisis de la densidad de células de Purkinje. Se utilizó el complemento Cell Counter de ImageJ para evaluar la densidad de células de Purkinje dividiendo el número de células de Purkinje contadas por la longitud del anillo cerebeloso ocupado por dichas células.
Preparación y recolección de muestras. Los cerebros del grupo control y de los ratones Mfn2cKO se fijaron en PFA al 2 %/glutaraldehído al 2,5 % en tampón fosfato (PB) 0,1 M, y luego se prepararon secciones coronales usando ciliatos (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Austria) (espesor de 50 a 60 μm). Luego se fijaron en tampón PB en os tetraóxido al 1 % y ferrocianuro de potasio al 1,5 % a temperatura ambiente durante 1 hora. Las secciones se lavaron tres veces con agua destilada y luego se tiñeron con etanol al 70 % que contenía acetato de uranilo al 1 % durante 20 minutos. Luego las secciones se deshidrataron en alcohol de concentración creciente y se incluyeron en resina epoxi Durcupan ACM (resina de fundición Araldite M) (Electron Microscopy Sciences, número de catálogo 14040) entre portaobjetos de vidrio recubiertos de silicona, y finalmente se polimerizaron en el horno a 60 °C durante 48 horas. Se seleccionó la corteza cerebelosa y se cortaron secciones ultrafinas de 50 nm con un Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Austria), que se colocaron en una rejilla de cobre de 2 × 1 mm recubierta con película de poliestireno. Las secciones se tiñeron con una solución de acetato de uranilo al 4 % en H₂O durante 10 minutos, se lavaron varias veces con H₂O, luego con citrato de plomo de Reynolds en H₂O durante 10 minutos y, finalmente, se lavaron varias veces con H₂O. Las micrografías se obtuvieron con un microscopio electrónico de transmisión Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) utilizando una cámara digital TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, EE. UU., Alemania).
Para ratones infectados con AAV, el cerebro se separó y se cortó en una sección sagital de 1 mm de espesor, y el cerebelo se examinó utilizando un microscopio de fluorescencia para identificar el anillo infectado con AAV (es decir, que expresa mCherry). Solo se utilizan experimentos en los que la inyección de AAV resulta en una eficiencia de transducción muy alta de la capa de células de Purkinje (es decir, casi toda la capa) en al menos dos anillos cerebelosos consecutivos. El bucle transducido con AAV se microdiseccionó para postfijación durante la noche (PFA al 4% y glutaraldehído al 2,5% en tampón de cocoato 0,1 M) y se procesó posteriormente. Para la inclusión en EPON, el tejido fijado se lavó con tampón de cocoato de sodio 0,1 M (Applichem), y se incubó con OsO4 al 2% (os, Science Services; Caco) en tampón de cocoato de sodio 0,1 M (Applichem) durante 4 horas, luego se lavó durante 2 horas. Repetir 3 veces con tampón de cocamida 0,1 M. Posteriormente, se utilizó una serie ascendente de etanol para incubar cada solución de etanol a 4 °C durante 15 minutos para deshidratar el tejido. El tejido se transfirió a óxido de propileno y se incubó durante la noche en EPON (Sigma-Aldrich) a 4 °C. Coloque el tejido en EPON fresco a temperatura ambiente durante 2 horas y luego incorpórelo a 62 °C durante 72 horas. Utilice un ultramicrótomo (Leica Microsystems, UC6) y una cuchilla de diamante (Diatome, Biel, Suiza) para cortar secciones ultrafinas de 70 nm y tiña con acetato de uranilo al 1,5 % durante 15 minutos a 37 °C, y tiña con solución de citrato de plomo durante 4 minutos. Las micrografías electrónicas se tomaron utilizando un microscopio electrónico de transmisión JEM-2100 Plus (JEOL) equipado con una cámara OneView 4K de 16 bits (Gatan) y el software DigitalMicrograph (Gatan). Para el análisis, se obtuvieron micrografías electrónicas con un zoom digital de 5000× o 10 000×.
Análisis morfológico de las mitocondrias. Para todos los análisis, los contornos de las mitocondrias individuales se delinearon manualmente en imágenes digitales utilizando el software ImageJ. Se analizaron diferentes parámetros morfológicos. La densidad mitocondrial se expresa como un porcentaje obtenido al dividir el área mitocondrial total de cada célula por el área del citoplasma (área del citoplasma = área celular - área del núcleo celular) × 100. La redondez de las mitocondrias se calcula con la fórmula [4π∙(área/perímetro²)]. La morfología de las mitocondrias se analizó y se dividió en dos categorías (“tubular” y “ampolla”) según sus formas principales.
Análisis del número y la densidad de autofagosomas/lisosomas. Utilice el software ImageJ para delinear manualmente los contornos de cada autofagosoma/lisosoma en la imagen digital. El área de autofagosomas/lisosomas se expresa como un porcentaje calculado dividiendo el área total de la estructura de autofagosomas/lisosomas de cada célula por el área del citoplasma (área del citoplasma = área celular - área del núcleo) × 100. La densidad de autofagosomas/lisosomas se calcula dividiendo el número total por el número de estructuras de autofagosomas/lisosomas por célula (en términos de área citoplasmática) (área citoplasmática = área celular - área nuclear).
Etiquetado para cortes agudos y preparación de muestras. Para experimentos que requieren el etiquetado de glucosa, transfiera las rebanadas cerebrales agudas a una cámara de preincubación, que contiene carbono saturado (95% O2 y 5% CO2), alto Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampón de fosfato de sodio, 25,0 mM NaHCO 3, 25,0 mM d-glucosa, 1,0 mM CaCl 2 y 2,0 mM MgCl 2, ajustado a pH 7,4 y 310 a 320 mOsm), en el que la glucosa es 13 C 6- Sustitución de glucosa (Eurisotop, número de catálogo CLM-1396). Para experimentos que requieren marcaje con piruvato, transfiera las secciones cerebrales agudas a una solución ACSF con mayor concentración de Ca2+ (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampón de fosfato de sodio, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosa, 1,0 mM CaCl2 y agregue 2,0 mM MgCl2, ajuste a pH 7,4 y 310 a 320 mOsm), y agregue 1 mM de 1-[1-13C]piruvato (Eurisotop, número de catálogo CLM-1082). Incube las secciones durante 90 minutos a 37 °C. Al finalizar el experimento, las secciones se lavaron rápidamente con una solución acuosa (pH 7,4) que contenía 75 mM de carbonato de amonio y, a continuación, se homogeneizaron en una mezcla 40:40:20 (v/v) de acetonitrilo (ACN), metanol y agua. Tras incubar las secciones en hielo durante 30 minutos, las muestras se centrifugaron a 21 000 g durante 10 minutos a 4 °C y el sobrenadante transparente se secó en un concentrador SpeedVac. El precipitado de metabolitos seco resultante se almacenó a -80 °C hasta su análisis.
Análisis de 13 aminoácidos marcados con 13C mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas. Para el análisis mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), el precipitado de metabolitos se resuspendió en 75 μl de agua de grado LC-MS (Honeywell). Tras la centrifugación a 21 000 g durante 5 minutos a 4 °C, se utilizaron 20 μl del sobrenadante clarificado para el análisis del flujo de aminoácidos, mientras que el resto del extracto se utilizó inmediatamente para el análisis de aniones (véase más adelante). El análisis de aminoácidos se realizó utilizando el protocolo de derivatización con cloruro de benzoílo descrito previamente (55, 56). En el primer paso, se añadieron 10 μl de carbonato de sodio 100 mM (Sigma-Aldrich) a 20 μl del extracto de metabolitos, y luego se añadieron 10 μl de cloruro de benzoílo al 2 % (Sigma-Aldrich) al ACN de grado LC. La muestra se agitó brevemente en un vórtex y luego se centrifugó a 21.000 g durante 5 minutos a 20 °C. Transfiera el sobrenadante clarificado a un vial de automuestreador de 2 ml con un inserto de vidrio cónico (volumen de 200 μl). Las muestras se analizaron utilizando el sistema de LC de ultra alto rendimiento Acquity iClass (Waters) conectado al espectrómetro de masas de precisión de alta resolución Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Para el análisis, se inyectaron 2 μl de la muestra derivatizada en una columna de sílice T3 de alta resistencia de 100 × 1,0 mm (Waters) que contenía partículas de 1,8 μm. El caudal es de 100 μl/min, y el sistema de tampón consta de tampón A (formiato de amonio 10 mM y ácido fórmico al 0,15 % en agua) y tampón B (ACN). El gradiente es el siguiente: 0 % B a los 0 minutos; 0% B. 0 a 15% B de 0 a 0,1 minutos; 15 a 17% B de 0,1 a 0,5 minutos; B de 17 a 55% de 0,5 a 14 minutos; B de 55 a 70% de 14 a 14,5 minutos; de 14,5 a 70 a 100% B a los 18 minutos; 100% B de 18 a 19 minutos; 100 a 0% B de 19 a 19,1 minutos; 0% B de 19,1 a 28 minutos (55, 56). El espectrómetro de masas QE-HF opera en modo de ionización positiva con un rango de masas de m/z (relación masa/carga) de 50 a 750. La resolución aplicada es de 60 000, y el objetivo de iones de control de ganancia (AGC) obtenido es de 3 × 10⁶, y el tiempo máximo de ion es de 100 milisegundos. La fuente de ionización por electrospray calentada (ESI) opera a un voltaje de pulverización de 3,5 kV, una temperatura capilar de 250 °C, un flujo de aire de vaina de 60 AU (unidades arbitrarias) y un flujo de aire auxiliar de 20 AU. 250 °C. La lente S está ajustada a 60 AU.
Análisis de cromatografía de aniones-MS de ácidos orgánicos marcados con 13C. El precipitado de metabolito restante (55 μl) se analizó utilizando un sistema de cromatografía de iones Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) conectado a un espectrómetro de masas QE-HF (Thermo Fisher Scientific). En resumen, se inyectaron 5 μl de extracto de metabolito en una columna Dionex IonPac AS11-HC equipada con HPLC (2 mm × 250 mm, tamaño de partícula 4 μm, Thermo Fisher Scientific) en modo de bucle parcial push-in con una relación de llenado de 1. ) Columna de protección Dionex IonPac AG11-HC (2 mm × 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). La temperatura de la columna se mantiene a 30 °C y el automuestreador se ajusta a 6 °C. Utilice un cartucho de hidróxido de potasio provisto con agua desionizada para generar un gradiente de hidróxido de potasio a través del generador de eluyente. Separación de metabolitos a un caudal de 380 μl/min, aplicando el siguiente gradiente: de 0 a 3 minutos, 10 mM KOH; de 3 a 12 minutos, de 10 a 50 mM KOH; de 12 a 19 minutos, de 50 a 100 mM KOH; de 19 a 21 minutos, 100 mM KOH; de 21 a 21,5 minutos, de 100 a 10 mM KOH. La columna se reequilibró con 10 mM KOH durante 8,5 minutos.
Los metabolitos eluidos se combinan con una corriente suplementaria de isopropanol de 150 μl/min después de la columna y luego se dirigen a un espectrómetro de masas de alta resolución que opera en modo de ionización negativa. El espectrómetro de masas está monitoreando el rango de masas de m/z 50 a 750 con una resolución de 60 000. El control automático de ganancia (AGC) está configurado en 1 × 10⁶ y el tiempo máximo de ionización se mantiene en 100 ms. La fuente ESI calentada se operó a un voltaje de pulverización de 3,5 kV. Los demás ajustes de la fuente de iones son los siguientes: temperatura del capilar 275 °C; flujo de gas de envoltura, 60 AU; flujo de gas auxiliar, 20 AU a 300 °C, y ajuste de la lente S a 60 AU.
Análisis de datos de metabolitos marcados con 13C. Se utilizó el software TraceFinder (versión 4.2, Thermo Fisher Scientific) para el análisis de datos de la relación isotópica. La identidad de cada compuesto se verificó mediante un compuesto de referencia fiable y se analizó de forma independiente. Para realizar el análisis de enriquecimiento isotópico, se extrajo el área del cromatograma de iones extraídos (XIC) de cada isótopo de 13C (Mn) de [M + H] +, donde n es el número de carbonos del compuesto objetivo, utilizado para analizar aminoácidos o [MH] + utilizado para analizar aniones. La precisión de masa del XIC es inferior a cinco partes por millón, y la precisión del RT es de 0,05 minutos. El análisis de enriquecimiento se realiza calculando la relación de cada isótopo detectado con respecto a la suma de todos los isótopos del compuesto correspondiente. Estas relaciones se dan como valores porcentuales para cada isótopo, y los resultados se expresan como porcentaje molar de enriquecimiento (MPE), como se describió anteriormente (42).
El pellet de neuronas congeladas se homogeneizó en metanol al 80 % (v/v) helado, se agitó en vórtex y se incubó a -20 °C durante 30 minutos. Se agitó la muestra nuevamente en vórtex y se agitó a +4 °C durante 30 minutos. La muestra se centrifugó a 21 000 g durante 5 minutos a 4 °C, y luego el sobrenadante resultante se recolectó y secó usando un concentrador SpeedVac a 25 °C para su posterior análisis. Como se describió anteriormente, se realizó un análisis LC-MS en los aminoácidos de las células separadas. Usando TraceFinder (versión 4.2, Thermo Fisher Scientific), el análisis de datos se realizó usando la masa monoisotópica de cada compuesto. La normalización de cuantiles de los datos de metabolitos se realizó usando el paquete de software preprocessCore (57).
Preparación de cortes. El ratón fue anestesiado rápidamente con dióxido de carbono y decapitado, el cerebro fue extraído rápidamente del cráneo y se utilizó el cuchillo vibratorio lleno de hielo (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemania) para cortarlo en secciones sagitales de 300 a 375 μm. Gasificación de carbono frío (95 % O2 y 5 % CO2) Líquido ACSF bajo en Ca2+ (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampón de fosfato de sodio, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosa, 1,0 mM CaCl2 y 6,0 mM MgCl2 Ajustar a pH 7,4 y 310 a 330 mOsm). Transfiera las secciones cerebrales obtenidas a una cámara que contenga una solución ACSF con mayor concentración de Ca2+ (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampón de fosfato de sodio, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosa, 4,0 mM CaCl2 y 3,5 mM MgCl2) a pH 7,4 y una osmolaridad de 310 a 320 mOsm. Almacene las secciones durante 20 a 30 minutos para que puedan recuperarse antes de la grabación.
grabación. Se utilizó una platina de microscopio equipada con una cámara de grabación fija y un objetivo de inmersión en agua de 20x (Scientifica) para todas las grabaciones. Las presuntas células de Purkinje se identificaron por (i) tamaño corporal, (ii) ubicación anatómica del cerebelo y (iii) expresión del gen reportero fluorescente mtYFP. La micropipeta de parche con una resistencia de punta de 5 a 11 megaohmios se extrae mediante un capilar de vidrio de borosilicato (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Alemania) y una micropipeta horizontal (P-1000, Sutter, Novato, CA). Todas las grabaciones se realizaron con el amplificador de patch clamp ELC-03XS npi (npi electronic GmbH, Tam, Alemania), que fue controlado por el software Signal (versión 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Reino Unido). El experimento se grabó a una frecuencia de muestreo de 12,5 kHz. La señal se filtra con dos filtros Bessel de paso corto con frecuencias de corte de 1,3 y 10 kHz, respectivamente. La capacitancia de la membrana y la pipeta se compensa mediante un circuito de compensación que utiliza un amplificador. Todos los experimentos se realizaron bajo el control de una cámara Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Alemania), controlada por el software Hokawo (versión 2.8, Hamamatsu, Gerden, Alemania).
Configuración y análisis rutinario de células completas. Inmediatamente antes del registro, llene la pipeta con la solución interna que contiene las siguientes sustancias: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM gluconato de potasio, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM guanosina trifosfato (GTP) (Na) y 10,0 mM fosfato de creatina se ajustaron a pH 7,25, y la presión osmótica fue de 290 mOsm (sacarosa). Inmediatamente después de aplicar una fuerza de 0 pA para romper la membrana, se midió el potencial de membrana en reposo. La resistencia de entrada se mide aplicando corrientes hiperpolarizadas de -40, -30, -20 y -10 pA. Mida la magnitud de la respuesta de voltaje y use la ley de Ohm para calcular la resistencia de entrada. La actividad espontánea se registró en una pinza de voltaje durante 5 minutos, y la sPSC se identificó y midió en Igor Pro (versión 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, EE. UU.) utilizando un script de reconocimiento semiautomático. La curva IV y la corriente de estado estacionario se miden pinzando la batería a diferentes potenciales (comenzando desde -110 mV) y aumentando el voltaje en pasos de 5 mV. La producción de AP se probó aplicando una corriente despolarizante. Pinzar la célula a -70 mV mientras se aplica un pulso de corriente despolarizante. Ajustar el tamaño del paso de cada unidad de registro por separado (10 a 60 pA). Calcular la frecuencia máxima de AP contando manualmente los picos de pulso que causan la frecuencia de AP más alta. El umbral de AP se analiza utilizando la segunda derivada del pulso de despolarización que primero desencadena uno o más AP.
Configuración y análisis de parches perforados. Realice el registro de parches perforados utilizando protocolos estándar. Utilice una pipeta libre de ATP y GTP que no contenga los siguientes ingredientes: 128 mM de gluconato de potasio, 10 mM de KCl, 10 mM de Hepes, 0,1 mM de EGTA y 2 mM de MgCl2, y ajuste el pH a 7,2 (con KOH). Se omiten el ATP y el GTP de la solución intracelular para evitar la permeabilidad incontrolada de la membrana celular. La pipeta de parche se llena con una solución interna que contiene anfotericina (aproximadamente de 200 a 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) para obtener un registro de parche perforado. La anfotericina se disolvió en dimetilsulfóxido (concentración final: 0,1 a 0,3 %; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). La concentración de DMSO utilizada no tuvo un efecto significativo en las neuronas estudiadas. Durante el proceso de perforación, la resistencia del canal (Ra) se monitorizó continuamente, y el experimento se inició después de que la amplitud de Ra y AP se estabilizaran (20-40 minutos). La actividad espontánea se mide en una pinza de voltaje y/o corriente durante 2 a 5 minutos. El análisis de datos se realizó utilizando Igor Pro (versión 7.05.2, WaveMetrics, EE. UU.), Excel (versión 2010, Microsoft Corporation, Redmond, EE. UU.) y GraphPad Prism (versión 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, Estados Unidos). Para identificar los AP espontáneos, se utiliza el complemento NeuroMatic v3.0c de IgorPro. Identifica automáticamente los AP utilizando un umbral dado, que se ajusta individualmente para cada registro. Utilizando el intervalo de espiga, determina la frecuencia de espiga con la frecuencia de espiga instantánea máxima y la frecuencia de espiga promedio.
Aislamiento de PN. Adaptando el protocolo publicado previamente, se purificaron PN del cerebelo de ratón en una etapa específica (58). En resumen, el cerebelo se disecó y se troceó en un medio de disociación helado [sin HBSS Ca2+ y Mg2+, suplementado con 20 mM de glucosa, penicilina (50 U/ml) y estreptomicina (0,05 mg/ml)], y luego se digirió el medio en papaína [HBSS, suplementado con 1-cisteína·HCl (1 mg/ml), papaína (16 U/ml) y desoxirribonucleasa I (DNasa I; 0,1 mg/ml)]. Tratar durante 30 minutos a 30 °C. Primero lave los tejidos en medio HBSS que contiene moco de huevo (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) y DNasa (0,1 mg/ml) a temperatura ambiente para evitar la digestión enzimática, y luego en medio HBSS que contiene 20 mM de glucosa. La molienda suave en HBSS, penicilina (50 U/ml), estreptomicina (0,05 mg/ml) y DNasa (0,1 mg/ml) liberan células individuales. La suspensión celular resultante se filtró a través de un filtro celular de 70 μm, luego las células se precipitaron por centrifugación (1110 rpm, 5 minutos, 4 °C) y se resuspendieron en medio de clasificación [HBSS, suplementado con 20 mM de glucosa, 20 % de suero fetal bovino, penicilina (50 U/ml) y estreptomicina (0,05 mg/ml)]; Evaluar la viabilidad celular con yoduro de propidio y ajustar la densidad celular a 1×10⁶ a 2×10⁶ células/ml. Antes de la citometría de flujo, la suspensión se filtró a través de un filtro celular de 50 μm.
Citómetro de flujo. La clasificación celular se realizó a 4 °C utilizando la máquina FACSAria III (BD Biosciences) y el software FACSDiva (BD Biosciences, versión 8.0.1). La suspensión celular se clasificó utilizando una boquilla de 100 μm bajo una presión de 20 psi a una velocidad de ~2800 eventos/seg. Dado que los criterios de compuerta tradicionales (tamaño celular, discriminación bimodal y características de dispersión) no pueden asegurar el aislamiento correcto de PN de otros tipos celulares, la estrategia de compuerta se establece en base a la comparación directa de la intensidad de YFP y la autofluorescencia en ratones mitoYFP+ ​​y los ratones control mitoYFP−. La YFP se excita irradiando la muestra con una línea láser de 488 nm, y la señal se detecta utilizando un filtro de paso de banda de 530/30 nm. En los ratones mitoYFP+, la fuerza relativa del gen reportero Rosa26-mitoYFP también se utiliza para distinguir el cuerpo neuronal y los fragmentos de axón. El 7-AAD se excita con un láser amarillo de 561 nm y se detecta con un filtro de paso de banda de 675/20 nm para excluir las células muertas. Para separar los astrocitos simultáneamente, la suspensión celular se tiñó con ACSA-2-APC, luego la muestra se irradió con una línea láser de 640 nm y se utilizó un filtro de paso de banda de 660/20 nm para detectar la señal.
Las células recolectadas se centrifugaron (1110 rpm, 5 minutos, 4 °C) y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Los ratones Mfn2cKO y sus crías se clasificaron el mismo día para minimizar la variabilidad del procedimiento. La presentación y el análisis de los datos de FACS se realizaron con el software FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregón, EE. UU.).
Como se mencionó anteriormente (59), la PCR en tiempo real se utiliza para aislar el ADN de las neuronas clasificadas para la posterior cuantificación del ADNmt. La linealidad y la sensibilidad del umbral se probaron inicialmente ejecutando qPCR en diferentes cantidades de células. En resumen, se recolectaron 300 PN en un tampón de lisis que consistía en 50 mM de tris-HCl (pH 8,5), 1 mM de EDTA, 0,5 % de Tween 20 y proteinasa K (200 ng/ml) y se incubaron a 55 °C durante 120 minutos. Las células se incubaron posteriormente a 95 °C durante 10 minutos para asegurar la inactivación completa de la proteinasa K. Utilizando una sonda TaqMan (Thermo Fisher) específica para mt-Nd1, el ADNmt se midió mediante PCR semicuantitativa en el sistema de PCR en tiempo real 7900HT (Thermo Fisher Scientific). genes Science, número de catálogo Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, número de catálogo AIVI3E8) y 18S (Thermo Fisher Scientific, número de catálogo Hs99999901_s1).
Preparación de la muestra de proteoma. Calentando la solución a 95 °C durante 10 minutos y sonicando, en el tampón de lisis [cloruro de guanidina 6 M, hidrocloruro de tris(2-carboxietil)fosfina 10 mM, cloroacetamida 10 mM y tris-Lise pellets de neuronas congeladas en HCl]. En Bioruptor (Diagenode) durante 10 minutos (30 segundos de pulso / 30 segundos de período de pausa). La muestra se diluyó 1:10 en tris-HCl 20 mM (pH 8.0), se mezcló con 300 ng de tripsina gold (Promega) y se incubó durante la noche a 37 °C para lograr una digestión completa. Al segundo día, la muestra se centrifugó a 20 000 g durante 20 minutos. El sobrenadante se diluyó con ácido fórmico al 0,1 %, y la solución se desalinizó con StageTips de fabricación propia. La muestra se secó en un instrumento SpeedVac (concentrador Eppendorf plus 5305) a 45 °C, y luego el péptido se suspendió en ácido fórmico al 0,1 %. Todas las muestras fueron preparadas simultáneamente por la misma persona. Para analizar las muestras de astrocitos, se marcaron 4 μg de péptidos desalinizados con una etiqueta de masas en tándem (TMT10plex, número de catálogo 90110, Thermo Fisher Scientific) con una relación péptido/reactivo TMT de 1:20. Para el marcaje con TMT, se resuspendieron 0,8 mg de reactivo TMT en 70 μl de ACN anhidro, y el péptido seco se reconstituyó en 9 μl de TEAB (bicarbonato de trietilamonio) 0,1 M, al que se añadieron 7 μl de reactivo TMT en ACN. La concentración fue del 43,75 %. Tras 60 minutos de incubación, la reacción se detuvo con 2 μl de hidroxilamina al 5%. Los péptidos marcados se recolectaron, secaron, resuspendieron en 200 μl de ácido fórmico (AF) al 0,1%, se dividieron en dos y se desalaron utilizando StageTips de fabricación propia. Mediante cromatografía líquida de ultra alto rendimiento UltiMate 3000 (UltiMate 3000), una de las dos mitades se fraccionó en una columna cromatográfica Acquity de 1 mm x 150 mm rellena con partículas C18 de 130 Å y 1,7 μm (Waters, número de catálogo SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific. Separe los péptidos a un caudal de 30 μl/min, sepárelos del 1 % al 50 % del tampón B durante 85 minutos con un gradiente escalonado de 96 minutos, del 50 % al 95 % del tampón B durante 3 minutos, luego 8 minutos para el 95 % del tampón B; el tampón A es 5 % ACN y 10 mM de bicarbonato de amonio (ABC), y el tampón B es 80 % ACN y 10 mM de ABC. Recoja las fracciones cada 3 minutos y combínelas en dos grupos (1 + 17, 2 + 18, etc.) y séquelas en una centrífuga de vacío.
Análisis LC-MS/MS. Para la espectrometría de masas, los péptidos (número r119.aq) se separaron en una columna analítica PicoFrit de 25 cm y 75 μm de diámetro interno (lente objetivo nueva, número de pieza PF7508250) equipada con medio ReproSil-Pur 120 C18-AQ de 1,9 μm (Dr. Maisch, mat), Use EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Alemania). La columna se mantuvo a 50 °C. Los tampones A y B son ácido fórmico al 0,1 % en agua y ácido fórmico al 0,1 % en ACN al 80 %, respectivamente. Los péptidos se separaron de un 6 % a un 31 % de tampón B durante 65 minutos y de un 31 % a un 50 % de tampón B durante 5 minutos con un gradiente de 200 nl/min. Los péptidos eluidos se analizaron en un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). La medición m/z del precursor peptídico se realiza con una resolución de 120 000 en el rango de 350 a 1500 m/z. Utilizando una energía de colisión normalizada del 27 %, se selecciona el precursor más fuerte con un estado de carga de 2 a 6 para la escisión de la trampa C de alta energía (HCD). El tiempo de ciclo se establece en 1 s. El valor m/z del fragmento peptídico se midió en la trampa de iones utilizando el objetivo AGC más pequeño de 5×10⁴ y el tiempo máximo de inyección de 86 ms. Después de la fragmentación, el precursor se colocó en la lista de exclusión dinámica durante 45 s. Los péptidos marcados con TMT se separaron en una columna Acclaim PepMap de 50 cm y 75 μm (Thermo Fisher Scientific, número de catálogo 164942), y los espectros de migración se analizaron en un espectrómetro de masas Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) equipado con un sistema de iones de forma de onda asimétrica de campo alto (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) que opera a dos voltajes de compensación de −50 y −70 V. Se utiliza MS3 seleccionado en función del precursor de sincronización para la medición de la señal del ion reporte TMT. La separación de péptidos se llevó a cabo en EASY-nLC 1200, utilizando una elución con gradiente lineal del 90%, con una concentración de tampón del 6% al 31%; el tampón A era 0,1% FA, y el tampón B era 0,1% FA y 80% ACN. La columna analítica se opera a 50°C. Utilice FreeStyle (versión 1.6, Thermo Fisher Scientific) para dividir el archivo original según la tensión de compensación de FAIMS.
Identificación y cuantificación de proteínas. Utilizando el motor de búsqueda integrado Andromeda, los datos originales se analizaron con MaxQuant versión 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Además de las secuencias de la recombinasa Cre y YFP obtenidas de Aequorea victoria, se buscaron espectros de fragmentos de péptidos para la secuencia canónica y la secuencia de isoforma del proteoma de referencia del ratón (ID de proteoma UP000000589, descargado de UniProt en mayo de 2017). La oxidación de metionina y la acetilación N-terminal de la proteína se establecieron como modificaciones variables; la metilación de carbamoilo de cisteína se estableció como modificación fija. Los parámetros de digestión se establecieron en "especificidad" y "tripsina/P". El número mínimo de péptidos y péptidos de navaja utilizados para la identificación de proteínas es 1; el número mínimo de péptidos únicos es 0. Bajo las condiciones de coincidencia del mapa de péptidos, la tasa de identificación de proteínas fue 0,01. La opción "Segundo péptido" está habilitada. Utilice la opción "coincidencia entre ejecuciones" para transferir identificaciones exitosas entre diferentes archivos originales. Utilice LFQ recuento de relación mínima 1 para cuantificación sin etiquetas (LFQ) (60). La intensidad LFQ se filtra para al menos dos valores válidos en al menos un grupo de genotipo en cada punto temporal, y se extrapola de una distribución normal con un ancho de 0,3 y movimiento hacia abajo 1,8. Utilice la plataforma de computación Perseus (https://maxquant.net/perseus/) y R (https://r-project.org/) para analizar los resultados LFQ. Se utilizó una prueba t moderada bidireccional del paquete de software limma para el análisis de expresión diferencial (61). El análisis exploratorio de datos se realiza utilizando ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally y pheatmap. Los datos de proteómica basados ​​en TMT se analizaron utilizando MaxQuant versión 1.6.10.43. Busque datos proteómicos brutos en la base de datos de proteómica humana de UniProt, descargada en septiembre de 2018. El análisis incluye el factor de corrección de pureza isotópica proporcionado por el fabricante. Utilice limma en R para el análisis de expresión diferencial. Los datos originales, los resultados de la búsqueda en la base de datos y el flujo de trabajo y los resultados del análisis de datos se almacenan en la alianza ProteomeXchange a través del repositorio asociado PRIDE con el identificador de conjunto de datos PXD019690.
Las anotaciones funcionales enriquecen el análisis. La herramienta Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) se utilizó para determinar la riqueza de los términos de anotación funcional del conjunto de datos a las 8 semanas (Figura 1). En resumen, la lista cuantitativa de proteínas obtenida del análisis de datos LC-MS/MS (espectrometría de masas en tándem) se utiliza con los siguientes criterios de filtro: Mus musculus se selecciona como especie y fondo, y la categoría muestra el valor P ajustado por Benjamini para enriquecimiento 0,05 o inferior se considera significativo. Para este gráfico, se muestran las cinco categorías de exceso superior en cada clúster según el valor P ajustado. Utilizando múltiples pruebas t, utilizando el programa de impulso lineal de dos etapas de Benjamini, Krieger y Yekutieli (Q = 5%), se realiza un análisis de expresión de proteínas del curso temporal en los candidatos importantes identificados en cada categoría, y cada fila se analiza por separado. No es necesario adoptar una SD consistente.
Para comparar los resultados de este estudio con bases de datos publicadas y generar un diagrama de Venn en la Figura 1, combinamos la lista cuantitativa de proteínas con las anotaciones de MitoCarta 2.0 (24). Utilice la herramienta en línea Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) para generar el diagrama.
Para obtener información detallada sobre los procedimientos estadísticos utilizados en el análisis proteómico, consulte la sección correspondiente de Materiales y Métodos. Para el resto de experimentos, encontrará información detallada en la leyenda correspondiente. Salvo que se indique lo contrario, todos los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM), y todos los análisis estadísticos se realizaron con el software GraphPad Prism 8.1.2.
Para consultar los materiales complementarios de este artículo, visite http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
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El análisis proteómico de neuronas disfuncionales reveló que se activan programas metabólicos para contrarrestar la neurodegeneración.
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