El artículo forma parte del tema de investigación «Tecnologías avanzadas de biorremediación y procesos de reciclaje de compuestos orgánicos sintéticos (COS)». Ver los 14 artículos.
Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) de bajo peso molecular, como el naftaleno y los naftalenos sustituidos (metilnaftaleno, ácido naftoico, 1-naftil-N-metilcarbamato, etc.), se utilizan ampliamente en diversas industrias y son genotóxicos, mutagénicos o carcinógenos para los organismos. Estos compuestos orgánicos sintéticos (COS) o xenobióticos se consideran contaminantes prioritarios y representan una grave amenaza para el medio ambiente mundial y la salud pública. La intensidad de las actividades humanas (p. ej., gasificación de carbón, refinación de petróleo, emisiones de vehículos y aplicaciones agrícolas) determina la concentración, el destino y el transporte de estos compuestos ubicuos y persistentes. Además de los métodos de tratamiento y eliminación físicos y químicos, las tecnologías ecológicas y respetuosas con el medio ambiente, como la biorremediación, que utilizan microorganismos capaces de degradar completamente los COP o convertirlos en subproductos no tóxicos, han surgido como una alternativa segura, rentable y prometedora. Varias especies bacterianas pertenecientes a los filos Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia y Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus y Paenibacillus) y Actinobacteria (Rhodococcus y Arthrobacter) en la microbiota del suelo han demostrado la capacidad de degradar varios compuestos orgánicos. Los estudios metabólicos, la genómica y el análisis metagenómico nos ayudan a comprender la complejidad catabólica y la diversidad presentes en estas formas de vida simples, que pueden aplicarse posteriormente para una biodegradación eficiente. La existencia a largo plazo de los HAP ha dado lugar a la aparición de nuevos fenotipos de degradación mediante la transferencia horizontal de genes utilizando elementos genéticos como plásmidos, transposones, bacteriófagos, islas genómicas y elementos conjugativos integradores. La biología de sistemas y la ingeniería genética de aislados específicos o comunidades modelo (consorcios) pueden permitir la biorremediación integral, rápida y eficiente de estos HAP mediante efectos sinérgicos. En esta revisión, nos centramos en las diferentes vías metabólicas y su diversidad, la composición y diversidad genética, y las respuestas/adaptaciones celulares de las bacterias degradadoras de naftaleno y naftaleno sustituido. Esto proporcionará información ecológica para su aplicación en campo y la optimización de cepas para una biorremediación eficiente.
El rápido desarrollo de las industrias (petroquímica, agrícola, farmacéutica, de tintes textiles, cosmética, etc.) ha contribuido a la prosperidad económica mundial y a la mejora del nivel de vida. Este desarrollo exponencial ha dado lugar a la producción de una gran cantidad de compuestos orgánicos sintéticos (COS), que se utilizan para la fabricación de diversos productos. Estos compuestos extraños o COS incluyen hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), pesticidas, herbicidas, plastificantes, tintes, productos farmacéuticos, organofosforados, retardantes de llama, disolventes orgánicos volátiles, etc. Se emiten a la atmósfera y a los ecosistemas acuáticos y terrestres, donde tienen impactos multidimensionales, causando efectos perjudiciales en diversas bioformas mediante la alteración de las propiedades fisicoquímicas y la estructura de la comunidad (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Muchos contaminantes aromáticos tienen impactos fuertes y destructivos en muchos ecosistemas intactos/puntos críticos de biodiversidad (p. ej. arrecifes de coral, capas de hielo árticas/antárticas, lagos de alta montaña, sedimentos de aguas profundas, etc.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Estudios geomicrobiológicos recientes han demostrado que la deposición de materia orgánica sintética (p. ej. contaminantes aromáticos) y sus derivados en las superficies de estructuras artificiales (entorno construido) (p. ej. sitios de patrimonio cultural y monumentos hechos de granito, piedra, madera y metal) acelera su degradación (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Las actividades humanas pueden intensificar y empeorar la degradación biológica de monumentos y edificios a través de la contaminación del aire y el cambio climático (Liu et al. 2020). Estos contaminantes orgánicos reaccionan con el vapor de agua en la atmósfera y se depositan en la estructura, causando la degradación física y química del material. La biodegradación es ampliamente reconocida como cambios indeseables en la apariencia y propiedades de los materiales causados ​​por organismos vivos que afectan su preservación (Pochon y Jaton, 1967). La acción microbiana adicional (metabolismo) de estos compuestos puede reducir la integridad estructural, la efectividad de la conservación y el valor cultural (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). Por otro lado, en algunos casos, se ha encontrado que la adaptación y respuesta microbiana a estas estructuras es beneficiosa ya que forman biopelículas y otras costras protectoras que reducen la tasa de descomposición (Martino, 2016). Por lo tanto, el desarrollo de estrategias efectivas de conservación sostenible a largo plazo para monumentos de piedra, metal y madera requiere una comprensión profunda de los procesos clave involucrados en este proceso. En comparación con los procesos naturales (procesos geológicos, incendios forestales, erupciones volcánicas, reacciones de plantas y bacterias), las actividades humanas resultan en la liberación de grandes volúmenes de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) y otro carbono orgánico (CO) en los ecosistemas. Muchos HAP utilizados en la agricultura (insecticidas y pesticidas como DDT, atrazina, carbaril, pentaclorofenol, etc.), la industria (petróleo crudo, lodos/residuos de petróleo, plásticos derivados del petróleo, PCB, plastificantes, detergentes, desinfectantes, fumigantes, fragancias y conservantes), productos de cuidado personal (protectores solares, desinfectantes, repelentes de insectos y almizcles policíclicos) y municiones (explosivos como 2,4,6-TNT) son xenobióticos potenciales que pueden afectar la salud planetaria (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna y Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Esta lista puede ampliarse para incluir compuestos derivados del petróleo (combustibles, lubricantes, asfaltenos), bioplásticos de alto peso molecular y líquidos iónicos (Amde et al., 2015). La Tabla 1 enumera varios contaminantes aromáticos y sus aplicaciones en diversas industrias. En los últimos años, las emisiones antropogénicas de compuestos orgánicos volátiles, así como de dióxido de carbono y otros gases de efecto invernadero, han comenzado a aumentar (Dvorak et al., 2017). Sin embargo, los impactos antropogénicos superan significativamente los naturales. Además, encontramos que varios SOC persisten en muchos entornos ambientales y se han identificado como contaminantes emergentes con efectos adversos en los biomas (Figura 1). Las agencias ambientales como la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (USEPA) han incluido muchos de estos contaminantes en su lista de prioridades debido a sus propiedades citotóxicas, genotóxicas, mutagénicas y cancerígenas. Por lo tanto, se necesitan regulaciones estrictas de eliminación y estrategias efectivas para el tratamiento/eliminación de residuos de los ecosistemas contaminados. Varios métodos de tratamiento físico-químico como la pirólisis, el tratamiento térmico oxidativo, la aireación del aire, el vertido, la incineración, etc. son ineficaces y costosos y generan subproductos corrosivos, tóxicos y difíciles de tratar. Con la creciente conciencia ambiental global, los microorganismos capaces de degradar estos contaminantes y sus derivados (tales como halogenados, nitro, alquilo y/o metilo) están atrayendo cada vez más atención (Fennell et al., 2004; Haritash y Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). El uso de estos microorganismos candidatos indígenas solos o en cultivos mixtos (colonias) para la eliminación de contaminantes aromáticos tiene ventajas en términos de seguridad ambiental, costo, eficiencia, efectividad y sostenibilidad. Los investigadores también están explorando la integración de procesos microbianos con métodos redox electroquímicos, a saber, sistemas bioelectroquímicos (BES), como una tecnología prometedora para el tratamiento/eliminación de contaminantes (Huang et al., 2011). La tecnología BES ha atraído una creciente atención debido a su alta eficiencia, bajo costo, seguridad ambiental, operación a temperatura ambiente, materiales biocompatibles y la capacidad de recuperar subproductos valiosos (p. ej., electricidad, combustible y químicos) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). La llegada de la secuenciación genómica de alto rendimiento y las herramientas/métodos ómicos ha proporcionado una gran cantidad de nueva información sobre la regulación genética, la proteómica y la fluxómica de las reacciones de varios microorganismos degradadores. La combinación de estas herramientas con la biología de sistemas ha mejorado aún más nuestra comprensión de la selección y el ajuste de las vías catabólicas objetivo en los microorganismos (es decir, el diseño metabólico) para lograr una biodegradación eficiente y efectiva. Para diseñar estrategias de biorremediación efectivas utilizando microorganismos candidatos adecuados, necesitamos comprender el potencial bioquímico, la diversidad metabólica, la composición genética y la ecología (autoecología/sinecología) de los microorganismos.
Fig. 1. Fuentes y vías de transporte de HAP de bajo peso molecular a través de diversos entornos ambientales y diversos factores que afectan a la biota. Las líneas discontinuas representan las interacciones entre los elementos del ecosistema.
En esta revisión, hemos intentado resumir los datos sobre la degradación de HAP simples, como el naftaleno y los naftalenos sustituidos, por diversos aislados bacterianos, abarcando las vías metabólicas y la diversidad, las enzimas implicadas en la degradación, la composición/contenido y diversidad génica, las respuestas celulares y diversos aspectos de la biorremediación. Comprender los niveles bioquímicos y moleculares facilitará la identificación de cepas hospedadoras idóneas y su posterior ingeniería genética para la biorremediación eficaz de estos contaminantes prioritarios. Esto contribuirá al desarrollo de estrategias para el establecimiento de consorcios bacterianos específicos del sitio para una biorremediación eficaz.
La presencia de una gran cantidad de compuestos aromáticos tóxicos y peligrosos (que cumplen la regla de Huckel: 4n + 2π electrones, n = 1, 2, 3, …) representa una grave amenaza para diversos medios ambientales, como el aire, el suelo, los sedimentos y las aguas superficiales y subterráneas (Puglisi et al., 2007). Estos compuestos presentan anillos de benceno individuales (monocíclicos) o múltiples (policíclicos) dispuestos en forma lineal, angular o en clúster, y presentan estabilidad (estabilidad/inestabilidad) en el entorno debido a su alta energía de resonancia negativa y su inercia, lo cual se explica por su hidrofobicidad y estado reducido. Cuando el anillo aromático se reemplaza además por grupos metilo (-CH3), carboxilo (-COOH), hidroxilo (-OH) o sulfonato (-HSO3), se vuelve más estable, tiene una mayor afinidad por las macromoléculas y es bioacumulable en sistemas biológicos (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Algunos hidrocarburos aromáticos policíclicos de bajo peso molecular (LMWAH), como el naftaleno y sus derivados [metilnaftaleno, ácido naftoico, naftalenosulfonato y 1-naftil N-metilcarbamato (carbarilo)], han sido incluidos en la lista de contaminantes orgánicos prioritarios por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos como genotóxicos, mutagénicos y/o carcinógenos (Cerniglia, 1984). La liberación de esta clase de NM-PAH al medio ambiente puede provocar la bioacumulación de estos compuestos en todos los niveles de la cadena alimentaria, lo que afecta la salud de los ecosistemas (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
Las fuentes y vías de los HAP hacia la biota se originan principalmente a través de la migración y las interacciones entre diferentes componentes del ecosistema, como el suelo, las aguas subterráneas, las aguas superficiales, los cultivos y la atmósfera (Arey y Atkinson, 2003). La Figura 1 muestra las interacciones y la distribución de diferentes HAP de bajo peso molecular en los ecosistemas y sus vías hacia la biota/exposición humana. Los HAP se depositan en las superficies como resultado de la contaminación atmosférica y a través de la migración (deriva) de las emisiones de vehículos, los gases de escape industriales (gasificación de carbón, combustión y producción de coque) y su deposición. Las actividades industriales como la fabricación de textiles sintéticos, tintes y pinturas; la conservación de la madera; el procesamiento del caucho; las actividades de fabricación de cemento; la producción de pesticidas; y las aplicaciones agrícolas son fuentes importantes de HAP en los sistemas terrestres y acuáticos (Bamforth y Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Estudios han demostrado que los suelos en áreas suburbanas y urbanas, cerca de autopistas y en grandes ciudades son más susceptibles a los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) debido a las emisiones de centrales eléctricas, calefacción residencial, cargas de tráfico aéreo y vial, y actividades de construcción (Suman et al., 2016). (2008) demostraron que los HAP en el suelo cerca de las carreteras en Nueva Orleans, Luisiana, EE. UU., alcanzaron los 7189 μg/kg, mientras que en espacios abiertos, fueron de tan solo 2404 μg/kg. De manera similar, se han reportado niveles de HAP de hasta 300 μg/kg en áreas cercanas a plantas de gasificación de carbón en varias ciudades estadounidenses (Kanaly y Harayama, 2000; Bamforth y Singleton, 2005). Se ha informado que los suelos de diversas ciudades de la India, como Delhi (Sharma et al., 2008), Agra (Dubey et al., 2014), Bombay (Kulkarni y Venkataraman, 2000) y Visakhapatnam (Kulkarni et al., 2014), contienen altas concentraciones de HAP. Los compuestos aromáticos se adsorben con mayor facilidad en las partículas del suelo, la materia orgánica y los minerales arcillosos, convirtiéndose así en importantes sumideros de carbono en los ecosistemas (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). Las principales fuentes de HAP en los ecosistemas acuáticos son la precipitación (precipitación húmeda/seca y vapor de agua), la escorrentía urbana, el vertido de aguas residuales, la recarga de acuíferos, etc. (Srogi, 2007). Se estima que alrededor del 80% de los HAP en los ecosistemas marinos provienen de la precipitación, la sedimentación y la descarga de desechos (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Concentraciones más altas de HAP en aguas superficiales o lixiviados de vertederos de residuos sólidos eventualmente se filtran a las aguas subterráneas, lo que representa una importante amenaza para la salud pública, ya que más del 70% de la población del sur y sudeste de Asia bebe agua subterránea (Duttagupta et al., 2019). Un estudio reciente de Duttagupta et al. (2020) de análisis de ríos (32) y aguas subterráneas (235) de Bengala Occidental, India, encontró que aproximadamente el 53% de los residentes urbanos y el 44% de los residentes rurales (un total de 20 millones de residentes) pueden estar expuestos al naftaleno (4,9–10,6 μg/L) y sus derivados. Los patrones diferenciales de uso del suelo y el aumento de la extracción de aguas subterráneas se consideran los principales factores que controlan el transporte vertical (advección) de HAP de bajo peso molecular en el subsuelo. Se ha descubierto que la escorrentía agrícola, los vertidos de aguas residuales municipales e industriales y los vertidos de residuos sólidos/basura se ven afectados por los HAP en las cuencas fluviales y los sedimentos del subsuelo. La precipitación atmosférica agrava aún más la contaminación por HAP. Se han reportado altas concentraciones de HAP y sus derivados alquílicos (51 en total) en ríos/cuencas hidrográficas de todo el mundo, como los ríos Fraser, Louan, Denso, Misuri, Anacostia, Ebro y Delaware (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). En los sedimentos de la cuenca del río Ganges, se encontró que el naftaleno y el fenantreno eran los más significativos (detectados en el 70% de las muestras) (Duttagupta et al., 2019). Además, los estudios han demostrado que la cloración del agua potable puede conducir a la formación de HAP oxigenados y clorados más tóxicos (Manoli y Samara, 1999). Los HAP se acumulan en cereales, frutas y verduras como resultado de la absorción por las plantas de suelos contaminados, aguas subterráneas y precipitaciones (Fismes et al., 2002). Muchos organismos acuáticos como peces, mejillones, almejas y camarones se contaminan con HAP a través del consumo de alimentos y agua de mar contaminados, así como a través de tejidos y piel (Mackay y Fraser, 2000). Los métodos de cocción/procesamiento como asar a la parrilla, rostizar, ahumar, freír, secar, hornear y cocinar con carbón también pueden conducir a cantidades significativas de HAP en los alimentos. Esto depende en gran medida de la elección del material de ahumado, el contenido de hidrocarburos fenólicos/aromáticos, el procedimiento de cocción, el tipo de calentador, el contenido de humedad, el suministro de oxígeno y la temperatura de combustión (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). También se han detectado hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) en la leche en concentraciones variables (0,75–2,1 mg/L) (Girelli et al., 2014). La acumulación de estos HAP en los alimentos también depende de las propiedades fisicoquímicas de estos, mientras que sus efectos tóxicos están relacionados con las funciones fisiológicas, la actividad metabólica, la absorción, la distribución y la distribución corporal (Mechini et al., 2011).
La toxicidad y los efectos nocivos de los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) se conocen desde hace mucho tiempo (Cherniglia, 1984). Los hidrocarburos aromáticos policíclicos de bajo peso molecular (HBPM-LMW) (dos a tres anillos) pueden unirse covalentemente a varias macromoléculas como ADN, ARN y proteínas y son cancerígenos (Santarelli et al., 2008). Debido a su naturaleza hidrofóbica, están separados por membranas lipídicas. En humanos, las monooxigenasas del citocromo P450 oxidan los HAP a epóxidos, algunos de los cuales son altamente reactivos (p. ej., epóxido de baediol) y pueden conducir a la transformación de células normales en malignas (Marston et al., 2001). Además, los productos de transformación de los HAP como quinonas, fenoles, epóxidos, dioles, etc. son más tóxicos que los compuestos originales. Algunos HAP y sus intermediarios metabólicos pueden afectar las hormonas y varias enzimas en el metabolismo, afectando así negativamente el crecimiento, el sistema nervioso central, los sistemas reproductivo e inmunológico (Swetha y Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). Se ha informado que la exposición a corto plazo a HAP de bajo peso molecular causa deterioro de la función pulmonar y trombosis en asmáticos y aumenta el riesgo de cáncer de piel, pulmón, vejiga y gastrointestinal (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Estudios en animales también han demostrado que la exposición a HAP puede tener efectos adversos en la función reproductiva y el desarrollo y puede causar cataratas, daño renal y hepático e ictericia. Se ha demostrado que varios productos de biotransformación de HAP como dioles, epóxidos, quinonas y radicales libres (cationes) forman aductos de ADN. Se ha demostrado que los aductos estables alteran la maquinaria de replicación del ADN, mientras que los aductos inestables pueden despurinizar el ADN (principalmente a adenina y, en ocasiones, a guanina); ambos pueden generar errores que conducen a mutaciones (Schweigert et al., 2001). Además, las quinonas (benzo-/pan-) pueden generar especies reactivas de oxígeno (ROS), causando daños fatales al ADN y otras macromoléculas, afectando así la función y viabilidad tisular (Ewa y Danuta, 2017). Se ha informado que la exposición crónica a bajas concentraciones de pireno, bifenilo y naftaleno causa cáncer en animales de experimentación (Diggs et al., 2012). Debido a su toxicidad letal, la limpieza y eliminación de estos HAP de los sitios afectados o contaminados es una prioridad.
Se han utilizado diversos métodos físicos y químicos para eliminar los HAP de sitios o entornos contaminados. Procesos como la incineración, la decloración, la oxidación UV, la fijación y la extracción con disolventes presentan numerosas desventajas, como la formación de subproductos tóxicos, la complejidad del proceso, problemas de seguridad y regulatorios, baja eficiencia y alto costo. Sin embargo, la biodegradación microbiana (denominada biorremediación) es una alternativa prometedora que implica el uso de microorganismos en forma de cultivos puros o colonias. En comparación con los métodos físicos y químicos, este proceso es ecológico, no invasivo, rentable y sostenible. La biorremediación puede llevarse a cabo en el sitio afectado (in situ) o en un sitio especialmente preparado (ex situ) y, por lo tanto, se considera un método de remediación más sostenible que los métodos físicos y químicos tradicionales (Juhasz y Naidu, 2000; Andreoni y Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
Comprender los pasos metabólicos microbianos involucrados en la degradación de contaminantes aromáticos tiene enormes implicaciones científicas y económicas para la sostenibilidad ecológica y ambiental. Se estima que 2,1×1018 gramos de carbono (C) se almacenan en sedimentos y compuestos orgánicos (es decir, petróleo, gas natural y carbón, es decir, combustibles fósiles) en todo el mundo, lo que hace una contribución significativa al ciclo global del carbono. Sin embargo, la rápida industrialización, la extracción de combustibles fósiles y las actividades humanas están agotando estos reservorios de carbono litosférico, liberando aproximadamente 5,5×1015 g de carbono orgánico (como contaminantes) a la atmósfera anualmente (Gonzalez-Gaya et al., 2019). La mayor parte de este carbono orgánico ingresa a los ecosistemas terrestres y marinos a través de la sedimentación, el transporte y la escorrentía. Además, los nuevos contaminantes sintéticos derivados de combustibles fósiles, como plásticos, plastificantes y estabilizadores plásticos (ftalatos y sus isómeros), contaminan gravemente los ecosistemas marinos, edáficos y acuáticos y su biota, exacerbando así los riesgos climáticos globales. Diversos tipos de microplásticos, nanoplásticos, fragmentos de plástico y sus productos monómeros tóxicos derivados del tereftalato de polietileno (PET) se han acumulado en el Océano Pacífico entre América del Norte y el Sudeste Asiático, formando la "Gran Mancha de Basura del Pacífico", dañando la vida marina (Newell et al., 2020). Estudios científicos han demostrado que no es posible eliminar dichos contaminantes/residuos mediante ningún método físico o químico. En este contexto, los microorganismos más útiles son aquellos capaces de metabolizar oxidativamente los contaminantes en dióxido de carbono, energía química y otros subproductos no tóxicos que eventualmente ingresan a otros procesos del ciclo de nutrientes (H, O, N, S, P, Fe, etc.). Por lo tanto, comprender la ecofisiología microbiana de la mineralización de contaminantes aromáticos y su control ambiental es crucial para evaluar el ciclo del carbono microbiano, el presupuesto neto de carbono y los riesgos climáticos futuros. Dada la urgente necesidad de eliminar dichos compuestos del medio ambiente, han surgido diversas ecoindustrias centradas en tecnologías limpias. Como alternativa, la valorización de los residuos industriales y químicos residuales acumulados en los ecosistemas (es decir, el enfoque de conversión de residuos en riqueza) se considera uno de los pilares de la economía circular y los objetivos de desarrollo sostenible (Close et al., 2012). Por lo tanto, comprender los aspectos metabólicos, enzimáticos y genéticos de estos posibles candidatos a la degradación es fundamental para la eliminación y biorremediación eficaces de dichos contaminantes aromáticos.
Entre los numerosos contaminantes aromáticos, prestamos especial atención a los HAP de bajo peso molecular, como el naftaleno y los naftalenos sustituidos. Estos compuestos son componentes principales de combustibles derivados del petróleo, tintes textiles, productos de consumo, pesticidas (bolas de naftalina y repelentes de insectos), plastificantes y taninos, y por lo tanto están ampliamente distribuidos en numerosos ecosistemas (Preuss et al., 2003). Informes recientes destacan la acumulación de concentraciones de naftaleno en sedimentos de acuíferos, aguas subterráneas y suelos subterráneos, zonas vadosas y lechos fluviales, lo que sugiere su bioacumulación en el medio ambiente (Duttagupta et al., 2019, 2020). La Tabla 2 resume las propiedades fisicoquímicas, las aplicaciones y los efectos sobre la salud del naftaleno y sus derivados. En comparación con otros HAP de alto peso molecular, el naftaleno y sus derivados son menos hidrófobos, más solubles en agua y se encuentran ampliamente distribuidos en los ecosistemas, por lo que se utilizan a menudo como sustratos modelo para estudiar el metabolismo, la genética y la diversidad metabólica de los HAP. Un gran número de microorganismos son capaces de metabolizar el naftaleno y sus derivados, y se dispone de información exhaustiva sobre sus vías metabólicas, enzimas y características reguladoras (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Además, el naftaleno y sus derivados se consideran compuestos prototipo para la evaluación de la contaminación ambiental debido a su alta abundancia y biodisponibilidad. La Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos estima que los niveles promedio de naftaleno son de 5,19 μg por metro cúbico provenientes del humo de cigarrillo, principalmente de la combustión incompleta, y de 7,8 a 46 μg provenientes del humo secundario, mientras que la exposición a la creosota y al naftaleno es de 100 a 10 000 veces mayor (Preuss et al. 2003). Se ha descubierto que el naftaleno, en particular, tiene toxicidad respiratoria y carcinogenicidad específicas para la especie, la región y el sexo. Con base en estudios en animales, la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC) ha clasificado al naftaleno como un "posible carcinógeno humano" (Grupo 2B)1. La exposición a naftalenos sustituidos, principalmente por inhalación o administración parenteral (oral), causa daño al tejido pulmonar y aumenta la incidencia de tumores pulmonares en ratas y ratones (Programa Nacional de Toxicología 2). Los efectos agudos incluyen náuseas, vómitos, dolor abdominal, diarrea, dolor de cabeza, confusión, sudoración profusa, fiebre, taquicardia, etc. Por otro lado, se ha reportado que el insecticida carbamato de amplio espectro carbaril (1-naftil N-metilcarbamato) es tóxico para invertebrados acuáticos, anfibios, abejas melíferas y humanos, y se ha demostrado que inhibe la acetilcolinesterasa causando parálisis (Smulders et al., 2003; Bulen y Distel, 2011). Por lo tanto, comprender los mecanismos de degradación microbiana, regulación genética y reacciones enzimáticas y celulares es crucial para desarrollar estrategias de biorremediación en ambientes contaminados.
Tabla 2. Información detallada sobre las propiedades fisicoquímicas, usos, métodos de identificación y enfermedades asociadas del naftaleno y sus derivados.
En nichos contaminados, los contaminantes aromáticos hidrofóbicos y lipofílicos pueden causar diversos efectos celulares en el microbioma ambiental (comunidad), como cambios en la fluidez y permeabilidad de la membrana, hinchazón de la bicapa lipídica, interrupción de la transferencia de energía (cadena de transporte de electrones/fuerza motriz de protones) y actividad de las proteínas asociadas a la membrana (Sikkema et al., 1995). Además, algunos intermediarios solubles, como los catecoles y las quinonas, generan especies reactivas de oxígeno (ROS) y forman aductos con ADN y proteínas (Penning et al., 1999). Por lo tanto, la abundancia de dichos compuestos en los ecosistemas ejerce una presión selectiva sobre las comunidades microbianas para que se conviertan en degradadores eficientes a diversos niveles fisiológicos, como la captación/transporte, la transformación intracelular, la asimilación/utilización y la compartimentación.
Una búsqueda en el Proyecto de Base de Datos Ribosomal II (RDP-II) reveló que se aislaron un total de 926 especies bacterianas de medios o cultivos de enriquecimiento contaminados con naftaleno o sus derivados. El grupo Proteobacteria tuvo el mayor número de representantes (n = 755), seguido de Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) y bacterias no clasificadas (8) (Figura 2). Los representantes de γ-Proteobacteria (Pseudomonadales y Xanthomonadales) dominaron todos los grupos Gram-negativos con alto contenido de G+C (54%), mientras que Clostridiales y Bacillales (30%) fueron grupos Gram-positivos con bajo contenido de G+C. Se ha reportado que Pseudomonas (la especie con mayor número, 338) es capaz de degradar naftaleno y sus derivados metílicos en diversos ecosistemas contaminados (alquitrán de hulla, petróleo, crudo, lodos, derrames de petróleo, aguas residuales, residuos orgánicos y vertederos), así como en ecosistemas intactos (suelo, ríos, sedimentos y aguas subterráneas) (Figura 2). Además, estudios de enriquecimiento y análisis metagenómicos de algunas de estas regiones revelaron que especies no cultivadas de Legionella y Clostridium podrían tener capacidad degradativa, lo que indica la necesidad de cultivar estas bacterias para estudiar nuevas vías y la diversidad metabólica.
Fig. 2. Diversidad taxonómica y distribución ecológica de representantes bacterianos en ambientes contaminados con naftaleno y derivados del naftaleno.
Entre los diversos microorganismos que degradan hidrocarburos aromáticos, la mayoría son capaces de degradar el naftaleno como única fuente de carbono y energía. La secuencia de eventos involucrados en el metabolismo del naftaleno se ha descrito para Pseudomonas sp. (cepas: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 y CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 y otras cepas (ND6 y AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis y Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; El metabolismo se inicia por una dioxigenasa multicomponente [naftaleno dioxigenasa (NDO), una dioxigenasa hidroxilante de anillo] que cataliza la oxidación de uno de los anillos aromáticos de naftaleno utilizando oxígeno molecular como otro sustrato, convirtiendo el naftaleno en cis-naftalenodiol (Figura 3). El cis-dihidrodiol se convierte en 1,2-dihidroxinaftaleno por una Deshidrogenasa. Una dioxigenasa que escinde el anillo, la 1,2-dihidroxinaftaleno dioxigenasa (12DHNDO), convierte el 1,2-dihidroxinaftaleno en ácido 2-hidroxicromeno-2-carboxílico. La isomerización enzimática cis-trans produce trans-o-hidroxibencilidenpiruvato, que es escindido por la hidratasa aldolasa en aldehído salicílico y piruvato. El ácido orgánico piruvato fue el primer compuesto C3 derivado del esqueleto carbonado del naftaleno y dirigido a la vía del carbono central. Además, la salicilaldehído deshidrogenasa dependiente de NAD+ convierte el salicilaldehído en ácido salicílico. El metabolismo en esta etapa se denomina "vía superior" de degradación del naftaleno. Esta vía es muy común en la mayoría de las bacterias que degradan naftaleno. Sin embargo, existen algunas excepciones; por ejemplo, en el termófilo Bacillus hamburgii 2, la degradación del naftaleno es iniciada por el naftaleno. 2,3-dioxigenasa para formar 2,3-dihidroxinaftaleno (Annweiler et al., 2000).
Figura 3. Vías de degradación de naftaleno, metilnaftaleno, ácido naftoico y carbarilo. Los números encerrados en círculos representan las enzimas responsables de la conversión secuencial de naftaleno y sus derivados en productos posteriores. 1 — naftaleno dioxigenasa (NDO); 2, cis-dihidrodiol deshidrogenasa; 3, 1,2-dihidroxinaftaleno dioxigenasa; 4, ácido 2-hidroxicromeno-2-carboxílico isomerasa; 5, trans-O-hidroxibencilidenpiruvato hidratasa aldolasa; 6, salicilaldehído deshidrogenasa; 7, salicilato 1-hidroxilasa; 8, catecol 2,3-dioxigenasa (C₂₄DO); 9, 2-hidroximuconato semialdehído deshidrogenasa; 10, 2-oxopent-4-enoato hidratasa; 11, 4-hidroxi-2-oxopentanoato aldolasa; 12, acetaldehído deshidrogenasa; 13, catecol-1,2-dioxigenasa (C12DO); 14, muconato cicloisomerasa; 15, muconolactona delta-isomerasa; 16, β-cetoadipatenolactona hidrolasa; 17, β-cetoadipato succinil-CoA transferasa; 18, β-cetoadipato-CoA tiolasa; 19, succinil-CoA: acetil-CoA succiniltransferasa; 20, salicilato 5-hidroxilasa; 21 – gentisato 1,2-dioxigenasa (GDO); 22, maleilpiruvato isomerasa; 23, fumarilpiruvato hidrolasa; 24, metilnaftaleno hidroxilasa (NDO); 25, hidroximetilnaftaleno deshidrogenasa; 26, naftaldehído deshidrogenasa; 27, ácido 3-formilsalicílico oxidasa; 28, hidroxiisoftalato descarboxilasa; 29, carbaril hidrolasa (CH); 30, 1-naftol-2-hidroxilasa.
Dependiendo del organismo y su composición genética, el ácido salicílico resultante se metaboliza aún más a través de la vía del catecol utilizando la salicilato 1-hidroxilasa (S1H) o a través de la vía del gentisato utilizando la salicilato 5-hidroxilasa (S5H) (Figura 3). Dado que el ácido salicílico es el principal intermediario en el metabolismo del naftaleno (vía superior), los pasos desde el ácido salicílico hasta el intermediario TCA a menudo se denominan vía inferior, y los genes se organizan en un solo operón. Es común ver que los genes en el operón de la vía superior (nah) y el operón de la vía inferior (sal) están regulados por factores reguladores comunes; por ejemplo, NahR y el ácido salicílico actúan como inductores, permitiendo que ambos operones metabolicen completamente el naftaleno (Phale et al., 2019, 2020).
Además, el catecol se escinde cíclicamente a 2-hidroximuconato semialdehído a través de la vía meta por la catecol 2,3-dioxigenasa (C23DO) (Yen et al., 1988) y se hidroliza aún más por la 2-hidroximuconato semialdehído hidrolasa para formar ácido 2-hidroxipent-2,4-dienoico. El 2-hidroxipent-2,4-dienoato se convierte luego en piruvato y acetaldehído por una hidratasa (2-oxopent-4-enoato hidratasa) y una aldolasa (4-hidroxi-2-oxopentanoato aldolasa) y luego ingresa a la vía del carbono central (Figura 3). Alternativamente, el catecol se escinde cíclicamente a cis,cis-muconato a través de la vía orto por la catecol 1,2-oxigenasa (C12DO). La cicloisomerasa de muconato, la isomerasa de muconolactona y la β-cetoadipato-nollactona hidrolasa convierten el cis,cis-muconato en 3-oxoadipato, que ingresa a la vía del carbono central a través de succinil-CoA y acetil-CoA (Nozaki et al., 1968) (Figura 3).
En la vía del gentisato (2,5-dihidroxibenzoato), el anillo aromático es escindido por la gentisato 1,2-dioxigenasa (GDO) para formar maleilpiruvato. Este producto puede hidrolizarse directamente a piruvato y malato, o puede isomerizarse para formar fumarilpiruvato, que posteriormente puede hidrolizarse a piruvato y fumarato (Larkin y Day, 1986). La elección de la vía alternativa se ha observado tanto en bacterias gramnegativas como grampositivas a nivel bioquímico y genético (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). Las bacterias gramnegativas (Pseudomonas) prefieren utilizar ácido salicílico, que es un inductor del metabolismo del naftaleno, descarboxilándolo a catecol mediante la salicilato 1-hidroxilasa (Gibson y Subramanian, 1984). Por otra parte, en bacterias Gram-positivas (Rhodococcus), la salicilato 5-hidroxilasa convierte el ácido salicílico en ácido gentísico, mientras que el ácido salicílico no tiene efecto inductivo sobre la transcripción de genes de naftaleno (Grund et al., 1992) (Figura 3).
Se ha informado que especies como Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas y Mycobacterium pueden degradar monometilnaftaleno o dimetilnaftaleno (Dean-Raymond y Bartha, 1975; Cane y Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Entre ellas, la vía de degradación de 1-metilnaftaleno y 2-metilnaftaleno de Pseudomonas sp. CSV86 se ha estudiado claramente a nivel bioquímico y enzimático (Mahajan et al., 1994). El 1-metilnaftaleno se metaboliza a través de dos vías. Primero, el anillo aromático se hidroxila (el anillo no sustituido del metilnaftaleno) para formar cis-1,2-dihidroxi-1,2-dihidro-8-metilnaftaleno, que se oxida posteriormente a salicilato de metilo y metilcatecol, y luego ingresa a la vía del carbono central después de la escisión del anillo (Figura 3). Esta vía se denomina "vía de la fuente de carbono". En la segunda "vía de desintoxicación", el grupo metilo puede ser hidroxilado por NDO para formar 1-hidroximetilnaftaleno, que se oxida posteriormente a ácido 1-naftoico y se excreta en el medio de cultivo como un producto final. Estudios han demostrado que la cepa CSV86 no puede crecer con ácido 1- y 2-naftoico como única fuente de carbono y energía, lo que confirma su vía de desintoxicación (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). En el 2-metilnaftaleno, el grupo metilo sufre hidroxilación por acción de la hidroxilasa para formar 2-hidroximetilnaftaleno. Además, el anillo no sustituido del anillo de naftaleno sufre hidroxilación para formar un dihidrodiol, que se oxida a 4-hidroximetilcatecol en una serie de reacciones catalizadas por enzimas y entra en la vía del carbono central mediante la vía de escisión del anillo meta. De forma similar, se ha descrito que S. paucimobilis 2322 utiliza NDO para hidroxilar el 2-metilnaftaleno, que se oxida posteriormente para formar salicilato de metilo y metilcatecol (Dutta et al., 1998).
Los ácidos naftoicos (sustituidos/no sustituidos) son subproductos de la desintoxicación/biotransformación que se forman durante la degradación del metilnaftaleno, el fenantreno y el antraceno y se liberan en el medio de cultivo usado. Se ha informado que el aislado de suelo Stenotrophomonas maltophilia CSV89 es capaz de metabolizar el ácido 1-naftoico como fuente de carbono (Phale et al., 1995). El metabolismo comienza con la dihidroxilación del anillo aromático para formar 1,2-dihidroxi-8-carboxinaftaleno. El diol resultante se oxida a catecol mediante 2-hidroxi-3-carboxibencilidenopiruvato, ácido 3-formilsalicílico, ácido 2-hidroxiisoftálico y ácido salicílico, y entra en la vía central del carbono mediante la vía de escisión del anillo meta (Figura 3).
El carbaril es un pesticida de carbamato de naftilo. Desde la Revolución Verde en la India en la década de 1970, el uso de fertilizantes químicos y pesticidas ha provocado un aumento de las emisiones de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) procedentes de fuentes agrícolas no puntuales (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Se estima que el 55 % (85 722 000 hectáreas) del total de tierras de cultivo de la India se trata con pesticidas químicos. En los últimos cinco años (2015-2020), el sector agrícola indio ha utilizado una media de 55 000 a 60 000 toneladas de pesticidas al año (Departamento de Cooperativas y Bienestar de los Agricultores, Ministerio de Agricultura, Gobierno de la India, agosto de 2020). En las llanuras del norte y centro del Ganges (los estados con mayor población y densidad de población), el uso de pesticidas en los cultivos está muy extendido, predominando los insecticidas. El carbaril (1-naftil-N-metilcarbamato) es un insecticida carbamato de amplio espectro, de moderada a altamente tóxico, utilizado en la agricultura india a un ritmo promedio de 100 a 110 toneladas. Se vende comúnmente bajo el nombre comercial Sevin y se utiliza para controlar insectos (pulgones, hormigas rojas, pulgas, ácaros, arañas y muchas otras plagas de exterior) que afectan a diversos cultivos (maíz, soja, algodón, frutas y verduras). Algunos microorganismos como Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus y Arthrobacter también pueden utilizarse para controlar otras plagas. Se ha informado que RC100 puede degradar carbaril (Larkin y Day, 1986; Chapalamadugu y Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha y Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). La vía de degradación de carbaril se ha estudiado ampliamente a nivel bioquímico, enzimático y genético en aislados de suelo de Pseudomonas sp. Cepas C4, C5 y C6 (Swetha y Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (Fig. 3). La vía metabólica comienza con la hidrólisis del enlace éster por la carbaril hidrolasa (CH) para formar 1-naftol, metilamina y dióxido de carbono. El 1-naftol se convierte posteriormente en 1,2-dihidroxinaftaleno por acción de la 1-naftol hidroxilasa (1-NH), que se metaboliza posteriormente mediante la vía del carbono central a través del salicilato y el gentisato. Se ha descrito que algunas bacterias degradadoras de carbarilo lo metabolizan a ácido salicílico mediante la escisión del anillo orto del catecol (Larkin y Day, 1986; Chapalamadugu y Chaudhry, 1991). Cabe destacar que las bacterias degradadoras de naftaleno metabolizan principalmente el ácido salicílico a través del catecol, mientras que las bacterias degradadoras de carbarilo prefieren metabolizarlo mediante la vía del gentisato.
Los derivados del ácido naftalenosulfónico/ácido disulfónico y del ácido naftilaminosulfónico pueden usarse como intermediarios en la producción de colorantes azoicos, agentes humectantes, dispersantes, etc. Aunque estos compuestos tienen baja toxicidad para los humanos, las evaluaciones de citotoxicidad han demostrado que son letales para peces, dafnias y algas (Greim et al., 1994). Se ha informado que representantes del género Pseudomonas (cepas A3, C22) inician el metabolismo por doble hidroxilación del anillo aromático que contiene el grupo ácido sulfónico para formar un dihidrodiol, que luego se convierte en 1,2-dihidroxinaftaleno por escisión espontánea del grupo sulfito (Brilon et al., 1981). El 1,2-dihidroxinaftaleno resultante se cataboliza a través de la ruta clásica del naftaleno, es decir, la ruta del catecol o gentisato (Figura 4). Se ha demostrado que el ácido aminonaftalenosulfónico y el ácido hidroxinaftalenosulfónico pueden ser completamente degradados por consorcios bacterianos mixtos con vías catabólicas complementarias (Nortemann et al., 1986). Se ha demostrado que un miembro del consorcio desulfuriza el ácido aminonaftalenosulfónico o el ácido hidroxinaftalenosulfónico por 1,2-dioxigenación, mientras que el aminosalicilato o el hidroxisalicilato se libera en el medio de cultivo como un metabolito de extremo muerto y posteriormente es absorbido por otros miembros del consorcio. El ácido naftalenodisulfónico es relativamente polar pero poco biodegradable y, por lo tanto, puede metabolizarse a través de diferentes vías. La primera desulfuración ocurre durante la dihidroxilación regioselectiva del anillo aromático y el grupo ácido sulfónico; La segunda desulfuración ocurre durante la hidroxilación del ácido 5-sulfosalicílico por la 5-hidroxilasa del ácido salicílico para formar ácido gentísico, que ingresa a la vía del carbono central (Brilon et al., 1981) (Figura 4). Las enzimas responsables de la degradación del naftaleno también son responsables del metabolismo del naftaleno sulfonato (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Figura 4. Vías metabólicas para la degradación del naftaleno sulfonato. Los números dentro de los círculos representan las enzimas responsables del metabolismo del naftil sulfonato, similares o idénticas a las enzimas descritas en la figura 3.
Los HAP de bajo peso molecular (HAP-LMW) son reducibles, hidrófobos y poco solubles, y por lo tanto no son susceptibles a la descomposición/degradación natural. Sin embargo, los microorganismos aeróbicos pueden oxidarlos absorbiendo oxígeno molecular (O2). Estas enzimas pertenecen principalmente a la clase de oxidorreductasas y pueden realizar varias reacciones como la hidroxilación del anillo aromático (mono o dihidroxilación), la deshidrogenación y la escisión del anillo aromático. Los productos obtenidos de estas reacciones están en un estado de oxidación más alto y se metabolizan más fácilmente a través de la vía del carbono central (Phale et al., 2020). Se ha informado que las enzimas en la vía de degradación son inducibles. La actividad de estas enzimas es muy baja o insignificante cuando las células se cultivan en fuentes de carbono simples como la glucosa o los ácidos orgánicos. La Tabla 3 resume las diversas enzimas (oxigenasas, hidrolasas, deshidrogenasas, oxidasas, etc.) involucradas en el metabolismo del naftaleno y sus derivados.
Tabla 3. Características bioquímicas de las enzimas responsables de la degradación del naftaleno y sus derivados.
Estudios radioisotópicos (18O₂) han demostrado que la incorporación de O₂ molecular a anillos aromáticos por oxigenasas es el paso más importante para activar la biodegradación de un compuesto (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). La incorporación de un átomo de oxígeno (O) del oxígeno molecular (O₂) al sustrato es iniciada por monooxigenasas endógenas o exógenas (también llamadas hidroxilasas). Otro átomo de oxígeno se reduce a agua. Las monooxigenasas exógenas reducen la flavina con NADH o NADPH, mientras que en las endomonooxigenasas la flavina es reducida por el sustrato. La posición de hidroxilación resulta en diversidad en la formación del producto. Por ejemplo, la salicilato 1-hidroxilasa hidroxila el ácido salicílico en la posición C₁, formando catecol. Por otra parte, la salicilato 5-hidroxilasa multicomponente (que contiene subunidades reductasa, ferredoxina y oxigenasa) hidroxila el ácido salicílico en la posición C5, formando ácido gentísico (Yamamoto et al., 1965).
Las dioxigenasas incorporan dos átomos de O₂ al sustrato. Según los productos formados, se dividen en dioxigenasas hidroxilantes de anillo y dioxigenasas escindentes de anillo. Las dioxigenasas hidroxilantes de anillo convierten sustratos aromáticos en cis-dihidrodioles (p. ej., naftaleno) y están ampliamente distribuidas entre las bacterias. Hasta la fecha, se ha demostrado que los organismos que contienen dioxigenasas hidroxilantes de anillo son capaces de crecer en diversas fuentes de carbono aromático. Estas enzimas se clasifican como NDO (naftaleno), tolueno dioxigenasa (TDO, tolueno) y bifenil dioxigenasa (BPDO, bifenilo). Tanto el NDO como el BPDO pueden catalizar la doble oxidación y la hidroxilación de la cadena lateral de varios hidrocarburos aromáticos policíclicos (tolueno, nitrotolueno, xileno, etilbenceno, naftaleno, bifenilo, fluoreno, indol, metilnaftaleno, naftalenosulfonato, fenantreno, antraceno, acetofenona, etc.) (Boyd y Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). El NDO es un sistema multicomponente que consiste en una oxidorreductasa, una ferredoxina y un componente oxigenasa que contiene el sitio activo (Gibson y Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). La unidad catalítica del NDO consiste en una subunidad α grande y una subunidad β pequeña dispuestas en una configuración α3β3. El NDO pertenece a una amplia familia de oxigenasas y su subunidad α contiene un sitio Rieske [2Fe-2S] y un hierro mononuclear no hemo, lo que determina su especificidad de sustrato (Parales et al., 1998). Normalmente, en un ciclo catalítico, dos electrones de la reducción del nucleótido de piridina se transfieren al ion Fe(II) en el sitio activo a través de una reductasa, una ferredoxina y un sitio Rieske. Los equivalentes reductores activan el oxígeno molecular, requisito previo para la dihidroxilación del sustrato (Ferraro et al., 2005). Hasta la fecha, solo se han purificado y caracterizado en detalle unos pocos NDO de diferentes cepas, y se ha estudiado en detalle el control genético de las vías implicadas en la degradación del naftaleno (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Las dioxigenasas de escisión de anillo (enzimas de escisión de anillo endo u orto y enzimas de escisión de anillo exodiol o meta) actúan sobre compuestos aromáticos hidroxilados. Por ejemplo, la dioxigenasa de escisión de anillo orto es la catecol-1,2-dioxigenasa, mientras que la dioxigenasa de escisión de anillo meta es la catecol-2,3-dioxigenasa (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Además de diversas oxigenasas, también existen diversas deshidrogenasas responsables de la deshidrogenación de dihidrodioles aromáticos, alcoholes y aldehídos, y que utilizan NAD+/NADP+ como aceptores de electrones, que son algunas de las enzimas importantes involucradas en el metabolismo (Gibson y Subramanian, 1984; Shaw y Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Las enzimas como las hidrolasas (esterasas, amidasas) son una segunda clase importante de enzimas que utilizan agua para romper enlaces covalentes y presentan una amplia especificidad de sustrato. La carbaril hidrolasa y otras hidrolasas se consideran componentes del periplasma (transmembrana) en bacterias gramnegativas (Kamini et al., 2018). La carbaril presenta un enlace amida y un enlace éster; por lo tanto, puede ser hidrolizada tanto por esterasa como por amidasa para formar 1-naftol. Se ha descrito que la carbaril en la cepa AC10023 de Rhizobium rhizobium y la cepa RC100 de Arthrobacter funciona como esterasa y amidasa, respectivamente. La carbaril en la cepa RC100 de Arthrobacter también funciona como amidasa. Se ha demostrado que RC100 hidroliza cuatro insecticidas de la clase N-metilcarbamato, como el carbaril, el metomilo, el ácido mefenámico y el XMC (Hayaatsu et al., 2001). Se ha informado que el CH en Pseudomonas sp. C5pp puede actuar sobre el carbaril (100 % de actividad) y el acetato de 1-naftil (36 % de actividad), pero no sobre la 1-naftilacetamida, lo que indica que es una esterasa (Trivedi et al., 2016).
Estudios bioquímicos, patrones de regulación enzimática y análisis genético han demostrado que los genes de degradación de naftaleno constan de dos unidades reguladoras inducibles u "operones": nah (la "vía ascendente", que convierte el naftaleno en ácido salicílico) y sal (la "vía descendente", que convierte el ácido salicílico en la vía del carbono central a través del catecol). El ácido salicílico y sus análogos pueden actuar como inductores (Shamsuzzaman y Barnsley, 1974). En presencia de glucosa o ácidos orgánicos, el operón se reprime. La Figura 5 muestra la organización genética completa de la degradación de naftaleno (en forma de operón). Se han descrito varias variantes/formas con nombre del gen nah (ndo/pah/dox) y se ha descubierto que tienen una alta homología de secuencia (90%) entre todas las especies de Pseudomonas (Abbasian et al., 2016). Los genes de la vía ascendente de naftaleno se organizaron generalmente en un orden de consenso como se muestra en la Figura 5A. Otro gen, nahQ, también se reportó involucrado en el metabolismo del naftaleno y generalmente se localizaba entre nahC y nahE, pero su función real aún no se ha dilucidado. De manera similar, el gen nahY, responsable de la quimiotaxis sensible al naftaleno, se encontró en el extremo distal del operón nah en algunos miembros. En Ralstonia sp., el gen U2, que codifica la glutatión S-transferasa (gsh), se encontró ubicado entre nahAa y nahAb, pero no afectó las características de utilización del naftaleno (Zylstra et al., 1997).
Figura 5. Organización genética y diversidad observada durante la degradación de naftaleno entre especies bacterianas; (A) Vía superior del naftaleno, metabolismo del naftaleno a ácido salicílico; (B) Vía inferior del naftaleno, ácido salicílico a través del catecol hasta la vía del carbono central; (C) ácido salicílico a través del gentisato hasta la vía del carbono central.
La vía inferior (operón sal) consiste típicamente en nahGTHINLMOKJ y convierte el salicilato en piruvato y acetaldehído a través de la vía de escisión del metaring de catecol. Se encontró que el gen nahG (que codifica la salicilato hidroxilasa) estaba conservado en el extremo proximal del operón (Fig. 5B). En comparación con otras cepas que degradan naftaleno, en P. putida CSV86 los operones nah y sal están en tándem y muy estrechamente relacionados (aproximadamente 7,5 kb). En algunas bacterias gramnegativas, como Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 y P. putida AK5, el naftaleno se metaboliza como un metabolito de carbono central a través de la vía gentisato (en forma del operón sgp/nag). El casete genético normalmente se representa en la forma nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, donde nagR (que codifica un regulador de tipo LysR) se ubica en el extremo superior (Figura 5C).
El carbaril entra en el ciclo central del carbono mediante el metabolismo del 1-naftol, el 1,2-dihidroxinaftaleno, el ácido salicílico y el ácido gentísico (Figura 3). Con base en estudios genéticos y metabólicos, se ha propuesto dividir esta vía en «ascendente» (conversión de carbaril en ácido salicílico), «intermedia» (conversión de ácido salicílico en ácido gentísico) y «descendente» (conversión de ácido gentísico en intermediarios de la vía central del carbono) (Singh et al., 2013). El análisis genómico de C5pp (supercontig A, 76,3 kb) reveló que el gen mcbACBDEF está involucrado en la conversión de carbaril en ácido salicílico, seguido de mcbIJKL en la conversión de ácido salicílico en ácido gentísico, y mcbOQP en la conversión de ácido gentísico en intermediarios de carbono central (fumarato y piruvato, Trivedi et al., 2016) (Figura 6).
Se ha informado que las enzimas involucradas en la degradación de hidrocarburos aromáticos (incluyendo naftaleno y ácido salicílico) pueden ser inducidas por los compuestos correspondientes e inhibidas por fuentes simples de carbono como glucosa o ácidos orgánicos (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Entre las diversas vías metabólicas de naftaleno y sus derivados, las características reguladoras de naftaleno y carbaril se han estudiado en cierta medida. Para naftaleno, los genes en las vías ascendentes y descendentes están regulados por NahR, un regulador positivo trans-actuante de tipo LysR. Es necesario para la inducción del gen nah por ácido salicílico y su posterior expresión de alto nivel (Yen y Gunsalus, 1982). Además, los estudios han demostrado que el factor huésped integrativo (IHF) y XylR (regulador transcripcional dependiente de sigma 54) también son críticos para la activación transcripcional de genes en el metabolismo de naftaleno (Ramos et al., 1997). Estudios han demostrado que las enzimas de la vía de apertura del anillo meta del catecol, concretamente la catecol 2,3-dioxigenasa, se inducen en presencia de naftaleno y/o ácido salicílico (Basu et al., 2006). Estudios han demostrado que las enzimas de la vía de apertura del anillo orto del catecol, concretamente la catecol 1,2-dioxigenasa, se inducen en presencia de ácido benzoico y cis,cis-muconato (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
En la cepa C5pp, cinco genes, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR y mcbS, codifican reguladores pertenecientes a la familia LysR/TetR de reguladores transcripcionales responsables de controlar la degradación del carbarilo. Se encontró que el gen homólogo mcbG estaba más estrechamente relacionado con el regulador de tipo LysR PhnS (58% de identidad de aminoácidos) involucrado en el metabolismo del fenantreno en Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). Se encontró que el gen mcbH estaba involucrado en la vía intermedia (conversión de ácido salicílico a ácido gentísico) y pertenece al regulador transcripcional de tipo LysR NagR/DntR/NahR en Pseudomonas y Burkholderia. Se informó que los miembros de esta familia reconocen el ácido salicílico como una molécula efectora específica para la inducción de genes de degradación. Por otra parte, se identificaron tres genes, mcbN, mcbR y mcbS, pertenecientes a reguladores transcripcionales de tipo LysR y TetR, en la vía descendente (metabolitos de la vía del carbono central-gentisato).
En procariotas, los procesos de transferencia horizontal de genes (adquisición, intercambio o transferencia) a través de plásmidos, transposones, profagos, islas genómicas y elementos conjugativos integrativos (ICE) son causas importantes de plasticidad en genomas bacterianos, lo que lleva a la ganancia o pérdida de funciones/rasgos específicos. Permite a las bacterias adaptarse rápidamente a diferentes condiciones ambientales, proporcionando posibles ventajas metabólicas adaptativas al huésped, como la degradación de compuestos aromáticos. Los cambios metabólicos a menudo se logran mediante el ajuste fino de los operones de degradación, sus mecanismos reguladores y especificidades enzimáticas, lo que facilita la degradación de una gama más amplia de compuestos aromáticos (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). Se ha encontrado que los casetes génicos para la degradación de naftaleno se encuentran en una variedad de elementos móviles como plásmidos (conjugativos y no conjugativos), transposones, genomas, ICE y combinaciones de diferentes especies bacterianas (Figura 5). En Pseudomonas G7, los operones nah y sal del plásmido NAH7 se transcriben en la misma orientación y forman parte de un transposón defectuoso que requiere la transposasa Tn4653 para su movilización (Sota et al., 2006). En la cepa NCIB9816-4 de Pseudomonas, el gen se encontró en el plásmido conjugativo pDTG1 como dos operones (con una separación aproximada de 15 kb) que se transcribieron en direcciones opuestas (Dennis y Zylstra, 2004). En la cepa AK5 de Pseudomonas putida, el plásmido no conjugativo pAK5 codifica la enzima responsable de la degradación del naftaleno mediante la vía gentisato (Izmalkova et al., 2013). En la cepa PMD-1 de Pseudomonas, el operón nah se encuentra en el cromosoma, mientras que el operón sal se encuentra en el plásmido conjugativo pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). Sin embargo, en Pseudomonas stutzeri AN10, todos los genes de degradación de naftaleno (operones nah y sal) se encuentran en el cromosoma y presumiblemente se reclutan mediante transposición, recombinación y reordenamiento (Bosch et al., 2000). En Pseudomonas sp. CSV86, los operones nah y sal se encuentran en el genoma en forma de ICE (ICECSV86). La estructura está protegida por ARNtGly, seguida de repeticiones directas que indican sitios de recombinación/unión (attR y attL) y una integrasa similar a un fago ubicada en ambos extremos de ARNtGly, por lo que es estructuralmente similar al elemento ICEclc (ICEclcB13 en Pseudomonas knackmusii para la degradación de clorocatecol). Se ha descrito que los genes en ICE pueden transferirse por conjugación con una frecuencia de transferencia extremadamente baja (10-8), transfiriendo así propiedades de degradación al receptor (Basu y Phale, 2008; Phale et al., 2019).
La mayoría de los genes responsables de la degradación del carbarilo se encuentran en plásmidos. Arthrobacter sp. RC100 contiene tres plásmidos (pRC1, pRC2 y pRC300) de los cuales dos plásmidos conjugativos, pRC1 y pRC2, codifican las enzimas que convierten el carbarilo en gentisato. Por otro lado, las enzimas implicadas en la conversión del gentisato en los metabolitos del carbono central se encuentran en el cromosoma (Hayaatsu et al., 1999). Bacterias del género Rhizobium. La cepa AC100, utilizada para la conversión del carbarilo en 1-naftol, contiene el plásmido pAC200, que porta el gen cehA que codifica CH como parte del transposón Tnceh rodeado de secuencias similares a elementos de inserción (istA e istB) (Hashimoto et al., 2002). En la cepa CF06 de Sphingomonas, se cree que el gen de degradación de carbaril está presente en cinco plásmidos: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 y pCF05. La homología de ADN de estos plásmidos es alta, lo que indica la existencia de un evento de duplicación génica (Feng et al., 1997). En un simbionte degradador de carbaril compuesto por dos especies de Pseudomonas, la cepa 50581 contiene un plásmido conjugativo pCD1 (50 kb) que codifica el gen de la carbaril hidrolasa mcd, mientras que el plásmido conjugativo de la cepa 50552 codifica una enzima degradadora de 1-naftol (Chapalamadugu y Chaudhry, 1991). En la cepa WM111 de Achromobacter, el gen de la furadan hidrolasa mcd se encuentra en un plásmido de 100 kb (pPDL11). Se ha demostrado que este gen está presente en diferentes plásmidos (100, 105, 115 o 124 kb) en diferentes bacterias de diferentes regiones geográficas (Parekh et al., 1995). En Pseudomonas sp. C5pp, todos los genes responsables de la degradación de carbarilo se encuentran en un genoma que abarca 76,3 kb de secuencia (Trivedi et al., 2016). El análisis del genoma (6,15 Mb) reveló la presencia de 42 MGE y 36 GEI, de los cuales 17 MGE se encontraban en el supercontig A (76,3 kb) con un contenido asimétrico promedio de G+C (54–60 mol%), lo que sugiere posibles eventos de transferencia horizontal de genes (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 exhibe una disposición similar de genes degradadores de carbarilo, pero estos genes se encuentran en un plásmido (Zhu et al., 2019).
Además de la eficiencia metabólica a nivel bioquímico y genómico, los microorganismos también exhiben otras propiedades o respuestas como quimiotaxis, propiedades de modificación de la superficie celular, compartimentación, utilización preferencial, producción de biosurfactantes, etc., que les ayudan a metabolizar de manera más eficiente los contaminantes aromáticos en ambientes contaminados (Figura 7).
Figura 7. Diferentes estrategias de respuesta celular de bacterias ideales degradadoras de hidrocarburos aromáticos para una biodegradación eficiente de compuestos contaminantes extraños.
Las respuestas quimiotácticas se consideran factores que mejoran la degradación de contaminantes orgánicos en ecosistemas heterogéneamente contaminados. (2002) demostraron que la quimiotaxis de Pseudomonas sp. G7 a naftaleno aumentó la tasa de degradación de naftaleno en sistemas acuáticos. La cepa de tipo silvestre G7 degradó naftaleno mucho más rápido que una cepa mutante deficiente en quimiotaxis. Se encontró que la proteína NahY (538 aminoácidos con topología de membrana) se cotranscribe con los genes de la vía de metaescisión en el plásmido NAH7 y, al igual que los transductores de quimiotaxis, esta proteína parece funcionar como un quimiorreceptor para la degradación de naftaleno (Grimm y Harwood 1997). Otro estudio de Hansel et al. (2009) mostró que la proteína es quimiotáctica, pero su tasa de degradación es alta. (2011) demostraron una respuesta quimiotáctica de Pseudomonas (P. putida) al naftaleno gaseoso, donde la difusión en fase gaseosa resultó en un flujo constante de naftaleno a las células, que controló la respuesta quimiotáctica de las células. Los investigadores explotaron este comportamiento quimiotáctico para diseñar microbios que mejorarían la tasa de degradación. Los estudios han demostrado que las vías quimiosensoriales también regulan otras funciones celulares como la división celular, la regulación del ciclo celular y la formación de biopelículas, lo que ayuda a controlar la tasa de degradación. Sin embargo, el aprovechamiento de esta propiedad (quimiotaxis) para una degradación eficiente se ve obstaculizado por varios cuellos de botella. Los principales obstáculos son: (a) diferentes receptores parálogos reconocen los mismos compuestos/ligandos; (b) existencia de receptores alternativos, es decir, tropismo energético; (c) diferencias de secuencia significativas en los dominios sensoriales de la misma familia de receptores; y (d) falta de información sobre las principales proteínas sensoras bacterianas (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). En ocasiones, la biodegradación de hidrocarburos aromáticos produce múltiples metabolitos/intermediarios, que pueden ser quimiotácticos para un grupo de bacterias, pero repulsivos para otros, lo que complica aún más el proceso. Para identificar las interacciones de ligandos (hidrocarburos aromáticos) con receptores químicos, construimos proteínas sensoras híbridas (PcaY, McfR y NahY) fusionando los dominios sensor y de señalización de Pseudomonas putida y Escherichia coli, que se dirigen a los receptores de ácidos aromáticos, intermediarios de TCA y naftaleno, respectivamente (Luu et al., 2019).
Bajo la influencia del naftaleno y otros hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), la estructura de la membrana bacteriana y la integridad de los microorganismos experimentan cambios significativos. Estudios han demostrado que el naftaleno interfiere con la interacción de la cadena acilo a través de interacciones hidrofóbicas, aumentando así la hinchazón y la fluidez de la membrana (Sikkema et al., 1995). Para contrarrestar este efecto perjudicial, las bacterias regulan la fluidez de la membrana modificando la proporción y la composición de ácidos grasos entre los ácidos grasos de cadena ramificada iso/anteiso e isomerizando los ácidos grasos cis-insaturados en los isómeros trans correspondientes (Heipieper y de Bont, 1994). En Pseudomonas stutzeri cultivada en tratamiento con naftaleno, la proporción de ácidos grasos saturados a insaturados aumentó de 1,1 a 2,1, mientras que en Pseudomonas JS150 esta proporción aumentó de 7,5 a 12,0 (Mrozik et al., 2004). Cuando se cultivaron en naftaleno, las células Achromobacter KAs 3–5 exhibieron agregación celular alrededor de los cristales de naftaleno y una disminución en la carga de la superficie celular (de -22,5 a -2,5 mV) acompañada de condensación citoplasmática y vacuolización, lo que indica cambios en la estructura celular y las propiedades de la superficie celular (Mohapatra et al., 2019). Aunque los cambios celulares/superficiales están directamente asociados con una mejor absorción de contaminantes aromáticos, las estrategias de bioingeniería relevantes no se han optimizado por completo. La manipulación de la forma celular rara vez se ha utilizado para optimizar los procesos biológicos (Volke y Nikel, 2018). La eliminación de genes que afectan la división celular causa cambios en la morfología celular. En Bacillus subtilis, se ha demostrado que la proteína del septo celular SepF está involucrada en la formación del septo y es necesaria para los pasos posteriores de la división celular, pero no es un gen esencial. La eliminación de genes que codifican hidrolasas de péptidos glicanos en Bacillus subtilis resultó en elongación celular, aumento de la tasa de crecimiento específico y mejor capacidad de producción de enzimas (Cui et al., 2018).
Se ha propuesto la compartimentación de la vía de degradación del carbarilo para lograr una degradación eficiente de las cepas C5pp y C7 de Pseudomonas (Kamini et al., 2018). Se propone que el carbarilo se transporta al espacio periplásmico a través del septo de la membrana externa o a través de porinas difusibles. CH es una enzima periplásmica que cataliza la hidrólisis del carbarilo a 1-naftol, que es más estable, más hidrofóbico y más tóxico. CH se localiza en el periplasma y tiene baja afinidad por el carbarilo, controlando así la formación de 1-naftol, previniendo así su acumulación en las células y reduciendo su toxicidad celular (Kamini et al., 2018). El 1-naftol resultante se transporta al citoplasma a través de la membrana interna mediante partición o difusión, y luego es hidroxilado a 1,2-dihidroxinaftaleno por la enzima de alta afinidad 1NH para su posterior metabolismo en la vía del carbono central.
Aunque los microorganismos tienen las capacidades genéticas y metabólicas para degradar fuentes de carbono xenobióticas, la estructura jerárquica de su utilización (es decir, uso preferencial de fuentes de carbono simples sobre complejas) es un obstáculo importante para la biodegradación. La presencia y utilización de fuentes de carbono simples regulan negativamente los genes que codifican enzimas que degradan fuentes de carbono complejas/no preferidas como los HAP. Un ejemplo bien estudiado es que cuando la glucosa y la lactosa se co-alimentan a Escherichia coli, la glucosa se utiliza de manera más eficiente que la lactosa (Jacob y Monod, 1965). Se ha informado que Pseudomonas degrada una variedad de HAP y compuestos xenobióticos como fuentes de carbono. La jerarquía de utilización de fuentes de carbono en Pseudomonas es ácidos orgánicos > glucosa > compuestos aromáticos (Hylemon y Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Sin embargo, hay una excepción. Curiosamente, Pseudomonas sp. CSV86 exhibe una estructura jerárquica única que utiliza preferentemente hidrocarburos aromáticos (ácido benzoico, naftaleno, etc.) en lugar de glucosa y cometaboliza hidrocarburos aromáticos con ácidos orgánicos (Basu et al., 2006). En esta bacteria, los genes para la degradación y el transporte de hidrocarburos aromáticos no se regulan a la baja incluso en presencia de una segunda fuente de carbono como la glucosa o los ácidos orgánicos. Cuando se cultivó en un medio de glucosa e hidrocarburos aromáticos, se observó que los genes para el transporte y el metabolismo de la glucosa se regulaban a la baja, los hidrocarburos aromáticos se utilizaban en la primera fase logarítmica y la glucosa se utilizaba en la segunda fase logarítmica (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). Por otro lado, la presencia de ácidos orgánicos no afectó la expresión del metabolismo de los hidrocarburos aromáticos, por lo que se espera que esta bacteria sea una cepa candidata para estudios de biodegradación (Phale et al., 2020).
Es bien sabido que la biotransformación de hidrocarburos puede causar estrés oxidativo y la sobreexpresión de las enzimas antioxidantes en microorganismos. La biodegradación ineficiente del naftaleno, tanto en células en fase estacionaria como en presencia de compuestos tóxicos, conduce a la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) (Kang et al., 2006). Dado que las enzimas que degradan el naftaleno contienen grupos hierro-azufre, bajo estrés oxidativo, el hierro en las proteínas hemo y hierro-azufre se oxida, lo que provoca la inactivación proteica. La ferredoxina-NADP+ reductasa (Fpr), junto con la superóxido dismutasa (SOD), media la reacción redox reversible entre NADP+/NADPH y dos moléculas de ferredoxina o flavodoxina, eliminando así las ROS y restaurando el centro hierro-azufre bajo estrés oxidativo (Li et al., 2006). Se ha informado que tanto Fpr como SodA (SOD) en Pseudomonas pueden ser inducidas por estrés oxidativo, y se observó un aumento de las actividades de SOD y catalasa en cuatro cepas de Pseudomonas (O1, W1, As1 y G1) durante el crecimiento en condiciones de adición de naftaleno (Kang et al., 2006). Los estudios han demostrado que la adición de antioxidantes como el ácido ascórbico o el hierro ferroso (Fe2+) puede aumentar la tasa de crecimiento del naftaleno. Cuando Rhodococcus erythropolis creció en medio de naftaleno, aumentó la transcripción de los genes del citocromo P450 relacionados con el estrés oxidativo, incluyendo sodA (superóxido dismutasa Fe/Mn), sodC (superóxido dismutasa Cu/Zn) y recA (Sazykin et al., 2019). El análisis proteómico cuantitativo comparativo de células de Pseudomonas cultivadas en naftaleno mostró que la regulación positiva de varias proteínas asociadas con la respuesta al estrés oxidativo es una estrategia de afrontamiento del estrés (Herbst et al., 2013).
Se ha reportado que los microorganismos producen biosurfactantes bajo la acción de fuentes de carbono hidrofóbicas. Estos surfactantes son compuestos tensioactivos anfifílicos que pueden formar agregados en las interfaces aceite-agua o aire-agua. Esto promueve la pseudosolubilización y facilita la adsorción de hidrocarburos aromáticos, resultando en una biodegradación eficiente (Rahman et al., 2002). Debido a estas propiedades, los biosurfactantes son ampliamente utilizados en diversas industrias. La adición de surfactantes químicos o biosurfactantes a cultivos bacterianos puede mejorar la eficiencia y la velocidad de degradación de hidrocarburos. Entre los biosurfactantes, los ramnolípidos producidos por Pseudomonas aeruginosa han sido ampliamente estudiados y caracterizados (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Además, otros tipos de biosurfactantes incluyen lipopéptidos (mucinas de Pseudomonas fluorescens), emulsionante 378 (de Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg y Ron, 1999), lípidos disacáridos de trehalosa de Rhodococcus (Ramdahl, 1985), liquenina de Bacillus (Saraswathy y Hallberg, 2002), y surfactante de Bacillus subtilis (Siegmund y Wagner, 1991) y Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). Se ha demostrado que estos potentes surfactantes reducen la tensión superficial de 72 dinas/cm a menos de 30 dinas/cm, lo que permite una mejor absorción de hidrocarburos. Se ha informado que Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia y otras especies bacterianas pueden producir varios biosurfactantes basados ​​en ramnolípidos y glucolípidos cuando se cultivan en medios de naftaleno y metilnaftaleno (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 puede producir el biosurfactante extracelular Biosur-Pm cuando se cultiva en compuestos aromáticos como el ácido naftoico (Phale et al., 1995). La cinética de la formación de Biosur-Pm mostró que su síntesis es un proceso dependiente del crecimiento y del pH. Se encontró que la cantidad de Biosur-Pm producida por las células a pH neutro fue mayor que a pH 8,5. Las células cultivadas a pH 8,5 fueron más hidrófobas y tuvieron mayor afinidad por los compuestos aromáticos y alifáticos que las células cultivadas a pH 7,0. En Rhodococcus spp. N6, una mayor relación carbono-nitrógeno (C:N) y la limitación de hierro son condiciones óptimas para la producción de biosurfactantes extracelulares (Mutalik et al., 2008). Se han realizado intentos para mejorar la biosíntesis de biosurfactantes (surfactinas) mediante la optimización de las cepas y la fermentación. Sin embargo, el título de surfactante en el medio de cultivo es bajo (1,0 g/L), lo que supone un reto para la producción a gran escala (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Por lo tanto, se han utilizado métodos de ingeniería genética para mejorar su biosíntesis. Sin embargo, su modificación de ingeniería es difícil debido al gran tamaño del operón (∼25 kb) y a la compleja regulación biosintética del sistema de detección de quórum (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Se han realizado diversas modificaciones de ingeniería genética en bacterias Bacillus, principalmente con el objetivo de aumentar la producción de surfactina mediante la sustitución del promotor (operón srfA), la sobreexpresión de la proteína exportadora de surfactina YerP y los factores reguladores ComX y PhrC (Jiao et al., 2017). Sin embargo, estos métodos de ingeniería genética solo han logrado una o pocas modificaciones genéticas y aún no han alcanzado la producción comercial. Por lo tanto, es necesario seguir estudiando métodos de optimización basados ​​en el conocimiento.
Los estudios de biodegradación de HAP se realizan principalmente en condiciones estándar de laboratorio. Sin embargo, en sitios o entornos contaminados, se ha demostrado que numerosos factores abióticos y bióticos (temperatura, pH, oxígeno, disponibilidad de nutrientes, biodisponibilidad del sustrato, otros xenobióticos, inhibición del producto final, etc.) alteran e influyen en la capacidad degradativa de los microorganismos.
La temperatura tiene un efecto significativo en la biodegradación de los HAP. Al aumentar la temperatura, disminuye la concentración de oxígeno disuelto, lo que afecta el metabolismo de los microorganismos aeróbicos, ya que requieren oxígeno molecular como sustrato para las oxigenasas que realizan reacciones de hidroxilación o escisión de anillos. Se observa con frecuencia que la temperatura elevada convierte los HAP originales en compuestos más tóxicos, inhibiendo así la biodegradación (Muller et al., 1998).
Se ha observado que muchos sitios contaminados con HAP presentan valores de pH extremos, como los sitios contaminados con drenaje ácido de minas (pH 1-4) y los sitios de gasificación de gas natural/carbón contaminados con lixiviados alcalinos (pH 8-12). Estas condiciones pueden afectar gravemente el proceso de biodegradación. Por lo tanto, antes de utilizar microorganismos para la biorremediación, se recomienda ajustar el pH mediante la adición de productos químicos adecuados (con un potencial de oxido-reducción de moderado a muy bajo), como sulfato de amonio o nitrato de amonio para suelos alcalinos, o encalado con carbonato de calcio o carbonato de magnesio para suelos ácidos (Bowlen et al., 1995; Gupta y Sar, 2020).
El suministro de oxígeno a la zona afectada es el factor limitante de la velocidad de biodegradación de HAP. Debido a las condiciones redox del entorno, los procesos de biorremediación in situ suelen requerir la introducción de oxígeno de fuentes externas (labranza, aspersión de aire y adición de productos químicos) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) demostraron que la adición de peróxido de magnesio (un compuesto liberador de oxígeno) a un acuífero contaminado podría biorremediar eficazmente los compuestos BTEX. Otro estudio investigó la degradación in situ de fenol y BTEX en un acuífero contaminado mediante la inyección de nitrato de sodio y la construcción de pozos de extracción para lograr una biorremediación eficaz (Bewley y Webb, 2001).