El artículo forma parte del tema de investigación “Tecnologías avanzadas de biorremediación y procesos de reciclaje de compuestos orgánicos sintéticos (COS)”. Ver los 14 artículos.
Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) de bajo peso molecular, como el naftaleno y los naftalenos sustituidos (metilnaftaleno, ácido naftoico, 1-naftil-N-metilcarbamato, etc.), se utilizan ampliamente en diversas industrias y son genotóxicos, mutagénicos y/o carcinogénicos para los organismos. Estos compuestos orgánicos sintéticos (COS) o xenobióticos se consideran contaminantes prioritarios y representan una grave amenaza para el medio ambiente global y la salud pública. La intensidad de las actividades humanas (por ejemplo, la gasificación del carbón, el refinado de petróleo, las emisiones de vehículos y las aplicaciones agrícolas) determina la concentración, el destino y el transporte de estos compuestos ubicuos y persistentes. Además de los métodos de tratamiento/eliminación físicos y químicos, las tecnologías verdes y respetuosas con el medio ambiente, como la biorremediación, que utilizan microorganismos capaces de degradar completamente los COS o convertirlos en subproductos no tóxicos, han surgido como una alternativa segura, rentable y prometedora. Diversas especies bacterianas pertenecientes a los filos Proteobacteria (Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia y Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus y Paenibacillus) y Actinobacteria (Rhodococcus y Arthrobacter) en la microbiota del suelo han demostrado la capacidad de degradar diversos compuestos orgánicos. Los estudios metabólicos, la genómica y el análisis metagenómico nos ayudan a comprender la complejidad y diversidad catabólica presentes en estas formas de vida simples, lo que puede aplicarse para una biodegradación eficiente. La presencia prolongada de HAP ha dado lugar a la aparición de nuevos fenotipos de degradación mediante transferencia horizontal de genes utilizando elementos genéticos como plásmidos, transposones, bacteriófagos, islas genómicas y elementos conjugativos integrativos. La biología de sistemas y la ingeniería genética de aislados específicos o comunidades modelo (consorcios) pueden permitir una biorremediación integral, rápida y eficiente de estos HAP mediante efectos sinérgicos. En esta revisión, nos centramos en las diferentes vías metabólicas y su diversidad, la composición y diversidad genética, y las respuestas/adaptaciones celulares de las bacterias degradadoras de naftaleno y naftaleno sustituido. Esto proporcionará información ecológica para su aplicación en campo y la optimización de cepas para una biorremediación eficiente.
El rápido desarrollo de las industrias (petroquímica, agricultura, farmacéutica, tintes textiles, cosméticos, etc.) ha contribuido a la prosperidad económica mundial y a la mejora del nivel de vida. Este desarrollo exponencial ha dado lugar a la producción de una gran cantidad de compuestos orgánicos sintéticos (COS), que se utilizan en la fabricación de diversos productos. Estos compuestos extraños o COS incluyen hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), pesticidas, herbicidas, plastificantes, colorantes, productos farmacéuticos, organofosforados, retardantes de llama, disolventes orgánicos volátiles, etc. Se emiten a la atmósfera y a los ecosistemas acuáticos y terrestres, donde tienen impactos multidimensionales, causando efectos perjudiciales en diversas formas biológicas mediante la alteración de las propiedades fisicoquímicas y la estructura de la comunidad (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Muchos contaminantes aromáticos tienen impactos fuertes y destructivos en muchos ecosistemas intactos/puntos críticos de biodiversidad (p. ej., arrecifes de coral, capas de hielo árticas/antárticas, lagos de alta montaña, sedimentos de aguas profundas, etc.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Estudios geomicrobiológicos recientes han demostrado que la deposición de materia orgánica sintética (p. ej., contaminantes aromáticos) y sus derivados en las superficies de estructuras artificiales (entorno construido) (p. ej., sitios de patrimonio cultural y monumentos hechos de granito, piedra, madera y metal) acelera su degradación (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Las actividades humanas pueden intensificar y empeorar la degradación biológica de monumentos y edificios a través de la contaminación del aire y el cambio climático (Liu et al. 2020). Estos contaminantes orgánicos reaccionan con el vapor de agua en la atmósfera y se depositan en la estructura, causando la degradación física y química del material. La biodegradación se reconoce ampliamente como cambios indeseables en la apariencia y propiedades de los materiales causados ​​por organismos vivos que afectan su preservación (Pochon y Jaton, 1967). La acción microbiana adicional (metabolismo) de estos compuestos puede reducir la integridad estructural, la efectividad de la conservación y el valor cultural (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). Por otro lado, en algunos casos, se ha encontrado que la adaptación y respuesta microbiana a estas estructuras es beneficiosa, ya que forman biopelículas y otras costras protectoras que reducen la tasa de descomposición (Martino, 2016). Por lo tanto, el desarrollo de estrategias de conservación sostenibles a largo plazo para monumentos de piedra, metal y madera requiere una comprensión profunda de los procesos clave involucrados en este proceso. En comparación con los procesos naturales (procesos geológicos, incendios forestales, erupciones volcánicas, reacciones de plantas y bacterias), las actividades humanas resultan en la liberación de grandes volúmenes de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) y otro carbono orgánico (CO) en los ecosistemas. Muchos HAP utilizados en la agricultura (insecticidas y pesticidas como DDT, atrazina, carbaril, pentaclorofenol, etc.), la industria (petróleo crudo, lodos/residuos de petróleo, plásticos derivados del petróleo, PCB, plastificantes, detergentes, desinfectantes, fumigantes, fragancias y conservantes), productos de cuidado personal (protectores solares, desinfectantes, repelentes de insectos y almizcles policíclicos) y municiones (explosivos como el 2,4,6-TNT) son xenobióticos potenciales que pueden afectar la salud del planeta (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna y Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Esta lista puede ampliarse para incluir compuestos derivados del petróleo (combustibles, lubricantes, asfaltenos), bioplásticos de alto peso molecular y líquidos iónicos (Amde et al., 2015). La Tabla 1 enumera varios contaminantes aromáticos y sus aplicaciones en diversas industrias. En los últimos años, las emisiones antropogénicas de compuestos orgánicos volátiles, así como de dióxido de carbono y otros gases de efecto invernadero, han comenzado a aumentar (Dvorak et al., 2017). Sin embargo, los impactos antropogénicos superan significativamente a los naturales. Además, encontramos que varios SOC persisten en muchos entornos ambientales y han sido identificados como contaminantes emergentes con efectos adversos en los biomas (Figura 1). Agencias ambientales como la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (USEPA) han incluido muchos de estos contaminantes en su lista de prioridades debido a sus propiedades citotóxicas, genotóxicas, mutagénicas y carcinogénicas. Por lo tanto, se necesitan regulaciones estrictas de eliminación y estrategias efectivas para el tratamiento/eliminación de residuos de ecosistemas contaminados. Varios métodos de tratamiento físico y químico, como la pirólisis, el tratamiento térmico oxidativo, la aireación, el relleno sanitario, la incineración, etc., son ineficaces y costosos, y generan subproductos corrosivos, tóxicos y difíciles de tratar. Con la creciente conciencia ambiental global, los microorganismos capaces de degradar estos contaminantes y sus derivados (como halogenados, nitro, alquilo y/o metilo) están atrayendo cada vez más atención (Fennell et al., 2004; Haritash y Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). El uso de estos microorganismos candidatos autóctonos, solos o en cultivos mixtos (colonias), para la eliminación de contaminantes aromáticos presenta ventajas en términos de seguridad ambiental, costo, eficiencia, efectividad y sostenibilidad. Los investigadores también están explorando la integración de procesos microbianos con métodos redox electroquímicos, es decir, sistemas bioelectroquímicos (BES), como una tecnología prometedora para el tratamiento/eliminación de contaminantes (Huang et al., 2011). La tecnología BES ha atraído una atención creciente debido a su alta eficiencia, bajo costo, seguridad ambiental, operación a temperatura ambiente, materiales biocompatibles y la capacidad de recuperar subproductos valiosos (por ejemplo, electricidad, combustible y productos químicos) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). El advenimiento de la secuenciación genómica de alto rendimiento y las herramientas/métodos ómicos ha proporcionado una gran cantidad de información nueva sobre la regulación genética, la proteómica y la fluxómica de las reacciones de varios microorganismos degradadores. La combinación de estas herramientas con la biología de sistemas ha mejorado aún más nuestra comprensión de la selección y el ajuste fino de las vías catabólicas objetivo en los microorganismos (es decir, el diseño metabólico) para lograr una biodegradación eficiente y efectiva. Para diseñar estrategias de biorremediación efectivas utilizando microorganismos candidatos adecuados, necesitamos comprender el potencial bioquímico, la diversidad metabólica, la composición genética y la ecología (autoecología/sinecología) de los microorganismos.
Figura 1. Fuentes y vías de los HAP de bajo peso molecular a través de diversos entornos ambientales y diversos factores que afectan a la biota. Las líneas discontinuas representan las interacciones entre los elementos del ecosistema.
En esta revisión, hemos intentado resumir los datos sobre la degradación de HAP simples, como el naftaleno y los naftalenos sustituidos, por diversos aislados bacterianos, abarcando las vías metabólicas y la diversidad, las enzimas implicadas en la degradación, la composición y diversidad genética, las respuestas celulares y diversos aspectos de la biorremediación. La comprensión de los niveles bioquímicos y moleculares ayudará a identificar cepas huésped adecuadas y a su posterior ingeniería genética para la biorremediación eficaz de estos contaminantes prioritarios. Esto contribuirá al desarrollo de estrategias para el establecimiento de consorcios bacterianos específicos para cada sitio, con el fin de lograr una biorremediación eficaz.
La presencia de un gran número de compuestos aromáticos tóxicos y peligrosos (que cumplen la regla de Hückel con 4n + 2π electrones, n = 1, 2, 3, …) supone una seria amenaza para diversos medios ambientales como el aire, el suelo, los sedimentos y las aguas superficiales y subterráneas (Puglisi et al., 2007). Estos compuestos poseen anillos de benceno simples (monocíclicos) o múltiples (policíclicos) dispuestos en forma lineal, angular o en clúster, y presentan estabilidad (estabilidad/inestabilidad) en el medio ambiente debido a su alta energía de resonancia negativa e inercia (inercia), lo que puede explicarse por su hidrofobicidad y estado reducido. Cuando el anillo aromático se reemplaza aún más por grupos metilo (-CH3), carboxilo (-COOH), hidroxilo (-OH) o sulfonato (-HSO3), se vuelve más estable, tiene una mayor afinidad por las macromoléculas y es bioacumulativo en sistemas biológicos (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Algunos hidrocarburos aromáticos policíclicos de bajo peso molecular (HAPM), como el naftaleno y sus derivados [metilnaftaleno, ácido naftoico, naftalenosulfonato y 1-naftil N-metilcarbamato (carbaril)], han sido incluidos en la lista de contaminantes orgánicos prioritarios por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos como genotóxicos, mutagénicos y/o carcinogénicos (Cerniglia, 1984). La liberación de esta clase de NM-PAH al medio ambiente puede provocar la bioacumulación de estos compuestos en todos los niveles de la cadena alimentaria, afectando así la salud de los ecosistemas (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
Las fuentes y vías de los HAP hacia la biota se producen principalmente a través de la migración y las interacciones entre diferentes componentes del ecosistema, como el suelo, el agua subterránea, el agua superficial, los cultivos y la atmósfera (Arey y Atkinson, 2003). La Figura 1 muestra las interacciones y la distribución de diferentes HAP de bajo peso molecular en los ecosistemas y sus vías de exposición a la biota/humanidad. Los HAP se depositan en las superficies como resultado de la contaminación atmosférica y a través de la migración (deriva) de las emisiones de vehículos, los gases de escape industriales (gasificación del carbón, combustión y producción de coque) y su deposición. Las actividades industriales como la fabricación de textiles sintéticos, tintes y pinturas; la conservación de la madera; el procesamiento del caucho; las actividades de fabricación de cemento; la producción de plaguicidas; y las aplicaciones agrícolas son fuentes importantes de HAP en los sistemas terrestres y acuáticos (Bamforth y Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Estudios han demostrado que los suelos en áreas suburbanas y urbanas, cerca de autopistas y en grandes ciudades son más susceptibles a los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) debido a las emisiones de centrales eléctricas, calefacción residencial, cargas de tráfico aéreo y vial, y actividades de construcción (Suman et al., 2016). (2008) mostró que los HAP en el suelo cerca de carreteras en Nueva Orleans, Luisiana, EE. UU. eran tan altos como 7189 μg/kg, mientras que en espacios abiertos, eran solo 2404 μg/kg. De manera similar, se han reportado niveles de HAP tan altos como 300 μg/kg en áreas cercanas a sitios de gasificación de carbón en varias ciudades de EE. UU. (Kanaly y Harayama, 2000; Bamforth y Singleton, 2005). Se ha informado que los suelos de varias ciudades indias, como Delhi (Sharma et al., 2008), Agra (Dubey et al., 2014), Mumbai (Kulkarni y Venkataraman, 2000) y Visakhapatnam (Kulkarni et al., 2014), contienen altas concentraciones de HAP. Los compuestos aromáticos se adsorben más fácilmente en las partículas del suelo, la materia orgánica y los minerales arcillosos, convirtiéndose así en importantes sumideros de carbono en los ecosistemas (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). Las principales fuentes de HAP en los ecosistemas acuáticos son la precipitación (húmeda/seca y vapor de agua), la escorrentía urbana, la descarga de aguas residuales, la recarga de aguas subterráneas, etc. (Srogi, 2007). Se estima que alrededor del 80% de los HAP en los ecosistemas marinos provienen de la precipitación, la sedimentación y la descarga de desechos (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Las concentraciones más altas de HAP en aguas superficiales o lixiviados de sitios de eliminación de desechos sólidos eventualmente se filtran a las aguas subterráneas, lo que representa una importante amenaza para la salud pública ya que más del 70% de la población en el sur y sureste de Asia bebe agua subterránea (Duttagupta et al., 2019). Un estudio reciente de Duttagupta et al. (2020) de análisis de ríos (32) y aguas subterráneas (235) de Bengala Occidental, India, encontró que se estima que el 53% de los residentes urbanos y el 44% de los residentes rurales (un total de 20 millones de residentes) pueden estar expuestos al naftaleno (4,9–10,6 μg/L) y sus derivados. Los patrones de uso diferencial del suelo y el aumento de la extracción de agua subterránea se consideran los principales factores que controlan el transporte vertical (advección) de HAP de bajo peso molecular en el subsuelo. Se ha observado que la escorrentía agrícola, las descargas de aguas residuales municipales e industriales y las descargas de residuos sólidos/basura se ven afectadas por los HAP en las cuencas fluviales y los sedimentos subsuperficiales. La precipitación atmosférica agrava aún más la contaminación por HAP. Se han reportado altas concentraciones de HAP y sus derivados alquílicos (51 en total) en ríos/cuencas hidrográficas de todo el mundo, como el río Fraser, el río Louan, el río Denso, el río Missouri, el río Anacostia, el río Ebro y el río Delaware (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). En los sedimentos de la cuenca del río Ganges, el naftaleno y el fenantreno fueron los más significativos (detectados en el 70% de las muestras) (Duttagupta et al., 2019). Además, estudios han demostrado que la cloración del agua potable puede conducir a la formación de HAP oxigenados y clorados más tóxicos (Manoli y Samara, 1999). Los HAP se acumulan en cereales, frutas y verduras como resultado de la absorción por las plantas de suelos contaminados, aguas subterráneas y precipitaciones (Fismes et al., 2002). Muchos organismos acuáticos como peces, mejillones, almejas y camarones se contaminan con HAP a través del consumo de alimentos y agua de mar contaminados, así como a través de tejidos y piel (Mackay y Fraser, 2000). Los métodos de cocción/procesamiento como asar a la parrilla, rostizar, ahumar, freír, secar, hornear y cocinar con carbón también pueden generar cantidades significativas de HAP en los alimentos. Esto depende en gran medida de la elección del material de ahumado, el contenido de hidrocarburos fenólicos/aromáticos, el procedimiento de cocción, el tipo de calentador, el contenido de humedad, el suministro de oxígeno y la temperatura de combustión (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). También se han detectado hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) en la leche en concentraciones variables (0,75–2,1 mg/L) (Girelli et al., 2014). La acumulación de estos HAP en los alimentos también depende de las propiedades fisicoquímicas de los mismos, mientras que sus efectos tóxicos están relacionados con las funciones fisiológicas, la actividad metabólica, la absorción, la distribución y la distribución corporal (Mechini et al., 2011).
La toxicidad y los efectos nocivos de los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) se conocen desde hace mucho tiempo (Cherniglia, 1984). Los hidrocarburos aromáticos policíclicos de bajo peso molecular (HAP-BM) (de dos a tres anillos) pueden unirse covalentemente a diversas macromoléculas como el ADN, el ARN y las proteínas, y son carcinogénicos (Santarelli et al., 2008). Debido a su naturaleza hidrofóbica, se encuentran separados por membranas lipídicas. En los seres humanos, las monooxigenasas del citocromo P450 oxidan los HAP a epóxidos, algunos de los cuales son altamente reactivos (p. ej., epóxido de baediol) y pueden provocar la transformación de células normales en malignas (Marston et al., 2001). Además, los productos de transformación de los HAP, como quinonas, fenoles, epóxidos, dioles, etc., son más tóxicos que los compuestos originales. Algunos HAP y sus intermediarios metabólicos pueden afectar las hormonas y diversas enzimas del metabolismo, afectando así negativamente el crecimiento, el sistema nervioso central, el sistema reproductivo y el sistema inmunitario (Swetha y Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). Se ha informado que la exposición a corto plazo a HAP de bajo peso molecular causa deterioro de la función pulmonar y trombosis en asmáticos y aumenta el riesgo de cánceres de piel, pulmón, vejiga y gastrointestinales (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Estudios en animales también han demostrado que la exposición a HAP puede tener efectos adversos en la función y el desarrollo reproductivo y puede causar cataratas, daño renal y hepático e ictericia. Se ha demostrado que varios productos de biotransformación de HAP, como dioles, epóxidos, quinonas y radicales libres (cationes), forman aductos de ADN. Se ha demostrado que los aductos estables alteran la maquinaria de replicación del ADN, mientras que los aductos inestables pueden despurinar el ADN (principalmente a adenina y a veces a guanina); ambos pueden generar errores que conducen a mutaciones (Schweigert et al. 2001). Además, las quinonas (benzo-/pan-) pueden generar especies reactivas de oxígeno (ROS), causando daños fatales al ADN y otras macromoléculas, afectando así la función/viabilidad de los tejidos (Ewa y Danuta 2017). Se ha informado que la exposición crónica a bajas concentraciones de pireno, bifenilo y naftaleno causa cáncer en animales de experimentación (Diggs et al. 2012). Debido a su toxicidad letal, la limpieza/eliminación de estos HAP de los sitios afectados/contaminados es una prioridad.
Se han utilizado diversos métodos físicos y químicos para eliminar los HAP de sitios y entornos contaminados. Procesos como la incineración, la decloración, la oxidación UV, la fijación y la extracción con solventes presentan numerosas desventajas, entre ellas la formación de subproductos tóxicos, la complejidad del proceso, problemas de seguridad y normativos, baja eficiencia y alto costo. Sin embargo, la biodegradación microbiana (denominada biorremediación) es una alternativa prometedora que implica el uso de microorganismos en forma de cultivos puros o colonias. En comparación con los métodos físicos y químicos, este proceso es respetuoso con el medio ambiente, no invasivo, rentable y sostenible. La biorremediación puede llevarse a cabo en el sitio afectado (in situ) o en un sitio especialmente preparado (ex situ) y, por lo tanto, se considera un método de remediación más sostenible que los métodos físicos y químicos tradicionales (Juhasz y Naidu, 2000; Andreoni y Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
Comprender los pasos metabólicos microbianos involucrados en la degradación de contaminantes aromáticos tiene enormes implicaciones científicas y económicas para la sostenibilidad ecológica y ambiental. Se estima que 2,1 × 10¹⁸ gramos de carbono (C) se almacenan en sedimentos y compuestos orgánicos (es decir, petróleo, gas natural y carbón, es decir, combustibles fósiles) en todo el mundo, lo que contribuye significativamente al ciclo global del carbono. Sin embargo, la rápida industrialización, la extracción de combustibles fósiles y las actividades humanas están agotando estas reservas de carbono litosférico, liberando anualmente a la atmósfera unos 5,5 × 10¹⁵ g de carbono orgánico (en forma de contaminantes) (Gonzalez-Gaya et al., 2019). La mayor parte de este carbono orgánico ingresa a los ecosistemas terrestres y marinos a través de la sedimentación, el transporte y la escorrentía. Además, los nuevos contaminantes sintéticos derivados de combustibles fósiles, como los plásticos, los plastificantes y los estabilizadores de plásticos (ftalatos y sus isómeros), contaminan gravemente los ecosistemas marinos, terrestres y acuáticos y su biota, exacerbando así los riesgos climáticos globales. Diversos tipos de microplásticos, nanoplásticos, fragmentos de plástico y sus productos monoméricos tóxicos derivados del tereftalato de polietileno (PET) se han acumulado en el Océano Pacífico entre América del Norte y el Sudeste Asiático, formando la "Gran Mancha de Basura del Pacífico" y dañando la vida marina (Newell et al., 2020). Estudios científicos han demostrado que no es posible eliminar estos contaminantes/residuos mediante métodos físicos o químicos. En este contexto, los microorganismos más útiles son aquellos capaces de metabolizar oxidativamente los contaminantes en dióxido de carbono, energía química y otros subproductos no tóxicos que finalmente se incorporan a otros procesos de ciclo de nutrientes (H, O, N, S, P, Fe, etc.). Por lo tanto, comprender la ecofisiología microbiana de la mineralización de contaminantes aromáticos y su control ambiental es crucial para evaluar el ciclo del carbono microbiano, el balance neto de carbono y los riesgos climáticos futuros. Dada la urgente necesidad de eliminar estos compuestos del medio ambiente, han surgido diversas ecoindustrias centradas en tecnologías limpias. Como alternativa, la valorización de los residuos industriales y químicos acumulados en los ecosistemas (es decir, el enfoque de conversión de residuos en recursos) se considera uno de los pilares de la economía circular y los objetivos de desarrollo sostenible (Close et al., 2012). Por lo tanto, comprender los aspectos metabólicos, enzimáticos y genéticos de estos posibles agentes de degradación es fundamental para la eliminación y biorremediación efectivas de dichos contaminantes aromáticos.
Entre los numerosos contaminantes aromáticos, prestamos especial atención a los HAP de bajo peso molecular, como el naftaleno y los naftalenos sustituidos. Estos compuestos son componentes principales de combustibles derivados del petróleo, tintes textiles, productos de consumo, pesticidas (bolas de naftalina y repelentes de insectos), plastificantes y taninos, y por lo tanto están ampliamente distribuidos en muchos ecosistemas (Preuss et al., 2003). Informes recientes destacan la acumulación de concentraciones de naftaleno en sedimentos de acuíferos, aguas subterráneas y suelos subsuperficiales, zonas vadosas y lechos de ríos, lo que sugiere su bioacumulación en el medio ambiente (Duttagupta et al., 2019, 2020). La Tabla 2 resume las propiedades fisicoquímicas, las aplicaciones y los efectos en la salud del naftaleno y sus derivados. En comparación con otros HAP de alto peso molecular, el naftaleno y sus derivados son menos hidrofóbicos, más solubles en agua y se encuentran ampliamente distribuidos en los ecosistemas, por lo que se utilizan frecuentemente como sustratos modelo para estudiar el metabolismo, la genética y la diversidad metabólica de los HAP. Un gran número de microorganismos son capaces de metabolizar el naftaleno y sus derivados, y se dispone de información exhaustiva sobre sus rutas metabólicas, enzimas y mecanismos de regulación (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Además, el naftaleno y sus derivados se consideran compuestos prototipo para la evaluación de la contaminación ambiental debido a su alta abundancia y biodisponibilidad. La Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos estima que los niveles promedio de naftaleno son de 5,19 μg por metro cúbico provenientes del humo del cigarrillo, principalmente de la combustión incompleta, y de 7,8 a 46 μg del humo secundario, mientras que la exposición a la creosota y al naftaleno es de 100 a 10 000 veces mayor (Preuss et al. 2003). Se ha descubierto que el naftaleno en particular tiene toxicidad respiratoria y carcinogenicidad específicas de especie, región y sexo. Con base en estudios en animales, la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC) ha clasificado el naftaleno como un “posible carcinógeno humano” (Grupo 2B)1. La exposición a naftalenos sustituidos, principalmente por inhalación o administración parenteral (oral), causa daño al tejido pulmonar y aumenta la incidencia de tumores pulmonares en ratas y ratones (Programa Nacional de Toxicología 2). Los efectos agudos incluyen náuseas, vómitos, dolor abdominal, diarrea, dolor de cabeza, confusión, sudoración profusa, fiebre, taquicardia, etc. Por otro lado, se ha informado que el insecticida carbamato de amplio espectro carbaryl (1-naftil N-metilcarbamato) es tóxico para invertebrados acuáticos, anfibios, abejas y humanos, y se ha demostrado que inhibe la acetilcolinesterasa causando parálisis (Smulders et al., 2003; Bulen y Distel, 2011). Por lo tanto, comprender los mecanismos de degradación microbiana, la regulación genética y las reacciones enzimáticas y celulares es crucial para desarrollar estrategias de biorremediación en ambientes contaminados.
Tabla 2. Información detallada sobre las propiedades fisicoquímicas, usos, métodos de identificación y enfermedades asociadas del naftaleno y sus derivados.
En nichos contaminados, los contaminantes aromáticos hidrofóbicos y lipofílicos pueden causar diversos efectos celulares en el microbioma ambiental (comunidad), como cambios en la fluidez y permeabilidad de la membrana, hinchazón de la bicapa lipídica, interrupción de la transferencia de energía (cadena de transporte de electrones/fuerza motriz de protones) y actividad de las proteínas asociadas a la membrana (Sikkema et al., 1995). Además, algunos intermediarios solubles, como los catecoles y las quinonas, generan especies reactivas de oxígeno (ROS) y forman aductos con el ADN y las proteínas (Penning et al., 1999). Por lo tanto, la abundancia de estos compuestos en los ecosistemas ejerce una presión selectiva sobre las comunidades microbianas para que se conviertan en degradadores eficientes en diversos niveles fisiológicos, incluyendo la absorción/transporte, la transformación intracelular, la asimilación/utilización y la compartimentalización.
Una búsqueda en el Proyecto de Base de Datos Ribosómica II (RDP-II) reveló que se aislaron un total de 926 especies bacterianas de medios o cultivos de enriquecimiento contaminados con naftaleno o sus derivados. El grupo Proteobacteria tuvo el mayor número de representantes (n = 755), seguido de Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) y bacterias no clasificadas (8) (Figura 2). Los representantes de γ-Proteobacteria (Pseudomonadales y Xanthomonadales) dominaron todos los grupos Gram-negativos con alto contenido de G+C (54%), mientras que Clostridiales y Bacillales (30%) fueron grupos Gram-positivos con bajo contenido de G+C. Se ha informado que las especies de Pseudomonas (con el mayor número, 338 especies) son capaces de degradar el naftaleno y sus derivados metílicos en diversos ecosistemas contaminados (alquitrán de hulla, petróleo, crudo, lodos, derrames de petróleo, aguas residuales, residuos orgánicos y vertederos), así como en ecosistemas intactos (suelo, ríos, sedimentos y aguas subterráneas) (Figura 2). Además, estudios de enriquecimiento y análisis metagenómicos de algunas de estas regiones revelaron que especies no cultivadas de Legionella y Clostridium podrían tener capacidad degradativa, lo que indica la necesidad de cultivar estas bacterias para estudiar nuevas rutas metabólicas y la diversidad metabólica.
Figura 2. Diversidad taxonómica y distribución ecológica de representantes bacterianos en ambientes contaminados con naftaleno y derivados del naftaleno.
Entre los diversos microorganismos degradadores de hidrocarburos aromáticos, la mayoría son capaces de degradar el naftaleno como única fuente de carbono y energía. La secuencia de eventos involucrados en el metabolismo del naftaleno ha sido descrita para Pseudomonas sp. (cepas: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 y CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 y otras cepas (ND6 y AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis y Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; El metabolismo se inicia mediante una dioxigenasa multicomponente [naftaleno dioxigenasa (NDO), una dioxigenasa hidroxilante de anillo] que cataliza la oxidación de uno de los anillos aromáticos del naftaleno utilizando oxígeno molecular como otro sustrato, convirtiendo el naftaleno en cis-naftalenodiol (Figura 3). El cis-dihidrodiol se convierte en 1,2-dihidroxinaftaleno por una deshidrogenasa. Una dioxigenasa que escinde el anillo, la 1,2-dihidroxinaftaleno dioxigenasa (12DHNDO), convierte el 1,2-dihidroxinaftaleno en ácido 2-hidroxicromeno-2-carboxílico. La isomerización cis-trans enzimática produce trans-o-hidroxibencilidenopiruvato, que es escindido por la aldolasa hidratasa en aldehído salicílico y piruvato. El ácido orgánico piruvato fue el primer compuesto C3 derivado del esqueleto de carbono del naftaleno y dirigido a la vía central del carbono. Además, la salicilaldehído deshidrogenasa dependiente de NAD+ convierte el salicilaldehído en ácido salicílico. El metabolismo en esta etapa se denomina la "vía superior" de degradación del naftaleno. Esta vía es muy común en la mayoría de las bacterias degradadoras de naftaleno. Sin embargo, existen algunas excepciones; por ejemplo, en la bacteria termófila Bacillus hamburgii 2, la degradación del naftaleno se inicia mediante naftaleno 2,3-dioxigenasa para formar 2,3-dihidroxinaftaleno (Annweiler et al., 2000).
Figura 3. Rutas de degradación de naftaleno, metilnaftaleno, ácido naftoico y carbaril. Los números encerrados en círculos representan las enzimas responsables de la conversión secuencial de naftaleno y sus derivados en productos subsiguientes. 1 — naftaleno dioxigenasa (NDO); 2, cis-dihidrodiol deshidrogenasa; 3, 1,2-dihidroxinaftaleno dioxigenasa; 4, 2-hidroxicromeno-2-ácido carboxílico isomerasa; 5, trans-O-hidroxibencilidenopiruvato hidratasa aldolasa; 6, salicilaldehído deshidrogenasa; 7, salicilato 1-hidroxilasa; 8, catecol 2,3-dioxigenasa (C23DO); 9, 2-hidroximuconato semialdehído deshidrogenasa; 10, 2-oxopent-4-enoato hidratasa; 11, 4-hidroxi-2-oxopentanoato aldolasa; 12, acetaldehído deshidrogenasa; 13, catecol-1,2-dioxigenasa (C12DO); 14, muconato cicloisomerasa; 15, muconolactona delta-isomerasa; 16, β-cetoadipatenolactona hidrolasa; 17, β-cetoadipato succinil-CoA transferasa; 18, β-cetoadipato-CoA tiolasa; 19, succinil-CoA: acetil-CoA succiniltransferasa; 20, salicilato 5-hidroxilasa; 21 – gentisato 1,2-dioxigenasa (GDO); 22, maleilpiruvato isomerasa; 23, fumarilpiruvato hidrolasa; 24, metilnaftaleno hidroxilasa (NDO); 25, hidroximetilnaftaleno deshidrogenasa; 26, naftaldehído deshidrogenasa; 27, 3-formilsalicílico oxidasa; 28, hidroxiisoftalato descarboxilasa; 29, carbaryl hidrolasa (CH); 30, 1-naftol-2-hidroxilasa.
Dependiendo del organismo y su composición genética, el ácido salicílico resultante se metaboliza posteriormente a través de la vía del catecol mediante la salicilato 1-hidroxilasa (S1H) o a través de la vía del gentisato mediante la salicilato 5-hidroxilasa (S5H) (Figura 3). Dado que el ácido salicílico es el principal intermediario en el metabolismo del naftaleno (vía superior), los pasos desde el ácido salicílico hasta el intermediario del ciclo de Krebs se denominan a menudo vía inferior, y los genes se organizan en un único operón. Es común observar que los genes del operón de la vía superior (nah) y del operón de la vía inferior (sal) están regulados por factores reguladores comunes; por ejemplo, NahR y el ácido salicílico actúan como inductores, lo que permite que ambos operones metabolicen completamente el naftaleno (Phale et al., 2019, 2020).
Además, el catecol se escinde cíclicamente a 2-hidroximuconato semialdehído a través de la vía meta por la catecol 2,3-dioxigenasa (C23DO) (Yen et al., 1988) y se hidroliza aún más por la 2-hidroximuconato semialdehído hidrolasa para formar ácido 2-hidroxipent-2,4-dienoico. El 2-hidroxipent-2,4-dienoato se convierte luego en piruvato y acetaldehído por una hidratasa (2-oxopent-4-enoato hidratasa) y una aldolasa (4-hidroxi-2-oxopentanoato aldolasa) y luego entra en la vía del carbono central (Figura 3). Alternativamente, el catecol se escinde cíclicamente a cis,cis-muconato a través de la vía orto por la catecol 1,2-oxigenasa (C12DO). La muconato cicloisomerasa, la muconolactona isomerasa y la β-cetoadipato-nolactona hidrolasa convierten el cis,cis-muconato en 3-oxoadipato, que entra en la vía central del carbono a través de succinil-CoA y acetil-CoA (Nozaki et al., 1968) (Figura 3).
En la vía del gentisato (2,5-dihidroxibenzoato), el anillo aromático es escindido por la gentisato 1,2-dioxigenasa (GDO) para formar maleilpiruvato. Este producto puede hidrolizarse directamente a piruvato y malato, o puede isomerizarse para formar fumarilpiruvato, que luego puede hidrolizarse a piruvato y fumarato (Larkin y Day, 1986). La elección de la vía alternativa se ha observado tanto en bacterias Gram negativas como Gram positivas a nivel bioquímico y genético (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). Las bacterias Gram negativas (Pseudomonas) prefieren usar ácido salicílico, que es un inductor del metabolismo del naftaleno, descarboxilándolo a catecol usando salicilato 1-hidroxilasa (Gibson y Subramanian, 1984). Por otro lado, en bacterias Gram positivas (Rhodococcus), la salicilato 5-hidroxilasa convierte el ácido salicílico en ácido gentísico, mientras que el ácido salicílico no tiene ningún efecto inductivo sobre la transcripción de los genes del naftaleno (Grund et al., 1992) (Figura 3).
Se ha informado que especies como Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas y especies de Mycobacterium pueden degradar monometilnaftaleno o dimetilnaftaleno (Dean-Raymond y Bartha, 1975; Cane y Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Entre ellas, la vía de degradación de 1-metilnaftaleno y 2-metilnaftaleno de Pseudomonas sp. CSV86 se ha estudiado claramente a nivel bioquímico y enzimático (Mahajan et al., 1994). El 1-metilnaftaleno se metaboliza a través de dos vías. Primero, el anillo aromático se hidroxila (el anillo no sustituido del metilnaftaleno) para formar cis-1,2-dihidroxi-1,2-dihidro-8-metilnaftaleno, que luego se oxida a salicilato de metilo y metilcatecol, y luego ingresa a la vía central del carbono después de la ruptura del anillo (Figura 3). Esta vía se llama "vía de la fuente de carbono". En la segunda "vía de desintoxicación", el grupo metilo puede ser hidroxilado por NDO para formar 1-hidroximetilnaftaleno, que luego se oxida a ácido 1-naftoico y se excreta al medio de cultivo como un producto final. Los estudios han demostrado que la cepa CSV86 es incapaz de crecer en ácido 1- y 2-naftoico como única fuente de carbono y energía, lo que confirma su vía de desintoxicación (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). En el 2-metilnaftaleno, el grupo metilo sufre hidroxilación por acción de la hidroxilasa para formar 2-hidroximetilnaftaleno. Además, el anillo no sustituido del anillo de naftaleno sufre hidroxilación del anillo para formar un dihidrodiol, que se oxida a 4-hidroximetilcatecol en una serie de reacciones catalizadas por enzimas y entra en la vía del carbono central a través de la vía de escisión del anillo meta. De manera similar, se informó que S. paucimobilis 2322 utiliza NDO para hidroxilar el 2-metilnaftaleno, que posteriormente se oxida para formar salicilato de metilo y metilcatecol (Dutta et al., 1998).
Los ácidos naftoicos (sustituidos/no sustituidos) son subproductos de desintoxicación/biotransformación que se forman durante la degradación del metilnaftaleno, el fenantreno y el antraceno, y se liberan en el medio de cultivo agotado. Se ha informado que el aislado de suelo Stenotrophomonas maltophilia CSV89 es capaz de metabolizar el ácido 1-naftoico como fuente de carbono (Phale et al., 1995). El metabolismo comienza con la dihidroxilación del anillo aromático para formar 1,2-dihidroxi-8-carboxinaftaleno. El diol resultante se oxida a catecol a través de 2-hidroxi-3-carboxibencilidenopiruvato, ácido 3-formilsalicílico, ácido 2-hidroxiisoftálico y ácido salicílico, y entra en la vía central del carbono a través de la vía de ruptura del anillo meta (Figura 3).
El carbaryl es un pesticida de carbamato de naftilo. Desde la Revolución Verde en la India en la década de 1970, el uso de fertilizantes y pesticidas químicos ha provocado un aumento en las emisiones de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) de fuentes agrícolas difusas (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Se estima que el 55 % (85.722.000 hectáreas) del total de tierras de cultivo en la India se tratan con pesticidas químicos. Durante los últimos cinco años (2015-2020), el sector agrícola indio ha utilizado un promedio de 55.000 a 60.000 toneladas de pesticidas anualmente (Departamento de Cooperativas y Bienestar de los Agricultores, Ministerio de Agricultura, Gobierno de la India, agosto de 2020). En las llanuras del Ganges del norte y centro (los estados con mayor población y densidad de población), el uso de pesticidas en los cultivos está muy extendido, predominando los insecticidas. El carbaryl (1-naftil-N-metilcarbamato) es un insecticida carbamato de amplio espectro, de toxicidad moderada a alta, utilizado en la agricultura india a una dosis promedio de 100 a 110 toneladas. Se vende comúnmente con el nombre comercial Sevin y se utiliza para controlar insectos (pulgones, hormigas rojas, pulgas, ácaros, arañas y muchas otras plagas de exterior) que afectan a diversos cultivos (maíz, soja, algodón, frutas y verduras). Algunos microorganismos como Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus y Arthrobacter también pueden utilizarse para controlar otras plagas. Se ha informado que RC100 puede degradar carbaryl (Larkin y Day, 1986; Chapalamadugu y Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha y Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). La vía de degradación de carbaryl se ha estudiado extensamente a nivel bioquímico, enzimático y genético en aislados de suelo de Pseudomonas sp. Cepas C4, C5 y C6 (Swetha y Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (Fig. 3). La vía metabólica comienza con la hidrólisis del enlace éster por la carbaryl hidrolasa (CH) para formar 1-naftol, metilamina y dióxido de carbono. El 1-naftol se convierte en 1,2-dihidroxinaftaleno por acción de la 1-naftol hidroxilasa (1-NH), que posteriormente se metaboliza a través de la vía del carbono central mediante salicilato y gentisato. Se ha observado que algunas bacterias degradadoras de carbarilo lo metabolizan a ácido salicílico mediante la ruptura del anillo orto del catecol (Larkin y Day, 1986; Chapalamadugu y Chaudhry, 1991). Cabe destacar que las bacterias degradadoras de naftaleno metabolizan principalmente el ácido salicílico a través del catecol, mientras que las bacterias degradadoras de carbarilo prefieren metabolizarlo a través de la vía del gentisato.
Los derivados del ácido naftalenosulfónico/ácido disulfónico y del ácido naftilaminosulfónico pueden utilizarse como intermediarios en la producción de colorantes azoicos, agentes humectantes, dispersantes, etc. Aunque estos compuestos tienen baja toxicidad para los humanos, las evaluaciones de citotoxicidad han demostrado que son letales para peces, dafnias y algas (Greim et al., 1994). Se ha informado que representantes del género Pseudomonas (cepas A3, C22) inician el metabolismo mediante la doble hidroxilación del anillo aromático que contiene el grupo ácido sulfónico para formar un dihidrodiol, que posteriormente se convierte en 1,2-dihidroxinaftaleno por escisión espontánea del grupo sulfito (Brilon et al., 1981). El 1,2-dihidroxinaftaleno resultante se cataboliza a través de la vía clásica del naftaleno, es decir, la vía del catecol o del gentisato (Figura 4). Se ha demostrado que el ácido aminonaftalenosulfónico y el ácido hidroxinaftalenosulfónico pueden ser completamente degradados por consorcios bacterianos mixtos con vías catabólicas complementarias (Nortemann et al., 1986). Se ha demostrado que un miembro del consorcio desulfuriza el ácido aminonaftalenosulfónico o el ácido hidroxinaftalenosulfónico por 1,2-dioxigenación, mientras que el aminosalicilato o el hidroxisalicilato se liberan al medio de cultivo como un metabolito final y posteriormente son absorbidos por otros miembros del consorcio. El ácido naftalenodisulfónico es relativamente polar pero poco biodegradable y, por lo tanto, puede ser metabolizado a través de diferentes vías. La primera desulfurización ocurre durante la dihidroxilación regioselectiva del anillo aromático y el grupo ácido sulfónico; La segunda desulfuración ocurre durante la hidroxilación del ácido 5-sulfosalicílico por la salicilato 5-hidroxilasa para formar ácido gentísico, que ingresa a la vía central del carbono (Brilon et al., 1981) (Figura 4). Las enzimas responsables de la degradación del naftaleno también son responsables del metabolismo del naftaleno sulfonato (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Figura 4. Rutas metabólicas para la degradación del naftaleno sulfonato. Los números dentro de los círculos representan las enzimas responsables del metabolismo del naftil sulfonato, similares o idénticas a las enzimas descritas en la figura 3.
Los HAP de bajo peso molecular (HAP-BM) son reducibles, hidrofóbicos y poco solubles, por lo que no son susceptibles a la degradación natural. Sin embargo, los microorganismos aerobios pueden oxidarlos absorbiendo oxígeno molecular (O₂). Estas enzimas pertenecen principalmente a la clase de las oxidorreductasas y pueden realizar diversas reacciones, como la hidroxilación del anillo aromático (mono- o dihidroxilación), la deshidrogenación y la ruptura del anillo aromático. Los productos obtenidos de estas reacciones se encuentran en un estado de oxidación más alto y se metabolizan más fácilmente a través de la vía central del carbono (Phale et al., 2020). Se ha informado que las enzimas de la vía de degradación son inducibles. La actividad de estas enzimas es muy baja o insignificante cuando las células se cultivan en fuentes de carbono simples como la glucosa o los ácidos orgánicos. La Tabla 3 resume las diversas enzimas (oxigenasas, hidrolasas, deshidrogenasas, oxidasas, etc.) involucradas en el metabolismo del naftaleno y sus derivados.
Tabla 3. Características bioquímicas de las enzimas responsables de la degradación del naftaleno y sus derivados.
Estudios con radioisótopos (18O2) han demostrado que la incorporación de O2 molecular en anillos aromáticos por oxigenasas es el paso más importante en la activación de la biodegradación posterior de un compuesto (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). La incorporación de un átomo de oxígeno (O) del oxígeno molecular (O2) en el sustrato es iniciada por monooxigenasas endógenas o exógenas (también llamadas hidroxilasas). Otro átomo de oxígeno se reduce a agua. Las monooxigenasas exógenas reducen la flavina con NADH o NADPH, mientras que en las endomonooxigenasas la flavina es reducida por el sustrato. La posición de la hidroxilación da como resultado diversidad en la formación de productos. Por ejemplo, la salicilato 1-hidroxilasa hidroxila el ácido salicílico en la posición C1, formando catecol. Por otro lado, la salicilato 5-hidroxilasa multicomponente (que contiene subunidades de reductasa, ferredoxina y oxigenasa) hidroxila el ácido salicílico en la posición C5, formando ácido gentísico (Yamamoto et al., 1965).
Las dioxigenasas incorporan dos átomos de O2 al sustrato. Según los productos que forman, se dividen en dioxigenasas hidroxilantes de anillo y dioxigenasas de ruptura de anillo. Las dioxigenasas hidroxilantes de anillo convierten sustratos aromáticos en cis-dihidrodioles (p. ej., naftaleno) y están ampliamente distribuidas entre las bacterias. Hasta la fecha, se ha demostrado que los organismos que contienen dioxigenasas hidroxilantes de anillo son capaces de crecer en diversas fuentes de carbono aromático, y estas enzimas se clasifican como NDO (naftaleno), tolueno dioxigenasa (TDO, tolueno) y bifenil dioxigenasa (BPDO, bifenilo). Tanto la NDO como la BPDO pueden catalizar la doble oxidación y la hidroxilación de la cadena lateral de varios hidrocarburos aromáticos policíclicos (tolueno, nitrotolueno, xileno, etilbenceno, naftaleno, bifenilo, fluoreno, indol, metilnaftaleno, naftalenosulfonato, fenantreno, antraceno, acetofenona, etc.) (Boyd y Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). La NDO es un sistema multicomponente que consta de una oxidorreductasa, una ferredoxina y un componente oxigenasa que contiene un sitio activo (Gibson y Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). La unidad catalítica de la NDO consta de una subunidad α grande y una subunidad β pequeña dispuestas en una configuración α3β3. La NDO pertenece a una gran familia de oxigenasas y su subunidad α contiene un sitio de Rieske [2Fe-2S] y un hierro mononuclear no hemo, que determina la especificidad de sustrato de la NDO (Parales et al., 1998). Típicamente, en un ciclo catalítico, dos electrones de la reducción del nucleótido de piridina se transfieren al ion Fe(II) en el sitio activo a través de una reductasa, una ferredoxina y un sitio de Rieske. Los equivalentes reductores activan el oxígeno molecular, que es un requisito previo para la dihidroxilación del sustrato (Ferraro et al., 2005). Hasta la fecha, solo se han purificado y caracterizado en detalle unas pocas NDO de diferentes cepas y se ha estudiado en detalle el control genético de las vías implicadas en la degradación del naftaleno (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Las dioxigenasas que escinden el anillo (enzimas que escinden el anillo endo u orto y enzimas que escinden el anillo exodiol o meta) actúan sobre compuestos aromáticos hidroxilados. Por ejemplo, la dioxigenasa que escinde el anillo en posición orto es la catecol-1,2-dioxigenasa, mientras que la dioxigenasa que escinde el anillo en posición meta es la catecol-2,3-dioxigenasa (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Además de varias oxigenasas, también existen varias deshidrogenasas responsables de la deshidrogenación de dihidrodioles aromáticos, alcoholes y aldehídos, utilizando NAD+/NADP+ como aceptores de electrones, que son algunas de las enzimas importantes involucradas en el metabolismo (Gibson y Subramanian, 1984; Shaw y Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Las enzimas como las hidrolasas (esterasas, amidasas) son una segunda clase importante de enzimas que utilizan agua para romper enlaces covalentes y exhiben una amplia especificidad de sustrato. La carbaryl hidrolasa y otras hidrolasas se consideran componentes del periplasma (transmembrana) en miembros de bacterias Gram negativas (Kamini et al., 2018). El carbaryl tiene un enlace amida y un enlace éster; por lo tanto, puede ser hidrolizado por esterasa o amidasa para formar 1-naftol. Se ha informado que el carbaryl en la cepa AC10023 de Rhizobium rhizobium y en la cepa RC100 de Arthrobacter funciona como esterasa y amidasa, respectivamente. El carbaryl en la cepa RC100 de Arthrobacter también funciona como amidasa. Se ha demostrado que RC100 hidroliza cuatro insecticidas de la clase N-metilcarbamato, como carbaryl, metomilo, ácido mefenámico y XMC (Hayaatsu et al., 2001). Se informó que CH en Pseudomonas sp. C5pp puede actuar sobre carbaryl (100% de actividad) y acetato de 1-naftilo (36% de actividad), pero no sobre 1-naftilacetamida, lo que indica que es una esterasa (Trivedi et al., 2016).
Estudios bioquímicos, patrones de regulación enzimática y análisis genéticos han demostrado que los genes de degradación del naftaleno constan de dos unidades reguladoras inducibles u "operones": nah (la "vía ascendente", que convierte el naftaleno en ácido salicílico) y sal (la "vía descendente", que convierte el ácido salicílico en la vía central del carbono a través del catecol). El ácido salicílico y sus análogos pueden actuar como inductores (Shamsuzzaman y Barnsley, 1974). En presencia de glucosa o ácidos orgánicos, el operón se reprime. La Figura 5 muestra la organización genética completa de la degradación del naftaleno (en forma de operón). Se han descrito varias variantes/formas del gen nah (ndo/pah/dox) y se ha encontrado que tienen una alta homología de secuencia (90%) entre todas las especies de Pseudomonas (Abbasian et al., 2016). Los genes de la vía ascendente del naftaleno se organizaron generalmente en un orden de consenso como se muestra en la Figura 5A. También se informó que otro gen, nahQ, participa en el metabolismo del naftaleno y suele ubicarse entre nahC y nahE, pero su función aún no se ha dilucidado. De manera similar, el gen nahY, responsable de la quimiotaxis sensible al naftaleno, se encontró en el extremo distal del operón nah en algunos miembros. En Ralstonia sp., se encontró que el gen U2 que codifica la glutatión S-transferasa (gsh) se ubica entre nahAa y nahAb, pero no afecta las características de utilización del naftaleno (Zylstra et al., 1997).
Figura 5. Organización genética y diversidad observadas durante la degradación del naftaleno entre especies bacterianas; (A) Vía superior del naftaleno, metabolismo del naftaleno a ácido salicílico; (B) Vía inferior del naftaleno, ácido salicílico a través del catecol hacia la vía central del carbono; (C) ácido salicílico a través del gentisato hacia la vía central del carbono.
La “vía inferior” (operón sal) generalmente consta de nahGTHINLMOKJ y convierte el salicilato en piruvato y acetaldehído a través de la vía de escisión del anillo meta del catecol. Se encontró que el gen nahG (que codifica la salicilato hidroxilasa) está conservado en el extremo proximal del operón (Fig. 5B). En comparación con otras cepas degradadoras de naftaleno, en P. putida CSV86 los operones nah y sal están en tándem y muy estrechamente relacionados (aproximadamente 7,5 kb). En algunas bacterias Gram negativas, como Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 y P. putida AK5, el naftaleno se metaboliza como un metabolito central de carbono a través de la vía del gentisato (en forma del operón sgp/nag). El casete genético se representa típicamente en la forma nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, donde nagR (que codifica un regulador de tipo LysR) se encuentra en el extremo superior (Figura 5C).
El carbaryl ingresa al ciclo central del carbono a través del metabolismo del 1-naftol, el 1,2-dihidroxinaftaleno, el ácido salicílico y el ácido gentísico (Figura 3). Con base en estudios genéticos y metabólicos, se ha propuesto dividir esta vía en "ascendente" (conversión de carbaryl a ácido salicílico), "intermedia" (conversión de ácido salicílico a ácido gentísico) y "descendente" (conversión de ácido gentísico a intermediarios de la vía central del carbono) (Singh et al., 2013). El análisis genómico de C5pp (supercontig A, 76,3 kb) reveló que el gen mcbACBDEF está involucrado en la conversión de carbaryl a ácido salicílico, seguido de mcbIJKL en la conversión de ácido salicílico a ácido gentísico, y mcbOQP en la conversión de ácido gentísico a intermediarios de carbono centrales (fumarato y piruvato, Trivedi et al., 2016) (Figura 6).
Se ha informado que las enzimas involucradas en la degradación de hidrocarburos aromáticos (incluidos el naftaleno y el ácido salicílico) pueden ser inducidas por los compuestos correspondientes e inhibidas por fuentes de carbono simples como la glucosa o los ácidos orgánicos (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Entre las diversas vías metabólicas del naftaleno y sus derivados, las características reguladoras del naftaleno y el carbaryl se han estudiado en cierta medida. Para el naftaleno, los genes en las vías ascendente y descendente están regulados por NahR, un regulador positivo trans-activo de tipo LysR. Es necesario para la inducción del gen nah por el ácido salicílico y su posterior expresión de alto nivel (Yen y Gunsalus, 1982). Además, los estudios han demostrado que el factor de integración del huésped (IHF) y XylR (regulador transcripcional dependiente de sigma 54) también son críticos para la activación transcripcional de genes en el metabolismo del naftaleno (Ramos et al., 1997). Los estudios han demostrado que las enzimas de la vía de apertura del anillo meta del catecol, concretamente la catecol 2,3-dioxigenasa, se inducen en presencia de naftaleno y/o ácido salicílico (Basu et al., 2006). Los estudios han demostrado que las enzimas de la vía de apertura del anillo orto del catecol, concretamente la catecol 1,2-dioxigenasa, se inducen en presencia de ácido benzoico y cis,cis-muconato (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
En la cepa C5pp, cinco genes, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR y mcbS, codifican reguladores pertenecientes a la familia LysR/TetR de reguladores transcripcionales responsables del control de la degradación del carbaryl. Se encontró que el gen homólogo mcbG está más estrechamente relacionado con el regulador tipo LysR PhnS (58% de identidad de aminoácidos) involucrado en el metabolismo del fenantreno en Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). Se encontró que el gen mcbH está involucrado en la vía intermedia (conversión de ácido salicílico a ácido gentísico) y pertenece al regulador transcripcional tipo LysR NagR/DntR/NahR en Pseudomonas y Burkholderia. Se informó que los miembros de esta familia reconocen el ácido salicílico como una molécula efectora específica para la inducción de genes de degradación. Por otro lado, se identificaron tres genes, mcbN, mcbR y mcbS, pertenecientes a reguladores transcripcionales de tipo LysR y TetR, en la vía metabólica posterior (metabolitos de la vía central del carbono del gentisato).
En procariotas, los procesos de transferencia horizontal de genes (adquisición, intercambio o transferencia) a través de plásmidos, transposones, profagos, islas genómicas y elementos conjugativos integrativos (ICE) son causas importantes de plasticidad en los genomas bacterianos, lo que lleva a la ganancia o pérdida de funciones/rasgos específicos. Esto permite a las bacterias adaptarse rápidamente a diferentes condiciones ambientales, proporcionando potenciales ventajas metabólicas adaptativas al huésped, como la degradación de compuestos aromáticos. Los cambios metabólicos a menudo se logran mediante el ajuste fino de los operones de degradación, sus mecanismos reguladores y las especificidades enzimáticas, lo que facilita la degradación de una gama más amplia de compuestos aromáticos (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). Se ha descubierto que los casetes de genes para la degradación del naftaleno se encuentran en una variedad de elementos móviles como plásmidos (conjugativos y no conjugativos), transposones, genomas, ICE y combinaciones de diferentes especies bacterianas (Figura 5). En Pseudomonas G7, los operones nah y sal del plásmido NAH7 se transcriben en la misma orientación y forman parte de un transposón defectuoso que requiere la transposasa Tn4653 para su movilización (Sota et al., 2006). En la cepa de Pseudomonas NCIB9816-4, el gen se encontró en el plásmido conjugativo pDTG1 como dos operones (separados aproximadamente por 15 kb) que se transcribían en direcciones opuestas (Dennis y Zylstra, 2004). En la cepa de Pseudomonas putida AK5, el plásmido no conjugativo pAK5 codifica la enzima responsable de la degradación del naftaleno a través de la vía del gentisato (Izmalkova et al., 2013). En la cepa Pseudomonas PMD-1, el operón nah se encuentra en el cromosoma, mientras que el operón sal se encuentra en el plásmido conjugativo pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). Sin embargo, en Pseudomonas stutzeri AN10, todos los genes de degradación de naftaleno (operones nah y sal) se encuentran en el cromosoma y presumiblemente se reclutan mediante eventos de transposición, recombinación y reordenamiento (Bosch et al., 2000). En Pseudomonas sp. CSV86, los operones nah y sal se encuentran en el genoma en forma de ICE (ICECSV86). La estructura está protegida por tRNAGly seguido de repeticiones directas que indican sitios de recombinación/unión (attR y attL) y una integrasa similar a un fago ubicada en ambos extremos de tRNAGly, por lo que es estructuralmente similar al elemento ICEclc (ICEclcB13 en Pseudomonas knackmusii para la degradación de clorocatecol). Se ha informado que los genes en ICE pueden transferirse por conjugación con una frecuencia de transferencia extremadamente baja (10⁻⁸), transfiriendo así propiedades de degradación al receptor (Basu y Phale, 2008; Phale et al., 2019).
La mayoría de los genes responsables de la degradación del carbaryl se encuentran en plásmidos. Arthrobacter sp. RC100 contiene tres plásmidos (pRC1, pRC2 y pRC300), de los cuales dos plásmidos conjugativos, pRC1 y pRC2, codifican las enzimas que convierten el carbaryl en gentisato. Por otro lado, las enzimas involucradas en la conversión del gentisato en los metabolitos centrales del carbono se encuentran en el cromosoma (Hayaatsu et al., 1999). Bacterias del género Rhizobium. La cepa AC100, utilizada para la conversión de carbaryl a 1-naftol, contiene el plásmido pAC200, que porta el gen cehA que codifica CH como parte del transposón Tnceh rodeado de secuencias similares a elementos de inserción (istA e istB) (Hashimoto et al., 2002). En la cepa Sphingomonas CF06, se cree que el gen de degradación de carbaryl está presente en cinco plásmidos: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 y pCF05. La homología de ADN de estos plásmidos es alta, lo que indica la existencia de un evento de duplicación génica (Feng et al., 1997). En un simbionte degradador de carbaryl compuesto por dos especies de Pseudomonas, la cepa 50581 contiene un plásmido conjugativo pCD1 (50 kb) que codifica el gen de la carbaryl hidrolasa mcd, mientras que el plásmido conjugativo en la cepa 50552 codifica una enzima degradadora de 1-naftol (Chapalamadugu y Chaudhry, 1991). En la cepa Achromobacter WM111, el gen de la furadan hidrolasa mcd se encuentra en un plásmido de 100 kb (pPDL11). Se ha demostrado que este gen está presente en diferentes plásmidos (100, 105, 115 o 124 kb) en diferentes bacterias de diferentes regiones geográficas (Parekh et al., 1995). En Pseudomonas sp. C5pp, todos los genes responsables de la degradación de carbaryl se encuentran en un genoma que abarca 76,3 kb de secuencia (Trivedi et al., 2016). El análisis del genoma (6,15 Mb) reveló la presencia de 42 MGE y 36 GEI, de los cuales 17 MGE se encontraban en el supercontig A (76,3 kb) con un contenido promedio asimétrico de G+C (54–60 mol%), lo que sugiere posibles eventos de transferencia horizontal de genes (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 presenta una disposición similar de genes degradadores de carbaryl, pero estos genes se encuentran en un plásmido (Zhu et al., 2019).
Además de la eficiencia metabólica a nivel bioquímico y genómico, los microorganismos también exhiben otras propiedades o respuestas como quimiotaxis, propiedades de modificación de la superficie celular, compartimentación, utilización preferencial, producción de biosurfactantes, etc., que les ayudan a metabolizar de manera más eficiente los contaminantes aromáticos en ambientes contaminados (Figura 7).
Figura 7. Diferentes estrategias de respuesta celular de bacterias ideales degradadoras de hidrocarburos aromáticos para la biodegradación eficiente de compuestos contaminantes extraños.
Las respuestas quimiotácticas se consideran factores que mejoran la degradación de contaminantes orgánicos en ecosistemas heterogéneamente contaminados. (2002) demostraron que la quimiotaxis de Pseudomonas sp. G7 hacia el naftaleno aumentó la tasa de degradación del naftaleno en sistemas acuáticos. La cepa silvestre G7 degradó el naftaleno mucho más rápido que una cepa mutante deficiente en quimiotaxis. Se encontró que la proteína NahY (538 aminoácidos con topología de membrana) se cotranscribe con los genes de la vía de metaclivaje en el plásmido NAH7, y al igual que los transductores de quimiotaxis, esta proteína parece funcionar como un quimiorreceptor para la degradación del naftaleno (Grimm y Harwood 1997). Otro estudio de Hansel et al. (2009) mostró que la proteína es quimiotáctica, pero su tasa de degradación es alta. (2011) demostraron una respuesta quimiotáctica de Pseudomonas (P. putida) al naftaleno gaseoso, donde la difusión en fase gaseosa resultó en un flujo constante de naftaleno hacia las células, lo que controló la respuesta quimiotáctica de las células. Los investigadores explotaron este comportamiento quimiotáctico para diseñar microbios que mejorarían la tasa de degradación. Los estudios han demostrado que las vías quimiosensoriales también regulan otras funciones celulares como la división celular, la regulación del ciclo celular y la formación de biopelículas, ayudando así a controlar la tasa de degradación. Sin embargo, aprovechar esta propiedad (quimiotaxis) para una degradación eficiente se ve obstaculizado por varios cuellos de botella. Los principales obstáculos son: (a) diferentes receptores parálogos reconocen los mismos compuestos/ligandos; (b) existencia de receptores alternativos, es decir, tropismo energético; (c) diferencias de secuencia significativas en los dominios sensoriales de la misma familia de receptores; y (d) falta de información sobre las principales proteínas sensoras bacterianas (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). A veces, la biodegradación de hidrocarburos aromáticos produce múltiples metabolitos/intermediarios, que pueden ser quimiotácticos para un grupo de bacterias pero repulsivos para otros, lo que complica aún más el proceso. Para identificar las interacciones de los ligandos (hidrocarburos aromáticos) con los receptores químicos, construimos proteínas sensoras híbridas (PcaY, McfR y NahY) mediante la fusión de los dominios sensor y de señalización de Pseudomonas putida y Escherichia coli, que se dirigen a los receptores de ácidos aromáticos, intermediarios del ciclo de Krebs y naftaleno, respectivamente (Luu et al., 2019).
Bajo la influencia del naftaleno y otros hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), la estructura de la membrana bacteriana y la integridad de los microorganismos experimentan cambios significativos. Los estudios han demostrado que el naftaleno interfiere con la interacción de la cadena acilo a través de interacciones hidrofóbicas, aumentando así la hinchazón y la fluidez de la membrana (Sikkema et al., 1995). Para contrarrestar este efecto perjudicial, las bacterias regulan la fluidez de la membrana cambiando la proporción y la composición de ácidos grasos entre ácidos grasos de cadena ramificada iso/anteiso e isomerizando los ácidos grasos insaturados cis en los isómeros trans correspondientes (Heipieper y de Bont, 1994). En Pseudomonas stutzeri cultivada con tratamiento de naftaleno, la proporción de ácidos grasos saturados a insaturados aumentó de 1,1 a 2,1, mientras que en Pseudomonas JS150 esta proporción aumentó de 7,5 a 12,0 (Mrozik et al., 2004). Cuando se cultivaron en naftaleno, las células de Achromobacter KAs 3–5 exhibieron agregación celular alrededor de cristales de naftaleno y una disminución en la carga de la superficie celular (de -22,5 a -2,5 mV) acompañada de condensación citoplasmática y vacuolización, lo que indica cambios en la estructura celular y propiedades de la superficie celular (Mohapatra et al., 2019). Aunque los cambios celulares/superficiales están directamente asociados con una mejor absorción de contaminantes aromáticos, las estrategias de bioingeniería relevantes no se han optimizado completamente. La manipulación de la forma celular rara vez se ha utilizado para optimizar procesos biológicos (Volke y Nikel, 2018). La eliminación de genes que afectan la división celular causa cambios en la morfología celular. La eliminación de genes que afectan la división celular causa cambios en la morfología celular. En Bacillus subtilis, se ha demostrado que la proteína del septo celular SepF está involucrada en la formación del septo y es necesaria para los pasos subsiguientes de la división celular, pero no es un gen esencial. La eliminación de genes que codifican hidrolasas de glicano peptídico en Bacillus subtilis dio como resultado el alargamiento celular, un aumento de la tasa de crecimiento específica y una mejor capacidad de producción de enzimas (Cui et al., 2018).
Se ha propuesto la compartimentalización de la vía de degradación del carbaryl para lograr una degradación eficiente de las cepas de Pseudomonas C5pp y C7 (Kamini et al., 2018). Se propone que el carbaryl se transporta al espacio periplásmico a través del septo de la membrana externa y/o a través de porinas difusibles. CH es una enzima periplásmica que cataliza la hidrólisis del carbaryl a 1-naftol, que es más estable, más hidrofóbico y más tóxico. CH se localiza en el periplasma y tiene una baja afinidad por el carbaryl, controlando así la formación de 1-naftol, evitando su acumulación en las células y reduciendo su toxicidad para las células (Kamini et al., 2018). El 1-naftol resultante se transporta al citoplasma a través de la membrana interna por partición y/o difusión, y luego se hidroxila a 1,2-dihidroxinaftaleno por la enzima de alta afinidad 1NH para su posterior metabolismo en la vía central del carbono.
Aunque los microorganismos tienen las capacidades genéticas y metabólicas para degradar fuentes de carbono xenobióticas, la estructura jerárquica de su utilización (es decir, el uso preferencial de fuentes de carbono simples sobre complejas) es un obstáculo importante para la biodegradación. La presencia y utilización de fuentes de carbono simples regula negativamente los genes que codifican enzimas que degradan fuentes de carbono complejas/no preferidas como los HAP. Un ejemplo bien estudiado es que cuando se alimentan conjuntamente glucosa y lactosa a Escherichia coli, la glucosa se utiliza de manera más eficiente que la lactosa (Jacob y Monod, 1965). Se ha informado que Pseudomonas degrada una variedad de HAP y compuestos xenobióticos como fuentes de carbono. La jerarquía de utilización de fuentes de carbono en Pseudomonas es ácidos orgánicos > glucosa > compuestos aromáticos (Hylemon y Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Sin embargo, hay una excepción. Curiosamente, Pseudomonas sp. CSV86 presenta una estructura jerárquica única que utiliza preferentemente hidrocarburos aromáticos (ácido benzoico, naftaleno, etc.) en lugar de glucosa, y cometaboliza los hidrocarburos aromáticos con ácidos orgánicos (Basu et al., 2006). En esta bacteria, los genes para la degradación y el transporte de hidrocarburos aromáticos no se regulan negativamente, incluso en presencia de una segunda fuente de carbono como la glucosa o los ácidos orgánicos. Al cultivarla en un medio con glucosa e hidrocarburos aromáticos, se observó que los genes para el transporte y el metabolismo de la glucosa se regulaban negativamente, los hidrocarburos aromáticos se utilizaban en la primera fase logarítmica y la glucosa en la segunda fase logarítmica (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). Por otro lado, la presencia de ácidos orgánicos no afectó la expresión del metabolismo de los hidrocarburos aromáticos, por lo que se espera que esta bacteria sea una cepa candidata para estudios de biodegradación (Phale et al., 2020).
Es bien sabido que la biotransformación de hidrocarburos puede causar estrés oxidativo y sobreexpresión de enzimas antioxidantes en microorganismos. La biodegradación ineficiente del naftaleno, tanto en células en fase estacionaria como en presencia de compuestos tóxicos, conduce a la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) (Kang et al. 2006). Dado que las enzimas degradadoras de naftaleno contienen cúmulos de hierro-azufre, bajo estrés oxidativo, el hierro del hemo y de las proteínas hierro-azufre se oxidará, lo que provocará la inactivación de la proteína. La ferredoxina-NADP+ reductasa (Fpr), junto con la superóxido dismutasa (SOD), media la reacción redox reversible entre NADP+/NADPH y dos moléculas de ferredoxina o flavodoxina, eliminando así las ROS y restaurando el centro hierro-azufre bajo estrés oxidativo (Li et al. 2006). Se ha informado que tanto Fpr como SodA (SOD) en Pseudomonas pueden ser inducidos por estrés oxidativo, y se observó un aumento en las actividades de SOD y catalasa en cuatro cepas de Pseudomonas (O1, W1, As1 y G1) durante el crecimiento en condiciones con adición de naftaleno (Kang et al., 2006). Los estudios han demostrado que la adición de antioxidantes como el ácido ascórbico o el hierro ferroso (Fe2+) puede aumentar la tasa de crecimiento en presencia de naftaleno. Cuando Rhodococcus erythropolis creció en un medio con naftaleno, se incrementó la transcripción de genes del citocromo P450 relacionados con el estrés oxidativo, incluidos sodA (superóxido dismutasa Fe/Mn), sodC (superóxido dismutasa Cu/Zn) y recA (Sazykin et al., 2019). El análisis proteómico cuantitativo comparativo de células de Pseudomonas cultivadas en naftaleno mostró que la regulación positiva de varias proteínas asociadas con la respuesta al estrés oxidativo es una estrategia para afrontar el estrés (Herbst et al., 2013).
Se ha informado que los microorganismos producen biosurfactantes bajo la acción de fuentes de carbono hidrofóbicas. Estos surfactantes son compuestos tensioactivos anfifílicos que pueden formar agregados en las interfaces aceite-agua o aire-agua. Esto promueve la pseudosolubilización y facilita la adsorción de hidrocarburos aromáticos, lo que resulta en una biodegradación eficiente (Rahman et al., 2002). Debido a estas propiedades, los biosurfactantes se utilizan ampliamente en diversas industrias. La adición de surfactantes químicos o biosurfactantes a los cultivos bacterianos puede mejorar la eficiencia y la velocidad de degradación de hidrocarburos. Entre los biosurfactantes, los ramnolípidos producidos por Pseudomonas aeruginosa han sido ampliamente estudiados y caracterizados (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Además, otros tipos de biosurfactantes incluyen lipopéptidos (mucinas de Pseudomonas fluorescens), emulsionante 378 (de Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg y Ron, 1999), lípidos de disacáridos de trehalosa de Rhodococcus (Ramdahl, 1985), liquenina de Bacillus (Saraswathy y Hallberg, 2002) y surfactante de Bacillus subtilis (Siegmund y Wagner, 1991) y Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). Se ha demostrado que estos potentes surfactantes reducen la tensión superficial de 72 dinas/cm a menos de 30 dinas/cm, lo que permite una mejor absorción de hidrocarburos. Se ha informado que Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia y otras especies bacterianas pueden producir varios biosurfactantes basados ​​en ramnolípidos y glicolípidos cuando se cultivan en medios de naftaleno y metilnaftaleno (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 puede producir el biosurfactante extracelular Biosur-Pm cuando se cultiva en compuestos aromáticos como el ácido naftoico (Phale et al., 1995). La cinética de la formación de Biosur-Pm mostró que su síntesis es un proceso dependiente del crecimiento y del pH. Se encontró que la cantidad de Biosur-Pm producida por las células a pH neutro era mayor que la producida a pH 8,5. Las células cultivadas a pH 8,5 eran más hidrofóbicas y tenían mayor afinidad por los compuestos aromáticos y alifáticos que las células cultivadas a pH 7,0. En Rhodococcus spp. El nitrógeno (N6), una mayor relación carbono-nitrógeno (C:N) y la limitación de hierro constituyen las condiciones óptimas para la producción de biosurfactantes extracelulares (Mutalik et al., 2008). Se han realizado intentos para mejorar la biosíntesis de biosurfactantes (surfactinas) mediante la optimización de cepas y la fermentación. Sin embargo, el título de surfactante en el medio de cultivo es bajo (1,0 g/L), lo que supone un desafío para la producción a gran escala (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Por consiguiente, se han utilizado métodos de ingeniería genética para mejorar su biosíntesis. No obstante, su modificación mediante ingeniería genética resulta difícil debido al gran tamaño del operón (∼25 kb) y a la compleja regulación biosintética del sistema de detección de quórum (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Se han realizado diversas modificaciones genéticas en bacterias del género Bacillus, principalmente con el objetivo de aumentar la producción de surfactina mediante la sustitución del promotor (operón srfA), la sobreexpresión de la proteína de exportación de surfactina YerP y los factores reguladores ComX y PhrC (Jiao et al., 2017). Sin embargo, estos métodos de ingeniería genética solo han logrado una o pocas modificaciones genéticas y aún no han alcanzado la producción comercial. Por lo tanto, es necesario seguir investigando métodos de optimización basados ​​en el conocimiento.
Los estudios de biodegradación de HAP se realizan principalmente en condiciones de laboratorio estándar. Sin embargo, en sitios o entornos contaminados, se ha demostrado que muchos factores abióticos y bióticos (temperatura, pH, oxígeno, disponibilidad de nutrientes, biodisponibilidad del sustrato, otros xenobióticos, inhibición por producto final, etc.) alteran e influyen en la capacidad degradativa de los microorganismos.
La temperatura influye significativamente en la biodegradación de los HAP. A medida que aumenta la temperatura, disminuye la concentración de oxígeno disuelto, lo que afecta el metabolismo de los microorganismos aerobios, ya que estos requieren oxígeno molecular como uno de los sustratos para las oxigenasas que realizan reacciones de hidroxilación o ruptura del anillo. Se observa con frecuencia que las temperaturas elevadas transforman los HAP originales en compuestos más tóxicos, inhibiendo así la biodegradación (Muller et al., 1998).
Se ha observado que muchos sitios contaminados con HAP presentan valores de pH extremos, como los sitios contaminados por drenaje ácido de minas (pH 1–4) y los sitios de gasificación de gas natural/carbón contaminados con lixiviados alcalinos (pH 8–12). Estas condiciones pueden afectar gravemente el proceso de biodegradación. Por lo tanto, antes de utilizar microorganismos para la biorremediación, se recomienda ajustar el pH mediante la adición de productos químicos adecuados (con un potencial de oxidación-reducción moderado a muy bajo), como sulfato de amonio o nitrato de amonio para suelos alcalinos, o encalado con carbonato de calcio o carbonato de magnesio para sitios ácidos (Bowlen et al. 1995; Gupta y Sar 2020).
El suministro de oxígeno a la zona afectada es el factor limitante de la velocidad de biodegradación de los HAP. Debido a las condiciones redox del entorno, los procesos de biorremediación in situ suelen requerir la introducción de oxígeno de fuentes externas (labranza, aireación y adición de productos químicos) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) demostraron que la adición de peróxido de magnesio (un compuesto liberador de oxígeno) a un acuífero contaminado podía biorremediar eficazmente los compuestos BTEX. Otro estudio investigó la degradación in situ de fenol y BTEX en un acuífero contaminado mediante la inyección de nitrato de sodio y la construcción de pozos de extracción para lograr una biorremediación eficaz (Bewley y Webb, 2001).