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El complejo de captación de luz del centro de reacción 1 (RC-LH1) es el componente fotosintético central de las bacterias fototróficas púrpuras. Presentamos dos estructuras de microscopía crioelectrónica del complejo RC-LH1 de Rhodopseudomonas palustris. La estructura del complejo RC-LH114-W, con una resolución de 2,65 Å, consta de 14 bucles de LH1 de subunidades que rodean a RC, interrumpidos por la proteína W, mientras que el complejo sin proteína W está completamente rodeado por RC. Bucle cerrado de LH1 de 16 subunidades. La comparación de estas estructuras proporciona información sobre la dinámica de la quinona en el complejo RC-LH1, incluyendo cambios conformacionales previamente indeterminados al unirse a la quinona en el sitio QB de RC, así como la ubicación de los sitios de unión auxiliares de quinona, que facilitan su paso a RC. La estructura única de la proteína W impide el cierre del bucle de LH1, creando así un canal para acelerar el intercambio quinona/quinolona.
La energía proporcionada por la fotosíntesis puede sustentar casi toda la vida en la Tierra y tiene un gran potencial para la biotecnología solar. Además de promover la fotosíntesis global, las bacterias fotótrofas púrpuras también exhiben diversos modos de energía y capacidades metabólicas. Pueden evitar la fotosíntesis y crecer como bacterias heterótrofas en la oscuridad, fijar nitrógeno y dióxido de carbono, producir hidrógeno y degradar compuestos aromáticos (1-3). Para proporcionar energía para estos procesos, la luz debe convertirse rápida y eficientemente en energía química. Este proceso comienza cuando el complejo de antena que atrapa la luz absorbe la luz y transfiere la energía atrapada al centro de reacción (CR), iniciando así la separación de cargas (4-7). La unidad básica de la fotosíntesis en las bacterias fotótrofas púrpuras está compuesta por el CR tipo 2, rodeado por el complejo de captación de luz 1 (LH1), formando el complejo central RC-LH1. El LH1 está formado por una matriz de heterodímeros αβ curvados, cada uno de los cuales une dos moléculas de clorofila bacteriana (BChl) a y uno o dos carotenoides (8-12). La antena LH1 más simple consiste en 16 o 17 heterodímeros αβ que rodean a RC (9-13) en un bucle cerrado, pero en otros complejos centrales, los péptidos transmembrana interrumpen la continuidad del LH1 circundante, promoviendo así la difusión de quinol/quinona entre RC y el complejo citocromo bc1 (11, 13-15). La planta fototrófica púrpura Rhodopseudomonas (Rps.) es un organismo modelo que puede comprender la transferencia de energía y electrones que sustenta la fotosíntesis. La primera estructura cristalina de Rps. El modelo del complejo RC-LH1 de palustris es RC, rodeado de 15 bucles LH1 heterodímeros, que son interrumpidos por una proteína desconocida llamada "Proteína W" (14). La proteína W se identificó posteriormente como RPA4402, que es una proteína de 10,5 kDa no caracterizada con tres hélices transmembrana (TMH) predichas (16). Proponemos renombrar el gen rpa4402 que codifica la proteína W a pufW para ser consistente con la nomenclatura usada para genes que codifican subunidades RC-L, M (pufL, pufM) y LH1α, β (pufA, pufB). Curiosamente, la proteína-W solo está presente en alrededor del 10% de RC-LH1, revelando que Rps. palustris produce dos complejos RC-LH1 diferentes. Aquí, reportamos las estructuras crio-EM (crio-EM) de alta resolución de dos complejos centrales, uno con proteína W y 14 heterodímeros αβ, el otro sin proteína W y un bucle LH1 cerrado de 16 heterodímeros. Nuestra estructura representa un cambio de paso en la comprensión del complejo RC-LH1 de Rps. palustris, porque hemos analizado la población homogénea de cada variante y tenemos suficiente resolución para asignar claramente cada péptido y pigmentos unidos y lípidos y quinonas relacionados. La comparación de estas estructuras muestra que las tres proteínas TMH-W, no halladas hasta la fecha en ningún otro complejo RC-LH1, generan un canal de quinona que acelera el intercambio quinona/quinolona. Se han identificado varios sitios de unión de lípidos y quinonas conservados, y se ha revelado un nuevo cambio conformacional tras la combinación de quinona y RC, que podría ser adecuado para el RC del fotosistema II (PSII) de organismos fototróficos oxigenados. Nuestros hallazgos aportan nuevos conocimientos sobre la cinética de la unión e intercambio quinona/quinolona en el complejo central RC-LH1 de bacterias fototróficas púrpuras.
Para facilitar un estudio detallado de los dos complejos encontrados en Rps. palustris, aislamos cada RC-LH1 mediante métodos bioquímicos. El complejo deficiente en proteína W (en adelante, ΔpufW) se purificó de la cepa que carecía del gen pufW (16), y solo se pudo producir un complejo RC-LH1. El complejo que contiene proteína W es producido por una cepa. La proteína W de esta cepa está modificada con una etiqueta His 10x en su extremo C-terminal, de modo que el complejo que contiene proteína W puede combinarse eficazmente con la mayoría de las proteínas W carentes mediante la inmovilización del metal. El complejo se separa eficazmente (16) mediante cromatografía de afinidad (IMAC).
Como se muestra en la Figura 1, ambos complejos contienen una RC de tres subunidades (RC-L, RC-M y RC-H) rodeada por una antena LH1. La estructura de 2,80 Å del complejo sin proteína-W presenta 16 heterodímeros αβ, que forman un bucle LH1 cerrado que rodea completamente a RC, en adelante denominado complejo RC-LH116. La estructura de 2,65 Å del complejo con proteína-W presenta una LH1 de 14 heterodímeros interrumpida por la proteína-W, en adelante denominada RC-LH114-W.
(A y B) Representación superficial del compuesto. (C y D) Pigmentos enlazados expresados ​​en bastones. (E y F) Los complejos observados desde la superficie citoplasmática tienen los péptidos y las subunidades LH1 representados en viñetas, y están numerados en el sentido de las agujas del reloj desde el gap proteína-W [coherente con la numeración de Rba. complejo sphaeroides (13)]. Para LH1-α, el color de la subunidad proteica es amarillo; para LH1-β, el color de la subunidad proteica es azul; para proteína-W, la proteína es roja; para RC-H, es cian; para RC-L, es naranja; para RC-M, magenta. Los cofactores están representados por bastones, el verde representa las moléculas BChl y BPh a, el morado representa los carotenoides y el amarillo representa las moléculas UQ10. (G y H) Vista ampliada del gap proteína-W en la región equivalente del complejo RC-LH114-W (G) y el complejo RC-LH116 (H). Los cofactores se muestran rellenando el espacio; la quinona quelada se muestra en azul. El espacio entre la proteína W se resalta con una línea discontinua azul en (G), y los pequeños orificios donde se difunde la quinona/quinolol en el anillo LH116 se resaltan con una línea discontinua negra en (H).
La Figura 1 (A y B) muestra el RC rodeado por matrices abiertas o cerradas de heterodímeros LH1αβ, cada uno de los cuales se une a dos BChl y un carotenoide (Figura 1, C y D). Estudios previos han demostrado que Rps es el complejo LH1. En la vía biosintética de la xantina de la espirulina, estas especies contienen poblaciones mixtas de carotenoides (17). Sin embargo, la espiropirroxantina es el carotenoide dominante y su densidad es satisfactoria. Por lo tanto, elegimos modelar la espiroxantina en todos los sitios de unión de LH1. Los polipéptidos alfa y beta son TMH individuales con regiones externas de membrana cortas (Figura 1, A, B, E y F). Aunque no se observó la densidad de 17 residuos en el extremo C, el polipéptido alfa se escindió de Met1 a Ala46 en ambos complejos. El polipéptido β se redujo de Gly4 a Tyr52 en RC-LH116, y de Ser5 a Tyr52 en RC-LH114-W. No se observó densidad de 3 o 4 residuos N-terminales ni de 13 C-terminales (Figura S1). El análisis por espectrometría de masas del complejo mixto RC-LH1 preparado a partir de la cepa silvestre mostró que la región faltante era el resultado de la escisión heteróloga de estos péptidos (Figuras S1 y S2). También se observó la formilación N-terminal de α-Met1 (f). El análisis mostró que el péptido α consiste en los residuos fMet1 a Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, y el péptido β consiste en los residuos Ser2 a Ala53, lo cual concuerda bien con el mapa de densidad EM de baja temperatura.
La coordinación de α-His29 y β-His36 hace que los BChls estén cara a cara; cada heterodímero αβ se ensambla con sus vecinos para formar un bucle abierto (RC-LH114-W) o un bucle cerrado (RC-LH116) alrededor del RC La matriz de pigmento acoplado a excitones (Figura 1, C y D). En comparación con la banda de 877 nm de RC-LH114-W, el desplazamiento al rojo de absorción de 880 nm de RC-LH116 es de 3 nm (Figura 2A). Sin embargo, el espectro de dicroísmo circular es casi el mismo (Figura 2B), lo que indica que, aunque hay una clara diferencia entre bucles abiertos y cerrados, el entorno local de BChls es muy similar. El desplazamiento al rojo de absorción puede ser el resultado de un movimiento térmico reducido y una mayor estabilidad en el bucle cerrado (18, 19), el cambio en el acoplamiento de pigmentos causado por el bucle cerrado (20, 21) o una combinación de estos dos efectos (11).
(A) Espectro de absorción ultravioleta/visible/infrarrojo cercano, cuyos picos están marcados con sus pigmentos correspondientes y normalizados al pico BPh a 775 nm. (B) Espectro de dicroísmo circular normalizado a la absorbancia de BChl a 805 nm. (C y D) Espectros ΔA seleccionados de los espectros de absorción resueltos en el tiempo del complejo RC-LH114-W (C) y el complejo RC-LH116 (D). Para una mejor comparabilidad, todos los espectros están normalizados a ∆A de −A a 0,2 ps. (E) La tasa de oxidación del citocromo c2 después de la irradiación en presencia de varias concentraciones de UQ2 (véase la Figura S8 para los datos sin procesar). (F) En células cultivadas bajo luz de intensidad baja, media o alta (10, 30 o 300 μMm-2 s-1, respectivamente), las subunidades de proteína W y RC-L en el complejo purificado y la relación de membrana separada. Determine el nivel de proteína mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS e inmunoensayo (véase la Figura S9 para los datos sin procesar). Determine la proporción con respecto al complejo RC-LH114-W purificado. La proporción estequiométrica de RC-L a proteína-W del complejo es de 1:1.
Los BChls en la posición 1 en el bucle αβ14 deformado de RC-LH114-W (Figura 1, A, C y E) están más cerca del donante primario RC (P) por 6,8 Å que los BChls equivalentes en RC-LH116 (Figura. 1, B, D y F, y Figura S3); sin embargo, la cinética de absorción transitoria de los dos complejos muestra que para RC-LH114-W y RC-LH116, las constantes de tiempo de transferencia de energía de excitación de LH1 a RC son 40 ±4 y 44 ±3 ps (Figura 2). , C y D, Figura S4 y Tabla S2). Tampoco hay diferencia significativa en la transferencia electrónica dentro de RC (Figura S5 y texto complementario relacionado). Sospechamos que la estrecha correspondencia del tiempo de transferencia de energía entre LH1 y RC-P se debe a la distancia, el ángulo y la energía potencial similares de la mayoría de los BChl en los dos bucles LH1. Parece que explorar el patrón energético de LH1 para alcanzar la distancia mínima no es más rápido que la transferencia directa de energía desde sitios subóptimos a RC. El bucle LH1 de bucle abierto en RC-LH114-W también puede experimentar un movimiento térmico insignificante a baja temperatura para el análisis estructural, y existe una conformación de anillo αβ14 más larga a temperatura ambiente desde la distancia de pigmentación de βBChls en la posición de RC 1.
El complejo RC-LH116 contiene 32 BChls y 16 carotenoides, y su disposición general es la misma que la obtenida de Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), cepa Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (PDB ID 7C9R) (12) y algas verdes (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Después de la alineación, solo se observaron pequeñas desviaciones en las posiciones de los heterodímeros αβ, especialmente 1-5, 15 y 16 (Figura S6). La presencia de proteína-W tiene un impacto significativo en la estructura de LH1. Sus tres TMH están conectados por bucles cortos, con el terminal N en el lado del lumen del complejo y el terminal C en el lado citoplasmático (Figuras 1A y 3, A a D). La proteína-W es en gran parte hidrofóbica (Figura 3B), y TMH2 y TMH3 interactúan con LH1αβ-14 para formar una superficie transmembrana (Figura 3, B y E a G). La interfaz está compuesta principalmente por residuos de Phe, Leu y Val en la región transmembrana. Estos residuos se apilan con aminoácidos hidrofóbicos y pigmentos αβ-14. Algunos residuos polares también contribuyen a la interacción, incluyendo el enlace de hidrógeno entre W-Thr68 y β-Trp42 en la superficie de la cavidad compleja (Figura 3, F y G). En la superficie del citoplasma, Gln34 es adyacente al grupo ceto de los carotenoides αβ-14. Además, la molécula de n-dodecil β-d-maltósido (β-DDM) se resolvió, y su cola hidrofóbica se extendió a la interfaz entre la proteína-W y αβ-14, y la cola lipídica podría estar ubicada en el cuerpo. También observamos que las regiones de resolución C-terminal de la proteína W y RCH están muy próximas, pero no alcanzan el nivel necesario para formar interacciones específicas (Figura 1, A y E). Sin embargo, es posible que existan interacciones en los aminoácidos C-terminales no resueltos de estas dos proteínas, lo que podría proporcionar un mecanismo para el reclutamiento de la proteína W durante el ensamblaje del complejo RC-LH114-W.
(A) La proteína W, que se encuentra frente a la interfaz con LH1αβ14 en forma de caricatura, tiene una cadena lateral en forma de bastón (rojo), que se muestra en una parte del diagrama de potencial electrostático (superficie gris transparente con un nivel de contorno de 0,13). (B) La proteína W está representada por una superficie de color hidrófoba. Las áreas polares y cargadas se muestran en cian, las áreas hidrófobas en blanco y las áreas fuertemente hidrófobas en naranja. (C y D) La proteína W está representada en caricatura; su orientación es la misma que en (A) (C) y rotada 180° (D). Según la posición en la secuencia, los residuos distinguibles adoptan un esquema de colores arcoíris, donde el N-terminal es azul y el C-terminal es rojo. (E) La proteína W se ve igual que en (A), y los residuos en la interfaz de la proteína W:LH1 están representados por bastones con marcas adheridas. (F) La proteína-W está rotada 90° con respecto a (E) y LH1αβ14 en la representación gráfica, y con respecto a los residuos de la interfaz en la representación de barras. Los residuos salientes del polipéptido beta están marcados. El cofactor se muestra como una barra del mismo color que la Figura 1, el β-DDM descompuesto se muestra en gris y el oxígeno en rojo. (G) La vista en (F) está rotada 180°, con los residuos prominentes del polipéptido alfa marcados.
La proteína W reemplaza un heterodímero αβ (el 15.º en la Figura 1F), lo que impide el cierre del bucle e inclina los tres primeros heterodímeros αβ. Se observó que el ángulo de inclinación máximo del primer heterodímero αβ-1 con respecto a la normal de la película fue de 25° a 29° (Figura 1, A y E), que se formó por la inclinación de 2° a 8° de αβ-1 en RC A sharp contrast-LH116 (Figura 1, B y F). El segundo y tercer heterodímeros están inclinados de 12° a 22° y de 5° a 10°, respectivamente. Debido al impedimento estérico de RC, la inclinación de αβ-1 no incluye el segundo par de αβ (que corresponde al 16.º αβ en la Figura 1F), formando así un claro espacio en el anillo LH1 (Figura 1, A y E). Debido a la ausencia de dos heterodímeros αβ, acompañada de la pérdida de cuatro BChl y dos carotenoides, ninguno de estos se une a la subunidad αβ-1 retorcida, lo que resulta en un anillo LH114-W que contiene 13 carotenoides vegetarianos y 28 BChl. Las estimaciones de resolución local de los dos complejos en las regiones αβ1 a 7 son inferiores a las del resto del bucle LH1, lo que podría reflejar la plasticidad inherente de la subunidad LH1 adyacente al sitio RC QB (Figura 4).
Las imágenes de RC-LH114-W (A y B) y RC-LH116 (C y D) se muestran desde la misma vista superior/lateral (A y B) y la misma superficie de la cavidad de la Fig. 1 (B y D). Las teclas de color se muestran a la derecha.
El único otro complejo central característico con una relación estequiométrica de 1:14 es el dímero RC-LH1-PufX de Rhodococcus sphaeroides (Rba.) (13). Sin embargo, la proteína W y PufX no presentan una homología evidente y tienen un impacto significativo en sus respectivas estructuras LH1. PufX es un único TMH con un dominio citoplasmático N-terminal que interactúa con el lado citoplasmático de la subunidad RC-H (13) en una posición correspondiente a Rps. palustris LH116αβ-16. PufX crea un canal para el intercambio de quinona/quinolona entre RC-LH1 y el complejo citocromo bcl y está presente en todos los complejos centrales de Rba. sphaeroides (13). Aunque la interfaz monómero-monómero se encuentra en Rba. El dímero RC-LH1-PufX de los esferoides se encuentra en la posición de unión de la proteína W en RC-LH114-W, y el gap inducido por PufX y la proteína W está en una posición equivalente (Figura S7A). El gap en RC-LH114-W también está alineado con el hipotético canal de quinona (8) de Pseudomonas rosea LH1, que está formado por péptidos no relacionados con la proteína W o PufX (Figura S7B). Además, el canal de quinona en Blc. El LH1 verde esmeralda formado al excluir una subunidad γ (7) se encuentra en una posición similar (Figura S7C). Aunque mediada por diferentes proteínas, la aparición de estos canales de quinona/quinolol en una posición común en el complejo RC-LH1 parece ser un ejemplo de evolución convergente, lo que indica que el gap creado por la proteína W puede actuar como un canal de quinona.
El hueco en el bucle LH114-W permite la formación de una región de membrana continua entre el espacio interno del complejo RC-LH114-W y la membrana principal (Figura 1G), en lugar de conectar los dos dominios a través de un poro proteico como en las proteínas. El complejo RC-LH116 es similar a un complejo acicular cerrado de Tch (22) (Figura 1H). Dado que la difusión de la quinona a través de la membrana es más rápida que la difusión a través del canal proteico estrecho, el bucle abierto LH114-W puede permitir un recambio de RC más rápido que el bucle cerrado LH116, y la difusión de la quinona en el RC puede ser más restringida. Para comprobar si la proteína W afecta a la conversión de quinonas a través de RC, realizamos un ensayo de oxidación del citocromo en una cierta concentración de ubiquinona 2 (UQ2) (un análogo de la UQ10 natural con una cola de isopreno más corta) (Figura 2E). Aunque la presencia de quinona quelada dificulta la determinación precisa de la constante de Michaelis aparente (RC-LH114-W y RC-LH116 son adecuados para 0,2 ± 0,1 μM y 0,5 ± 0,2 μM, respectivamente), la tasa máxima de RC-LH114-W (4,6 ± 0,2 e-RC-1 s-1) es 28 ± 5 % mayor que la de RC-LH116 (3,6 ± 0,1 e-RC-1 s-1).
Inicialmente estimamos que la proteína-W está presente en aproximadamente el 10% del complejo central (16); aquí, las tasas de ocupación de las células de crecimiento con poca, media y alta luz son del 15±0,6%, 11±1% y 0,9±0,5%, respectivamente (Figura 2F). La comparación cuantitativa de la espectrometría de masas mostró que la adición de la etiqueta de histidina no redujo la abundancia relativa de la proteína-W en comparación con las cepas de tipo silvestre (P = 0,59), por lo que estos niveles no son un artefacto de la proteína-W modificada (Figura S10). Sin embargo, esta baja ocupación de la proteína-W en el complejo RC-LH1 puede permitir que algunos RC se inviertan a una velocidad acelerada, mitigando así el intercambio más lento de quinona/quinolona en el complejo RC-LH116. Observamos que la alta tasa de ocupación lumínica es incoherente con los datos transcriptómicos recientes, lo que indica que la expresión del gen pufW aumenta con luz intensa (Figura S11) (23). La diferencia entre la transcripción de pufW y la incorporación de la proteína-W al complejo RC-LH1 es confusa y podría reflejar la compleja regulación de la proteína.
En RC-LH114-W, 6 cardiolipinas (CDL), 7 fosfatidilcolina (POPC), 1 fosfatidilglicerol (POPG) y 29 moléculas de β-DDM se asignan y modelan en él 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG y 12 βDDM. RC-LH116 (Figura 5, A y B). En estas dos estructuras, CDL se encuentra casi en el lado citoplasmático del complejo, mientras que POPC, POPG y β-DDM se encuentran principalmente en el lado luminal. Se aislaron dos moléculas de lípido y detergente en la región αβ-1 a αβ-6 del complejo RC-LH114-W (Figura 5A), y cinco se aislaron en la región equivalente de RC-LH116 (Figura 5B). Se encontraron más lípidos en el otro lado del complejo, principalmente CDL, acumulados entre RC y αβ-7 a αβ-13 (Figura 5, A y B). Otros lípidos y detergentes estructuralmente resueltos se encuentran fuera del anillo LH1, y las cadenas de acilo bien resueltas se extienden entre las subunidades LH1, designadas provisionalmente como β-DDM en RC-LH114-W, y definidas como β-DDM en RC Una mezcla de β-DDM y POPC-LH116. Las posiciones similares de los lípidos quelantes y detergentes en nuestra estructura indican que son sitios de unión fisiológicamente relevantes (Figura S12A). Las posiciones de moléculas equivalentes en Tch también tienen buena consistencia. Gentle y Trv. La cepa 970 RC-LH1s (Figura S12, B a E) (9, 12) y los residuos de enlaces de hidrógeno del grupo de cabeza lipídica mostraron una conservación bastante buena en la alineación de secuencias (Figura S13), lo que indica que los CDL conservados que se unen a RC (24), estos sitios pueden conservarse en el complejo RC-LH1.
(A y B) Los péptidos RC-LH114-W (A) y RC-LH116 (B) se representan mediante dibujos, y los pigmentos mediante bastones, utilizando el esquema de colores de la Figura 1. Los lípidos se muestran en rojo y los detergentes en gris. La UQ unida a los sitios QA y QB de RC se muestra en amarillo, mientras que la UQ aislada se muestra en azul. (C y D) Las mismas vistas que (A) y (B), con los lípidos omitido. (E a ​​G) Vista ampliada de Q1(E), Q2(F) y Q3(G) de RC-LH116, con cadenas laterales que se influyen mutuamente. Los enlaces de hidrógeno se muestran como líneas discontinuas negras.
En RC-LH116, tanto RC QA como QB UQ, que participan en la transferencia de electrones en el proceso de separación de carga, se descomponen en sus sitios de unión. Sin embargo, en RC-LH114-W, la quinona QB no se ha resuelto y se analizará en detalle más adelante. Además de las quinonas QA y QB, dos moléculas de UQ queladas (ubicadas entre los anillos RC y LH1) se asignan en la estructura de RC-LH114-W de acuerdo con sus grupos de cabeza bien resueltos (ubicados en Q1 y Q2, respectivamente). espacio). Figura 5C). Dos unidades de isopreno se asignan a Q1, y el mapa de densidad resuelve las 10 colas de isopreno completas de Q2. En la estructura de RC-LH116, se resolvieron tres moléculas de UQ10 queladas (Q1 a Q3, Figura 5D), y todas las moléculas tienen una densidad clara en toda la cola (Figura 5, D a G). En las dos estructuras, las posiciones de los grupos de cabeza de quinona de Q1 y Q2 tienen una consistencia excelente (Figura S12F), y solo interactúan con RC. Q1 se encuentra en la entrada del hueco W de RC-LH114-W (Figura 1G y 5, C, D y E), y Q2 se encuentra cerca del sitio de unión de QB (Figura 5, C, D) y F). Los residuos conservados L-Trp143 y L-Trp269 están muy cerca de Q1 y Q2 y proporcionan posibles interacciones de apilamiento π (Figura 5, E y F, y Figura S12). L-Gln88, a 3,0 Å del oxígeno distal de Q1, proporciona un fuerte enlace de hidrógeno (Figura 5E); este residuo se conserva en todos los RC excepto en la relación más distante (Figura S13). La L-Ser91 sustituye de forma conservadora a Thr en la mayoría de los demás RC (Figura S13), se encuentra a 3,8 angstroms del oxígeno metílico de Q1 y puede proporcionar enlaces de hidrógeno débiles (Figura 5E). Q3 no parece tener una interacción específica, pero se encuentra en la región hidrofóbica entre la subunidad RC-M y la subunidad LH1-α 5 a 6 (Figura 5, D y G). Q1, Q2 y Q3 o quinonas queladas cercanas también se han resuelto en Tch. Gentle, Trv. Cepa 970 y Blc. La estructura iris (9, 10, 12) apunta a un sitio de unión auxiliar conservado para quinonas en el complejo RC-LH1 (Figura S12G). Los cinco UQ descompuestos en RC-LH116 concuerdan bien con el 5,8 ± 0,7 de cada complejo determinado por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), mientras que los tres UQ descompuestos en RC-LH114-W son inferiores al valor medido de 6,2 ± 0,3 (Fig. S14) indica que hay moléculas de UQ sin resolver en la estructura.
Los polipéptidos pseudosimétricos L y M contienen cada uno cinco TMH y forman un heterodímero que combina un dímero de BChl, dos monómeros de BChl, dos monómeros de bacteriófago (BPh), un hierro no hemo y una o dos moléculas de UQ10. Mediante la presencia de enlaces de hidrógeno en el grupo cetona terminal y su acumulación conocida en Rps, los carotenoides se incorporan a la subunidad M, denominada cis-3,4-dehidroorrodopín. Especies (25). El dominio de membrana externa de RC-H está anclado a la membrana mediante un único TMH. La estructura general de RC es similar a la de RC de tres subunidades de especies relacionadas (como Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Los macrociclos de BChl y BPh, la estructura carotenoide y el hierro no hemo se superponen dentro del rango de resolución de estas estructuras, al igual que el grupo de cabeza UQ10 en el sitio QA y la quinona QB en RC-LH116 (Figura S15).
La disponibilidad de dos estructuras RC con diferentes tasas de ocupación del sitio QB proporciona una nueva oportunidad para examinar los cambios conformacionales consistentes que acompañan la unión de la quinona QB. En el complejo RC-LH116, la quinona QB se encuentra en la posición "proximal" completamente unida (26), pero la separación de RC-LH114-W no tiene quinona QB. No hay quinona QB en RC-LH114-W, lo cual es sorprendente porque el complejo es activo, más que el complejo RC-LH116 con quinona QB estructuralmente resuelta. Aunque los dos anillos LH1 quelan alrededor de seis quinonas, cinco están estructuralmente resueltas en el anillo RC-LH116 cerrado, mientras que solo tres están estructuralmente limitadas en el anillo RC-LH114-W abierto. Este mayor desorden estructural puede reflejar el reemplazo más rápido de los sitios QB de RC-LH114-W, una cinética de quinona más rápida en el complejo y una mayor probabilidad de cruzar el bucle LH1. Sugerimos que la falta de UQ en el sitio RC QB de RC-LH114-W puede ser el resultado de un complejo más complejo y más activo, y el sitio QB de RC-LH114-W se ha congelado inmediatamente en el recambio de UQ. La etapa específica (la entrada al sitio QB se ha cerrado) refleja la conformación de esta actividad.
Sin QB, la rotación acompañante de L-Phe217 a una posición que es incompatible con la unión de UQ10, porque provocará una colisión espacial con la primera unidad de isopreno de la cola (Figura 6A). Además, los principales cambios conformacionales obvios son obvios, especialmente la hélice de (hélice corta en el bucle entre TMH D y E) donde L-Phe217 se desplaza al bolsillo de unión de QB y la rotación de L-Tyr223 (Figura 6A) Para romper el enlace de hidrógeno con el marco M-Asp45 y cerrar la entrada del sitio de unión de QB (Figura 6B). La hélice de pivota en su base, el Cα de L-Ser209 se desplaza 0,33 Å, mientras que el L-Val221Cα se desplaza 3,52 Å. No hay cambios observables en TMH D y E, que son superponibles en ambas estructuras (Figura 6A). Hasta donde sabemos, esta es la primera estructura en el RC natural que cierra el sitio QB. Una comparación con la estructura completa (unida a QB) muestra que, antes de que la quinona se reduzca, se requiere un cambio conformacional para que entre en la quinona. L-Phe217 rota para formar una interacción de apilamiento π con el grupo de cabeza de la quinona, y la hélice se desplaza hacia afuera, permitiendo que el esqueleto de L-Gly222 y la cadena lateral de L-Tyr223 formen una red de enlaces de hidrógeno con una estructura estable (Figura 6, A y C).
(A) Dibujo superpuesto de holograma (cadena L, naranja/cadena M, magenta) y estructura apo (gris), en el que los residuos clave se muestran en forma de una representación similar a una varilla. UQ10 está representado por una barra amarilla. La línea punteada indica los enlaces de hidrógeno formados en toda la estructura. (B y C) Representación de la superficie de la apolipoproteína y la estructura del anillo completo, resaltando el oxígeno de la cadena lateral de L-Phe217 en azul y L-Tyr223 en rojo, respectivamente. La subunidad L es naranja; las subunidades M y H no están coloreadas. (D y E) Apolipoproteína (D) y sitios RC QB completos (E) [color por (A) respectivamente] y PSII de Thermophilus thermophilus (verde, azul con quinona plástica; PDB ID: 3WU2) Alineación (58).
Inesperadamente, aunque varias estructuras de RC deficientes en QB sin LH1 están disponibles, los cambios conformacionales observados en este estudio no se han informado previamente. Estos incluyen la estructura de agotamiento de QB de Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) y Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), todos los cuales son casi iguales a su estructura QB general. La inspección minuciosa de 3PRC reveló que las moléculas de detergente LDAO (óxido de lauril dimetil amina) se unen a la entrada de la posición QB, lo que puede prevenir el reordenamiento en una conformación cerrada. Aunque LDAO no se descompone en la misma posición en 1EYS o 1OGV, estos RC se preparan utilizando el mismo detergente y, por lo tanto, pueden producir el mismo efecto. La estructura cristalina de Rba. El RC de Sphaeroides cocristalizado con citocromo c2 (PDB ID: 1L9B) también parece tener un sitio QB cerrado. Sin embargo, en este caso, la región N-terminal del polipéptido RC-M (que interactúa con el sitio de unión de QB a través del enlace de H del residuo de Tyr en la hélice Q) adopta una conformación antinatural, y el cambio conformacional de QB no se explora más a fondo (30). Lo que es tranquilizador es que no hemos visto este tipo de deformación del polipéptido M en la estructura RC-LH114-W, que es casi la misma que la región N-terminal del RC RC-LH116. También debe notarse que después de la erradicación de la antena LH1 basada en detergente, los RC de apolipoproteína en el PDB se resolvieron, lo que eliminó los depósitos internos de quinona y lípidos en el espacio entre el RC y la superficie interna del anillo LH1 circundante (31, 32). El RC conserva su funcionalidad porque conserva todos los cofactores, excepto la quinona QB descomponible, que es menos estable y suele perderse durante el proceso de preparación (33). Además, se sabe que la eliminación de LH1 y de lípidos cíclicos naturales del RC puede afectar sus funciones, como la reducción de la vida útil del estado P+QB con carga separada (31, 34, 35). Por lo tanto, especulamos que la existencia del anillo LH1 local que rodea al RC podría mantener el sitio QB cerrado, preservando así el entorno local cerca del QB.
Aunque la apolipoproteína (sin quinona QB) y la estructura completa representan solo dos instantáneas del recambio del sitio QB, en lugar de una serie de eventos, hay indicios de que la unión puede ser controlada para evitar la revinculación por hidroquinona para inhibir la inhibición del sustrato. La interacción del quinolol y la quinona cerca del sitio QB de la apolipoproteína puede ser diferente, lo que conduce a su rechazo por RC. Durante mucho tiempo se ha propuesto que los cambios conformacionales desempeñan un papel en la unión y reducción de quinonas. La capacidad de los RC congelados para reducir quinonas después de la adaptación a la oscuridad se ve afectada (36); la cristalografía de rayos X muestra que este daño se debe a que las quinonas QB están atrapadas en una conformación "distal" a aproximadamente 4,5 Å de la posición proximal activa (26, 37). Sugerimos que esta conformación de unión distal es una instantánea del estado intermedio entre la apolipoproteína y la estructura de anillo completo, que sigue a la interacción inicial con quinona y la apertura del sitio QB.
El RC tipo II presente en el complejo PSII de ciertas bacterias y cianobacterias fotótrofas, algas y plantas presenta conservación estructural y funcional (38). La alineación estructural que se muestra en la Figura 6 (D y E) resalta la similitud entre los RC del PSII y el sitio QB del complejo RC bacteriano. Esta comparación ha servido como modelo para el estudio de los sistemas estrechamente relacionados de unión y reducción de quinonas. Publicaciones previas sugerían que los cambios conformacionales se acompañan de la reducción de quinonas por el PSII (39, 40). Por lo tanto, considerando la conservación evolutiva del RC, este mecanismo de unión, previamente no observado, también podría ser aplicable al sitio QB del RC del PSII en plantas fotótrofas oxigenadas.
Las cepas Rps ΔpufW (deleción de pufW sin marcar) y PufW-His (proteína W marcada con His 10x en el extremo C-terminal expresada a partir del locus pufW natural) se describieron en nuestro trabajo previo (16). Estas cepas y el progenitor isogénico de tipo silvestre se recuperaron del congelador sembrando un pequeño número de células en una placa de agar PYE (5 g litro-1 cada una) (almacenada en LB a -80 °C, que contenía 50 % (p/v) de proteína de glicerol, extracto de levadura y succinato) [1,5 % (p/v)]. La placa se incubó durante la noche en oscuridad a temperatura ambiente en condiciones anaeróbicas y, a continuación, se iluminó con luz blanca (~50 μmolm-2 s-1) proporcionada por bombillas halógenas OSRAM de 116 W (RS Components, Reino Unido) durante 3 a 5 días hasta que apareció una sola colonia. Una sola colonia se utilizó para inocular 10 ml de medio M22+ (41) suplementado con 0,1% (p/v) de casaminoácidos (en adelante denominado M22). El cultivo se cultivó en condiciones de bajo oxígeno en la oscuridad a 34°C con agitación a 180 rpm durante 48 horas, y luego se inocularon 70 ml del cultivo en las mismas condiciones durante 24 horas. Un cultivo semi-aeróbico con un volumen de 1 ml se utiliza para inocular 30 ml de medio M22 en una botella de vidrio transparente con tapa de rosca universal de 30 ml y se irradió con agitación (~50μmolm-2 s-1) durante 48 horas mediante una varilla agitadora de fuerza magnética estéril. Luego, 30 ml del cultivo se inocularon con aproximadamente 1 litro de cultivo en las mismas condiciones, que luego se utilizó para inocular aproximadamente 9 litros de cultivo iluminados a ~200 μmolm-2 s-1 durante 72 horas. Las células se recolectaron mediante centrifugación a 7132 RCF durante 30 minutos, se resuspendieron en ~10 ml de tris-HCl 20 mM (pH 8,0) y se almacenaron a -20 °C hasta que fueron necesarias.
Tras la descongelación, añadir cristales de desoxirribonucleasa I (Merck, Reino Unido), lisozima (Merck, Reino Unido) y dos comprimidos de inhibidor de la proteasa de la holoenzima Roche (Merck, Reino Unido) a las células resuspendidas. En una celda de presión francesa de 20.000 psi (Aminco, EE. UU.), las células se rompieron de 8 a 12 veces. Tras eliminar las células intactas y los restos insolubles mediante centrifugación a 18.500 RCF durante 15 minutos a 4 °C, la membrana se precipitó del lisado pigmentado mediante centrifugación a 113.000 RCF durante 2 horas a 43.000 °C. Desechar la fracción soluble y resuspender la membrana coloreada en 100 a 200 ml de tris-HCl 20 mM (pH 8,0) y homogeneizar hasta que no se observen agregados. La membrana suspendida se incubó en 20 mM de tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, EE. UU.) con 2 % (p/v) de β-DDM durante 1 hora en oscuridad a 4 °C con agitación suave. Posteriormente, se centrifugó a 70 °C para disolver 150 000 RCF a 4 °C durante 1 hora y eliminar los insolubles residuales.
La membrana solubilizante de la cepa ΔpufW se aplicó a una columna de intercambio iónico de DEAE Sepharosa de 50 ml con tres volúmenes de columna (VC) de tampón de unión [20 mM Tris-HCl (pH 8,0) con 0,03 % (p/v) de β-DDM]. La columna se lavó con dos tampones de unión de VC y, a continuación, con dos tampones de unión con 50 mM de NaCl. El complejo RC-LH116 se eluyó con un gradiente lineal de 150 a 300 mM de NaCl (en tampón de unión) a 1,75 VC, y el complejo de unión restante se eluyó con un tampón de unión con 300 mM de NaCl a 0,5 VC. Recopile el espectro de absorción entre 250 y 1000 nm. Conserve la fracción con una relación de absorbancia (A880/A280) superior a 1 entre 880 y 280 nm. Dilúyala dos veces en el tampón de unión y repita el mismo procedimiento en la columna DEAE durante la purificación. Diluya las fracciones con relaciones A880/A280 superiores a 1,7 y A880/A805 superiores a 3,0. Realice la tercera ronda de intercambio iónico y conserve las fracciones con relaciones A880/A280 superiores a 2,2 y A880/A805 superiores a 5,0. El complejo parcialmente purificado se concentró a ~2 ml en un filtro centrífugo Amicon con corte de peso molecular (MWCO) de 100.000 (Merck, Reino Unido) y se cargó en una columna de exclusión por tamaño Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, EE. UU.) con tampón de NaCl 200 mM. Posteriormente, se eluyó en el mismo tampón a 1,5 CV. Se recopilaron los espectros de absorción de la fracción de exclusión por tamaño y se concentraron con ratios A880/A280 superiores a 2,4 y A880/A805 superiores a 5,8 hasta obtener 100 A880. Se utilizaron inmediatamente para la preparación o el almacenamiento de la rejilla crio-TEM. Se mantuvo a -80 °C hasta su uso.
La membrana solubilizante de la cepa PufW-His se aplicó a una columna HisPrep FF Ni-NTA Sepharose de 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8,0) que contiene 200 mM NaCl y 0,03 % (p/p)) en tampón IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. La columna se lavó con cinco CV de tampón IMAC y, a continuación, con cinco CV de tampón IMAC que contenían histidina 10 mM. El complejo central se eluyó de la columna con cinco tampones IMAC que contenían histidina 100 mM. La fracción que contiene el complejo RC-LH114-W se concentra a ~10 ml en un tanque agitado equipado con un filtro Amicon 100.000 MWCO (Merck, Reino Unido), se diluye 20 veces con tampón de unión y, a continuación, se añade a 25 ml En la columna DEAE Sepharose, se utilizan de antemano cuatro CV unidos al tampón. Lavar la columna con cuatro tampones de unión de CV, luego eluir el complejo en ocho CV en un gradiente lineal de 0 a 100 mM de NaCl (en tampón de unión) y los cuatro CV restantes que contienen tampón de unión de 100 mM. Los complejos residuales eluidos en las fracciones de cloruro de sodio combinadas con la relación A880/A280 mayor de 2,4 y la relación A880/A805 mayor de 4,6 se concentraron a ~2 ml en un filtro centrífugo Amicon 100 000 MWCO y se llenaron con 1,5 CV IMAC en una columna de exclusión por tamaño Superdex 200 16/600 equilibrada con tampón de antemano, y luego se eluyeron en el mismo tampón sobre 1,5 CV. Recoger los espectros de absorción de las fracciones de exclusión por tamaño y concentrar los espectros de absorción con relaciones A880/A280 superiores a 2,1 y relaciones A880/A805 superiores a 4,6 hasta 100 A880, que se utilizan inmediatamente para la preparación de la rejilla TEM congelada o se almacenan a -80 °C hasta que se necesiten.
Se utilizó un congelador de inmersión Leica EM GP para preparar rejillas TEM de baja temperatura. El complejo se diluyó en tampón IMAC a una concentración de 50 A880 y, a continuación, se cargaron 5 μl en una malla de cobre recubierta de carbono QUANTIFOIL 1.2/1.3 recién descargada por incandescencia (Agar Scientific, Reino Unido). Se incubó la rejilla a 20 °C y 60 % de humedad relativa durante 30 s, se secó durante 3 s y se enfrió en etano líquido a -176 °C.
Los datos del complejo RC-LH114-W se registraron en el eBIC (Centro de Bioimagen Electrónica) (Fuente de Luz de Diamante Británica) con un microscopio Titan Krios, que funciona a un voltaje de aceleración de 300 kV, con un aumento nominal de 130 000× y una energía de - Elija un espacio de 20 eV. Se utilizó un Gatan 968 GIF Quantum con detector de pico K2 para registrar imágenes en modo de conteo para recopilar datos. El tamaño de píxel calibrado es de 1,048 Å y la tasa de dosis es de 3,83 e-Å-2s-1. Recopiló la película en 11 segundos y la dividió en 40 partes. Utilice el área recubierta de carbono para reenfocar el microscopio y luego recopile tres películas por orificio. En total, se recopilaron 3130 películas, con valores de desenfoque entre -1 y -3 μm.
Los datos del complejo RC-LH116 se recopilaron con el mismo microscopio en el Laboratorio de Bioestructura de Asterbury (Universidad de Leeds, Reino Unido). Se recopilaron en modo de conteo con un aumento de 130 k, y el tamaño de píxel se calibró a 1,065 Å con una dosis de 4,6 e-Å-2s-1. La película se grabó en 12 segundos y se dividió en 48 partes. En total, se recopilaron 3359 películas, con valores de desenfoque entre -1 y -3 μm.
Todo el procesamiento de datos se realiza en el pipeline de Relion 3.0 (42). Utilice Motioncorr 2 (43) para corregir el movimiento del haz mediante ponderación de dosis y, a continuación, utilice CTFFIND 4.1 (44) para determinar el parámetro CTF (función de transferencia de contraste). En la Figura 2. S16 se muestran fotomicrografías típicas tras estas etapas iniciales de procesamiento. La plantilla de selección automática se genera seleccionando manualmente aproximadamente 250 píxeles de 1000 partículas en un fotograma de 250 píxeles sin clasificación bidimensional (2D) de referencia, rechazando así las clasificaciones que presentan contaminación de la muestra o no presentan características discernibles. A continuación, se realizó la selección automática de todas las microfotografías, obteniéndose 849.359 partículas para el complejo RC-LH114-W y 476.547 para el complejo RC-LH116. Todas las partículas seleccionadas se han sometido a dos rondas de clasificación 2D sin referencia y, después de cada ejecución, se rechazan las partículas que cumplen con el área de carbono, la contaminación de la muestra, ninguna característica obvia o partículas muy superpuestas, lo que da como resultado 772 033 (90,9 %) y 359 678 (75,5 %) ) Las partículas se utilizan para la clasificación 3D de RC-LH114-W y RC-LH116 respectivamente. El modelo de referencia 3D inicial se generó utilizando el método de descenso de gradiente estocástico. Utilizando el modelo inicial como referencia, las partículas seleccionadas se clasifican en cuatro categorías en 3D. Utilizando el modelo de esta categoría como referencia, realice un refinamiento 3D en las partículas de la categoría más grande, luego utilice el filtro de paso bajo inicial de 15 Å para cubrir el área del disolvente, agregue 6 píxeles de bordes suaves y posprocese los píxeles para corregir la función de transferencia de modulación del pico Gatan K2 del detector superior. Para el conjunto de datos RC-LH114-W, este modelo inicial se modificó eliminando la fuerte densidad en los bordes de la máscara (desconectada de la densidad compleja del núcleo en UCSF Chimera). Los modelos resultantes (las resoluciones de RC-LH114-W y RC-LH116 son 3,91 y 4,16 Å, respectivamente) se utilizan como referencia para la segunda ronda de clasificación 3D. Las partículas utilizadas se agrupan en la clase 3D inicial y no contienen una fuerte correlación con el vecindario. Superposición o falta de características estructurales obvias. Después de la segunda ronda de clasificación 3D, se seleccionó la categoría con la resolución más alta [Para RC-LH114-W, una categoría es 377.703 partículas (44,5%), para RC-LH116, hay dos categorías, que suman un total de 260.752 partículas (54,7%) , Donde son iguales solo cuando se alinean después de la rotación inicial con una pequeña diferencia]. Las partículas seleccionadas se reextraen en una caja de 400 píxeles y se refinan mediante refinamiento 3D. La máscara de solvente se genera utilizando el filtro paso bajo inicial de 15 Å, la expansión del mapa de 3 píxeles y la máscara suave de 3 píxeles. Mediante el refinamiento CTF por partícula, la corrección de movimiento por partícula y la segunda ronda de refinamiento CTF por partícula, se realizan refinamiento 3D, enmascaramiento de solvente y posprocesamiento después de cada paso para refinar aún más la textura resultante. Utilizando el valor de corte FSC (coeficiente de correlación de Fourier) de 0,143, las resoluciones de los modelos finales de RC-LH114-W y RC-LH116 son de 2,65 y 2,80 Å, respectivamente. La curva FSC del modelo final se muestra en la Figura 2. S17.
Todas las secuencias de proteínas se descargaron de UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProt ID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) se utilizó para construir un modelo de homología de RC, que contiene las secuencias de proteínas de RC-L, RC-M y RC-H y la estructura cristalina de Rba. sphaeroides RC se utilizó como plantilla (PDB ID: 5LSE) (46). Utilice la herramienta "Ajustar mapa" de UCSF Chimera para ajustar el modelo generado al mapa (47), mejorar la estructura de la proteína y añadir el cofactor [4×BChl a (nombre del residuo de la biblioteca de monómeros = BCL), 2×BPh a (BPH), uno o dos tipos de UQ10 (U10), un hierro no hemo (Fe) y una 3,4-dihidrohexacarbonilcolina (QAK)] utilizando Coot (48). Dado que QAK no está disponible en la biblioteca de monómeros, se parametrizó con la herramienta eLBOW de PHENIX (49).
A continuación, se construyó la subunidad LH1. Inicialmente, se utilizó la herramienta de construcción automática en PHENIX (49) para construir automáticamente parte de la secuencia LH1 utilizando el mapa y las secuencias de las proteínas LH1-α y LH1-β como entrada. Seleccione la subunidad LH1 más completa, extráigala y cárguela en Coot, agregue manualmente la secuencia faltante en ella y refine manualmente toda la estructura antes de agregar dos BCls a (BCL) y una espiriloxantina (CRT) [de acuerdo con el Rps relevante La densidad del complejo LH1 y el contenido conocido de carotenoides. Especies (17)]. Copie la subunidad LH1 completa y utilice la "Herramienta de mapa de acoplamiento" de UCSF Chimera para acoplarla en el área adyacente no modelo de densidad LH1 y luego refínala en Coot; repita el proceso hasta que se hayan modelado todas las subunidades LH1. Para la estructura RC-LH114-W, al extraer la densidad no asignada en Coot, la proteína se segmenta de los componentes no proteicos restantes en el mapa USCF Chimera y se utiliza la herramienta Autobuild para establecer el modelo inicial y el modelado de las subunidades restantes (proteína-W). En PHENIX (49). Agregue cualquier secuencia faltante al modelo resultante en Coot (48) y luego refine manualmente toda la subunidad. La densidad no asignada restante se ajusta a la combinación de lípidos (ID de la biblioteca de monómeros PDB de CDL = CDL, POPC = 6PL y POPG = PGT), detergente β-DDM (LMT) y moléculas UQ10 (U10). Utilice la optimización de PHENIX (49) y la optimización manual en Coot (48) para perfeccionar el modelo inicial completo hasta que las estadísticas del modelo y la calidad visual del ajuste no se puedan mejorar más. Por último, utilice LocScale (50) para afinar el mapa local y luego realice varios otros ciclos de modelado de la densidad no asignada y optimización automática y manual.
Los péptidos, cofactores y otros lípidos y quinonas acoplados a sus respectivas densidades se muestran en las Figuras 1 y 2 (S18 a S23). La información estadística del modelo final se muestra en la Tabla S1.
A menos que se especifique lo contrario, los espectros de absorción UV/Vis/NIR se recopilaron en un espectrofotómetro Cary60 (Agilent, EE. UU.) a intervalos de 1 nm desde 250 nm a 1000 nm y un tiempo de integración de 0,1 s.
Diluir la muestra en una cubeta de cuarzo con una trayectoria de 2 mm hasta una A880 de 1 y obtener el espectro de absorción entre 400 y 1000 nm. Los espectros dicroicos circulares se obtuvieron con un espectropolarímetro Jasco 810 (Jasco, Japón) a intervalos de 1 nm entre 400 nm y 950 nm, a una velocidad de barrido de 20 nm min-1.
El coeficiente de extinción molar se determina diluyendo el complejo central a un A880 de aproximadamente 50. Diluya el volumen de 10 μl en 990 μl de tampón de unión o metanol, y recoja el espectro de absorción inmediatamente para minimizar la degradación de BChl. El contenido de BChl de cada muestra de metanol se calculó por el coeficiente de extinción a 771 nm de 54,8 mM-1 cm-1, y se determinó el coeficiente de extinción (51). Divida la concentración medida de BChl por 32 (RC-LH114-W) o 36 (RC-LH116) para determinar la concentración del complejo central, que luego se utiliza para determinar el espectro de absorción de la misma muestra recogida en el tampón Coeficiente de extinción. paralelo. Se tomaron tres mediciones repetidas para cada muestra, y la absorbancia promedio del máximo Qy de BChl se utilizó para el cálculo. El coeficiente de extinción de RC-LH114-W medido a 878 nm es 3280±140 mM-1 cm-1, mientras que el coeficiente de extinción de RC-LH116 medido a 880 nm es 3800±30 mM-1 cm-1.
La UQ10 se cuantificó según el método (52). En resumen, se realizó una HPLC de fase reversa (RP-HPLC) utilizando el sistema Agilent 1200 HPLC. Se disolvieron aproximadamente 0,02 nmol de RC-LH116 o RC-LH114-W en 50 μl de metanol:cloroformo 50:50 con 0,02 % (p/v) de cloruro férrico, e inyectó la Ultraesfera ODS de 4,6 mm de Beckman Coulter preequilibrada en 1 ml⁻ ... Se integró el pico del cromatograma de 275 nm a los 25,5 minutos, el cual no contenía ningún otro compuesto detectable. El área integrada se utiliza para calcular la cantidad molar de UQ10 extraída con referencia a la curva de calibración calculada a partir de la inyección de estándares puros de 0 a 5,8 nmol (Figura S14). Cada muestra se analizó en tres réplicas, y el error reportado corresponde a la DE del promedio.
Se preparó una solución que contenía el complejo RC-LH1 con una absorción Qy máxima de 0,1 con 30 μM de citocromo c2 de corazón de caballo reducido (Merck, Reino Unido) y de 0 a 50 μMUQ2 (Merck, Reino Unido). Se prepararon tres muestras de 1 ml en cada concentración de UQ2 y se incubaron durante la noche en oscuridad a 4 °C para asegurar una adaptación completa a la oscuridad antes de la medición. La solución se cargó en un espectrofotómetro modular OLIS RSM1000 equipado con una rejilla de llama de 300 nm/500 líneas, rendijas de entrada de 1,24 mm, central de 0,12 mm y de salida de 0,6 mm. Se colocó un filtro de paso largo de 600 nm a la entrada del fototubo de muestra y el tubo fotomultiplicador de referencia para excluir la luz de excitación. La absorbancia se monitoreó a 550 nm con un tiempo de integración de 0,15 s. La luz de excitación se emite desde el LED (diodo emisor de luz) M880F2 de 880 nm (Thorlabs Ltd., Reino Unido) a través de un cable de fibra óptica con una intensidad del 90 % mediante un controlador DC2200 (Thorlabs Ltd., Reino Unido) y se emite hacia la fuente de luz en un ángulo de 90°. El haz de medición se opone al espejo para devolver la luz que no fue absorbida inicialmente por la muestra. Se monitoreó la absorbancia 10 s antes de la iluminancia de 50 s. Posteriormente, se monitoreó la absorbancia durante 60 s en la oscuridad para evaluar el grado en que el quinolol reduce espontáneamente el citocromo c23+ (véase la Figura S8 para los datos sin procesar).
Los datos se procesaron ajustando una tasa inicial lineal de 0,5 a 10 s (dependiendo de la concentración de UQ2) y promediando las tasas de las tres muestras a cada concentración de UQ2. La concentración de RC-LH1, calculada mediante el coeficiente de extinción respectivo, se utilizó para convertir la tasa en la eficiencia catalítica, se graficaron en Origin Pro 2019 (OriginLab, EE. UU.) y se ajustaron al modelo de Michaelis-Menten para determinar los valores aparentes de Km y Kcat.
Para las mediciones de absorción transitoria, la muestra RC-LH1 se diluyó a ~2 μM en tampón IMAC con 50 mM de ascorbato sódico (Merck, EE. UU.) y 0,4 mM de terbutina (Merck, EE. UU.). Se utilizó ácido ascórbico como donador de electrones de sacrificio y terc-butaclofeno como inhibidor de QB para garantizar que el principal donador de RC se mantenga reducido (es decir, no fotooxidado) durante todo el proceso de medición. Se añadieron aproximadamente 3 ml de muestra a una celda rotatoria personalizada (de aproximadamente 0,1 m de diámetro y 350 RPM) con un recorrido óptico de 2 mm para asegurar que la muestra en el recorrido del láser tenga tiempo suficiente para adaptarse a la oscuridad entre pulsos de excitación. Utilice pulsos láser de ~100 fs para amplificar el sistema láser de Ti: zafiro (Spectra Physics, EE. UU.) para excitar la muestra a 880 nm a una frecuencia de repetición de 1 kHz (20 nJ para NIR o 100 nJ para Vis). Antes de recopilar los datos, exponga la muestra a la luz de excitación durante unos 30 minutos. La exposición provocará la inactivación del QA (posiblemente reduciendo el QA una o dos veces). Pero tenga en cuenta que este proceso es reversible porque después de un largo período de adaptación a la oscuridad, el RC volverá lentamente a la actividad de QA. Se utilizó un espectrómetro Helios (Ultrafast Systems, EE. UU.) para medir los espectros transitorios con un tiempo de retardo de -10 a 7000 ps. Utilice el software Surface Xplorer (Ultrafast Systems, EE. UU.) para desagrupar los conjuntos de datos, luego fusionarlos y estandarizarlos. Utilice el paquete de software CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituania) para usar el conjunto de datos combinados para obtener espectros diferenciales relacionados con la descomposición, o utilice una función que convolucione múltiples exponentes con la respuesta del instrumento para ajustar la evolución espectral de longitud de onda única en Origin (OriginLab, EE. UU.).
Como se mencionó anteriormente (53), se preparó una película fotosintética que contenía el complejo LH1, sin RC ni antena periférica LH2. La membrana se diluyó en 20 mM de Tris (pH 8,0) y se cargó en una cubeta de cuarzo con un paso óptico de 2 mm. Se utilizó un pulso láser de 30 nJ para excitar la muestra a 540 nm con un retardo de -10 a 7000 ps. Procese el conjunto de datos como se describe para la muestra Rps. pal.
La membrana se sedimentó por centrifugación a 150.000 RCF durante 2 horas a 4 °C, y luego su absorbancia a 880 nm se resuspendió en 20 mM tris-HCl (pH 8,0) y 200 mM NaCl. Disuelva la membrana agitando lentamente en 2 % (p/v) β-DDM durante 1 hora en la oscuridad a 4 °C. La muestra se diluyó en 100 mM carbonato de trietilamonio (pH 8,0) (TEAB; Merck, Reino Unido) a una concentración de proteína de 2,5 mg ml-1 (análisis Bio-Rad). El procesamiento posterior se realizó a partir del método publicado previamente (54), comenzando con la dilución de 50 μg de proteína en un total de 50 μl de TEAB que contenía 1 % (p/v) de laurato de sodio (Merck, Reino Unido). Tras sonicar durante 60 s, se redujo con 5 mM de tris(2-carboxietil)fosfina (Merck, Reino Unido) a 37 °C durante 30 minutos. Para la S-alquilación, incubar la muestra con 10 mM de metil S-metiltiometanosulfonato (Merck, Reino Unido) y añadirlo desde una solución madre de isopropanol 200 mM durante 10 minutos a temperatura ambiente. La digestión proteolítica se llevó a cabo añadiendo 2 μg de la mezcla de tripsina/endoproteinasa Lys-C (Promega, Reino Unido) e incubando a 37 °C durante 3 horas. El surfactante laurato se extrajo añadiendo 50 μl de acetato de etilo y 10 μl de ácido trifluoroacético (TFA) de grado LC al 10 % (v/v; Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) y agitando en vórtex durante 60 s. La separación de fases se promovió mediante centrifugación a 15.700 RCF durante 5 minutos. Según el protocolo del fabricante, se utilizó una columna de centrifugación C18 (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) para aspirar y desalinizar cuidadosamente la fase inferior que contenía el péptido. Tras el secado por centrifugación al vacío, la muestra se disolvió en 0,5 % de TFA y 3 % de acetonitrilo, y se analizaron 500 ng mediante cromatografía de RP de nanoflujo acoplada a espectrometría de masas, utilizando los parámetros del sistema descritos previamente.
Utilice MaxQuant v.1.5.3.30 (56) para la identificación y cuantificación de proteínas y busque en la base de datos del proteoma de Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Los datos de proteómica por espectrometría de masas se han depositado en la Alianza ProteomeXchange a través del repositorio de socios PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) con el identificador de conjunto de datos PXD020402.
Para el análisis por RPLC acoplado a espectrometría de masas de ionización por electrospray, el complejo RC-LH1 se preparó a partir de Rps de tipo silvestre. Utilizando el método publicado previamente (16), la concentración de proteína producida en células palustris fue de 2 mg ml-1 en 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl y 0,03 % (p/v) β- (análisis Bio-Rad) ) DDM. De acuerdo con el protocolo del fabricante, utilice el kit de purificación 2D (GE Healthcare, EE. UU.) para extraer 10 μg de proteína por método de precipitación y disuelva el precipitado en 20 μl de ácido fórmico (AF) al 60 % (v/v), acetonitrilo al 20 % (v/v) y agua al 20 % (v/v). Se analizaron cinco microlitros por RPLC (Dionex RSLC) acoplado a espectrometría de masas (Maxis UHR-TOF, Bruker). Utilice la columna MabPac de 1,2 × 100 mm (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) para la separación a 60 °C y 100 μl min-1, con un gradiente del 85 % (v/v) de disolvente A [0,1 % (v/v) FA y 0,02 % (v/v) solución acuosa de TFA] al 85 % (v/v) de disolvente B [0,1 % (v/v) FA y 0,02 % (v/v) en 90 % (v/v) acetonitrilo TFA]. Utilizando una fuente de ionización por electrospray estándar y los parámetros predeterminados durante más de 60 minutos, el espectrómetro de masas obtiene de 100 a 2750 m/z (relación masa-carga). Con la ayuda de la herramienta FindPept del portal de recursos bioinformáticos ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), asigne el espectro de masas a las subunidades del complejo.
Las células se cultivaron durante 72 horas bajo 100 ml de luz NF-baja (10 μMm-2 s-1), media (30 μMm-2 s-1) o alta (300 μMm-2 s-1). Se utilizó medio M22 (en el que se omite el sulfato de amonio y se reemplaza el succinato de sodio por acetato de sodio) en una botella con tapa de rosca de 100 ml (23). En cinco ciclos de 30 s, se introdujeron microesferas de vidrio de 0,1 micras en una proporción volumétrica de 1:1 para lisar las células y se enfriaron en hielo durante 5 minutos. La materia insoluble, las células intactas y las microesferas de vidrio se eliminaron mediante centrifugación a 16 000 RCF durante 10 minutos en una microcentrífuga de sobremesa. La membrana se separó en un rotor Ti 70.1 con 100.000 RCF en 20 mM tris-HCl (pH 8,0) con un gradiente de sacarosa de 40/15 % (p/p) durante 10 horas.
Como se describió en nuestro trabajo previo, inmunodetección de la etiqueta His en PufW (16). En resumen, el complejo central purificado (11,8 nM) o la membrana que contenía la misma concentración de RC (determinada por oxidación, restando el espectro de diferencia reducido y ajustando la carga en el gel teñido) en tampón de carga SDS 2x (Merck, Reino Unido) se diluyó dos veces. Las proteínas se separaron en una réplica de gel NuPage bis-tris al 12 % (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido). Un gel se tiñó con azul brillante de Coomassie (Bio-Rad, Reino Unido) para cargar y visualizar la subunidad RC-L. La proteína del segundo gel se transfirió a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) activado con metanol (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) para el inmunoensayo. La membrana de PVDF se bloqueó en 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v/v) Tween-20 y 5% (p/v) de leche desnatada en polvo, y luego se incubó con el anticuerpo primario anti-His (en diluir el tampón de anticuerpos [50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl y 0,05% (v/v) Tween-20] en 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, EE.UU.) durante 4 horas. Después de lavar 3 veces durante 5 minutos en tampón de anticuerpos, la membrana se combinó con anticuerpo secundario anti-ratón de peroxidasa de rábano picante (Sigma-Aldrich, Reino Unido) (diluido 1:10 000 en tampón de anticuerpos). Se incubó para permitir la detección (5 minutos después de 3 lavados en tampón de anticuerpos) utilizando sustrato de quimioluminiscencia WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Italia) y Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Reino Unido).
Dibujando la distribución de intensidad de cada gel teñido o carril de inmunoensayo, integrando el área bajo el pico y calculando la razón de intensidad de RC-L (gel teñido) y proteína-W (inmunoensayo), procese la imagen en ImageJ (57). Estas razones se convirtieron a razones molares asumiendo que la razón de RC-L a proteína-W en la muestra pura de RC-LH114-W era 1:1 y normalizando todo el conjunto de datos en consecuencia.
Para obtener materiales complementarios para este artículo, consulte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
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La estructura de alta resolución del complejo de trampa de luz 1 en el centro de reacción proporciona nuevos conocimientos sobre la dinámica de las quinonas.
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