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El complejo de captación de luz del centro de reacción 1 (RC-LH1) es el componente fotosintético central de las bacterias fototróficas púrpuras. Presentamos dos estructuras de microscopía crioelectrónica del complejo RC-LH1 de Rhodopseudomonas palustris. La estructura de resolución de 2,65 Å del complejo RC-LH114-W consta de 14 bucles de subunidades LH1 que rodean el RC, interrumpidos por la proteína W, mientras que el complejo sin proteína W es una composición completa del RC rodeada por el RC. El bucle cerrado de 16 subunidades LH1. La comparación de estas estructuras proporciona información sobre la dinámica de la quinona en el complejo RC-LH1, incluyendo cambios conformacionales previamente no determinados al unirse la quinona en el sitio QB del RC, así como la ubicación de sitios de unión de quinona auxiliares, que ayudan a transferirlas al RC. La estructura única de la proteína W impide el cierre del bucle LH1, creando así un canal para acelerar el intercambio de quinona/quinolona.
La energía proporcionada por la fotosíntesis puede sustentar casi toda la vida en la Tierra y tiene un gran potencial para la biotecnología solar. Además de promover la fotosíntesis global, las bacterias fototróficas púrpuras también exhiben diversos modos de energía y capacidades metabólicas. Pueden evitar la fotosíntesis y crecer como bacterias heterótrofas en la oscuridad, fijar nitrógeno y dióxido de carbono, producir hidrógeno y degradar compuestos aromáticos (1-3). Para proporcionar energía a estos procesos, la luz debe convertirse rápida y eficientemente en energía química. Este proceso comienza cuando el complejo antena de captura de luz absorbe la luz y transfiere la energía capturada al centro de reacción (CR), iniciando así la separación de cargas (4-7). La unidad básica de la fotosíntesis en las bacterias fototróficas púrpuras está compuesta por un CR de tipo 2, rodeado por el complejo de captación de luz 1 (LH1), formando el complejo central CR-LH1. El LH1 está formado por una serie de heterodímeros αβ curvados, cada uno de los cuales une dos moléculas de clorofila bacteriana (BChl) a y uno o dos carotenoides (8-12). La antena LH1 más simple consta de 16 o 17 heterodímeros αβ que rodean a RC (9-13) en un bucle cerrado, pero en otros complejos centrales, los péptidos transmembrana interrumpen la continuidad del LH1 circundante, promoviendo así la difusión de quinol/quinona entre RC y el complejo citocromo bc1 (11, 13-15). La planta fototrófica púrpura Rhodopseudomonas (Rps.) es un organismo modelo que puede entender la transferencia de energía y electrones que sustenta la fotosíntesis. La primera estructura cristalina de Rps. El modelo del complejo RC-LH1 de palustris es RC, rodeado por 15 bucles heterodiméricos LH1, que son interrumpidos por una proteína desconocida llamada "Proteína W" (14). La Proteína-W fue posteriormente identificada como RPA4402, que es una proteína no caracterizada de 10,5 kDa con tres hélices transmembrana (TMH) predichas (16). Proponemos renombrar el gen rpa4402 que codifica la proteína W como pufW para que sea coherente con la nomenclatura utilizada para los genes que codifican las subunidades RC-L, M (pufL, pufM) y LH1α, β (pufA, pufB). Curiosamente, la proteína W solo está presente en aproximadamente el 10% de RC-LH1, lo que revela que Rps. palustris produce dos complejos RC-LH1 diferentes. Aquí, informamos las estructuras de crio-EM (crio-EM) de alta resolución de dos complejos centrales, uno con la proteína W y 14 heterodímeros αβ, y el otro sin la proteína W y un bucle LH1 de 16 heterodímeros cerrado. Nuestra estructura representa un cambio radical en la comprensión del complejo RC-LH1 de Rps. palustris, ya que hemos analizado la población homogénea de cada variante y tenemos la resolución suficiente para asignar claramente cada péptido y pigmentos unidos, así como los lípidos y quinonas relacionados. La comparación de estas estructuras muestra que las tres proteínas TMH-W, que hasta ahora no se habían encontrado en ningún otro complejo RC-LH1, generan un canal de quinona para acelerar el intercambio de quinona/quinolona. Se han identificado varios sitios de unión de lípidos y quinonas conservados, y hemos revelado un nuevo cambio conformacional tras la combinación de quinona y RC, que podría ser adecuado para el RC del fotosistema II (PSII) de organismos fototróficos oxigenados. Nuestros hallazgos aportan nuevos conocimientos sobre la cinética de la unión e intercambio de quinona/quinolona en el complejo central RC-LH1 de bacterias fototróficas púrpuras.
Para facilitar un estudio detallado de los dos complejos encontrados en Rps. palustris, aislamos cada RC-LH1 mediante métodos bioquímicos. El complejo deficiente en proteína W (en adelante denominado ΔpufW) se purificó a partir de la cepa que carece del gen pufW (16), y solo se puede producir un complejo RC-LH1. El complejo que contiene la proteína W es producido por una cepa. La proteína W de esta cepa está modificada con una etiqueta 10x His en su extremo C, de modo que el complejo que contiene la proteína W puede combinarse eficazmente con la mayor parte de la proteína W deficiente mediante la inmovilización de metal. El complejo se separa eficazmente (16) mediante cromatografía de afinidad (IMAC).
Como se muestra en la Figura 1, ambos complejos contienen un RC de tres subunidades (RC-L, RC-M y RC-H) rodeado por una antena LH1. La estructura de 2,80 Å del complejo sin proteína W muestra 16 heterodímeros αβ, que forman un bucle LH1 cerrado que rodea completamente al RC, denominado en adelante complejo RC-LH116. La estructura de 2,65 Å del complejo que contiene la proteína W presenta un LH1 de 14 heterodímeros interrumpido por la proteína W, denominado en adelante RC-LH114-W.
(A y B) Representación de la superficie del compuesto. (C y D) Pigmentos unidos expresados ​​en varillas. (E y F) Los complejos observados desde la superficie citoplasmática tienen los péptidos y las subunidades LH1 representados en dibujos animados, y están numerados en el sentido de las agujas del reloj desde el espacio proteína-W [consistente con la numeración Rba. complejo sphaeroides (13)]. Para LH1-α, el color de la subunidad proteica es amarillo; para LH1-β, el color de la subunidad proteica es azul; para proteína-W, la proteína es roja; para RC-H, es cian; para RC-L, es naranja; para RC-M, magenta. Los cofactores están representados por varillas, el verde representa las moléculas de BChl y BPh a, el púrpura representa los carotenoides y el amarillo representa las moléculas de UQ10. (G y H) Vista ampliada del espacio proteína-W en la región equivalente del complejo RC-LH114-W (G) y del complejo RC-LH116 (H). Los cofactores se muestran en forma de diagrama de relleno espacial; la quinona quelada se muestra en azul. El espacio entre la proteína y el tungsteno se resalta con una línea discontinua azul en (G), y los pequeños orificios por donde se difunde la quinona/quinolol en el anillo LH116 se resaltan con una línea discontinua negra en (H).
Figura 1 (A y B) muestra el RC rodeado por conjuntos abiertos o cerrados de heterodímeros LH1αβ, cada uno de los cuales se une a dos BChl y un carotenoide (Figura 1, C y D). Estudios previos han demostrado que Rps es el complejo LH1. En la vía biosintética de la xantina de espirulina, estas especies contienen poblaciones mixtas de carotenoides (17). Sin embargo, la espiropirroxantina es el carotenoide dominante y su densidad es satisfactoria. Por lo tanto, elegimos modelar la espiroxantina en todos los sitios de unión de LH1. Los polipéptidos alfa y beta son TMH simples con regiones externas de membrana cortas (Figura 1, A, B, E y F). Aunque no se observó la densidad de 17 residuos en el extremo C, el polipéptido alfa se escindió de Met1 a Ala46 en ambos complejos. El polipéptido β se redujo de Gly4 a Tyr52 en RC-LH116, y de Ser5 a Tyr52 en RC-LH114-W. No se observó densidad de 3 o 4 residuos N-terminales o 13 residuos C-terminales (Figura S1). El análisis de espectrometría de masas del complejo mixto RC-LH1 preparado a partir de la cepa de tipo silvestre mostró que la región faltante fue el resultado de la escisión heteróloga de estos péptidos (Figuras S1 y S2). También se observó la formilación N-terminal de α-Met1 (f). El análisis mostró que el péptido α consta de los residuos fMet1 a Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, y el péptido β consta de los residuos Ser2 a Ala53, lo que está en buena concordancia con el mapa de densidad de EM de baja temperatura.
La coordinación de α-His29 y β-His36 hace que las BChls se enfrenten; cada heterodímero αβ se ensambla con sus vecinos para formar un bucle abierto (RC-LH114-W) o un bucle cerrado (RC-LH116) alrededor del RC La matriz de pigmentos acoplados por excitones (Figura 1, C y D). En comparación con la banda de 877 nm de RC-LH114-W, el desplazamiento al rojo de la absorción de 880 nm de RC-LH116 es de 3 nm (Figura 2A). Sin embargo, el espectro de dicroísmo circular es casi el mismo (Figura 2B), lo que indica que, aunque hay una clara diferencia entre los bucles abiertos y cerrados, el entorno local de las BChls es muy similar. El desplazamiento al rojo de la absorción puede ser el resultado de la reducción del movimiento térmico y el aumento de la estabilidad en el bucle cerrado (18, 19), el cambio en el acoplamiento del pigmento causado por el bucle cerrado (20, 21), o una combinación de estos dos efectos (11).
(A) Espectro de absorción ultravioleta/visible/infrarrojo cercano, cuyos picos están marcados con sus pigmentos correspondientes y normalizados al pico de BPh a 775 nm. (B) Espectro de dicroísmo circular normalizado a la absorbancia de BChl a 805 nm. (C y D) Espectros ΔA seleccionados de los espectros de absorción resueltos en el tiempo del complejo RC-LH114-W (C) y del complejo RC-LH116 (D). Para una mejor comparabilidad, todos los espectros están normalizados a ∆A de −A a 0,2 ps. (E) La tasa de oxidación del citocromo c2 después de la irradiación en presencia de varias concentraciones de UQ2 (ver Figura S8 para datos brutos). (F) En células cultivadas bajo luz de baja, media o alta intensidad (10, 30 o 300 μM m-2 s-1, respectivamente), la proteína W y las subunidades RC-L en el complejo purificado y la relación de membrana separada. Determinar el nivel de proteína mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS e inmunoensayo (ver Figura S9 para los datos brutos). Determinar la proporción relativa al complejo purificado RC-LH114-W. La proporción estequiométrica de RC-L a proteína-W del complejo es 1:1.
Los BChl en la posición 1 en el bucle αβ14 deformado de RC-LH114-W (Figura 1, A, C y E) están más cerca del donador primario RC (P) por 6,8 Å que los BChl equivalentes en RC-LH116 (Figura 1, B, D y F, y Figura S3); sin embargo, la cinética de absorción transitoria de los dos complejos muestra que para RC-LH114-W y RC-LH116, las constantes de tiempo de transferencia de energía de excitación de LH1 a RC son 40 ±4 y 44 ±3 ps (Figura 2). , C y D, Figura S4 y Tabla S2). Tampoco hay una diferencia significativa en la transferencia electrónica dentro de RC (Figura S5 y texto suplementario relacionado). Sospechamos que la estrecha correspondencia del tiempo de transferencia de energía entre LH1 y RC-P se debe a la distancia, el ángulo y la energía potencial similares de la mayoría de los BChl en los dos bucles LH1. Parece que explorar el patrón de energía LH1 para alcanzar la distancia mínima no es más rápido que la transferencia directa de energía desde sitios subóptimos a RC. El bucle LH1 de bucle abierto en RC-LH114-W también puede experimentar un movimiento térmico insignificante en condiciones de baja temperatura para el análisis estructural, y hay una conformación de anillo αβ14 más larga a temperatura ambiente desde la distancia de pigmentación de βBChls en la posición de RC 1.
El complejo RC-LH116 contiene 32 BChls y 16 carotenoides, y su disposición general es la misma que la obtenida de Thermochromatium (Tch.) pidpidum [ID 5Y5S del Protein Data Bank (PDB)] (9), la cepa Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (ID 7C9R del PDB) (12) y las algas verdes (Blc.viridis) (ID 6ET5 del PDB) (10). Después de la alineación, solo se observaron pequeñas desviaciones en las posiciones de los heterodímeros αβ, especialmente 1-5, 15 y 16 (Figura S6). La presencia de la proteína-W tiene un impacto significativo en la estructura de LH1. Sus tres TMH están conectados por bucles cortos, con el N-terminal en el lado luminal del complejo y el C-terminal en el lado citoplasmático (Figuras 1A y 3, A a D). La proteína W es mayoritariamente hidrofóbica (Figura 3B), y TMH2 y TMH3 interactúan con LH1αβ-14 para formar una superficie transmembrana (Figura 3, B y E a G). La interfaz está compuesta principalmente por residuos de Phe, Leu y Val en la región transmembrana. Estos residuos se apilan con aminoácidos hidrofóbicos y pigmentos αβ-14. Algunos residuos polares también contribuyen a la interacción, incluido el enlace de hidrógeno entre W-Thr68 y β-Trp42 en la superficie de la cavidad del complejo (Figura 3, F y G). En la superficie del citoplasma, Gln34 es adyacente al grupo ceto de los carotenoides αβ-14. Además, se resolvió la molécula de n-dodecil β-d-maltósido (β-DDM), y su cola hidrofóbica se extiende hasta la interfaz entre la proteína W y αβ-14, y la cola lipídica puede estar ubicada en el cuerpo. También observamos que las regiones de resolución del extremo C-terminal de las proteínas W y RCH están muy próximas, pero no lo suficientemente cerca como para formar interacciones específicas (Figura 1, A y E). Sin embargo, es posible que existan interacciones en los aminoácidos del extremo C-terminal no resueltos de estas dos proteínas, lo que podría proporcionar un mecanismo para el reclutamiento de la proteína W durante el ensamblaje del complejo RC-LH114-W.
(A) La proteína W, que se enfrenta a la interfaz con LH1αβ14 en forma de caricatura, tiene una cadena lateral en forma de varilla (roja), mostrada en una parte del diagrama de potencial electrostático (superficie gris transparente con un nivel de contorno de 0,13). (B) La proteína W representada por una superficie de color hidrofóbico. Las áreas polares y cargadas se muestran en cian, las áreas hidrofóbicas se muestran en blanco y las áreas fuertemente hidrofóbicas se muestran en naranja. (C y D) La proteína W representada en caricatura, su orientación es la misma que en (A) (C), y rotada 180° (D). Según la posición en la secuencia, los residuos distinguibles adoptan un esquema de color arcoíris, donde el N-terminal es azul y el C-terminal es rojo. (E) La proteína W en la misma vista que en (A), y los residuos en la interfaz de la proteína W:LH1 están representados por varillas con marcas adjuntas. (F) La proteína W está rotada 90° con respecto a (E) y LH1αβ14 en la representación esquemática, y con respecto a los residuos de la interfaz en la representación de barras. Los residuos sobresalientes del polipéptido beta están etiquetados. El cofactor se muestra como una barra que coincide con el color de la Figura 1, el β-DDM descompuesto se muestra en gris y el oxígeno se muestra en rojo. (G) La vista en (F) está rotada 180°, con los residuos prominentes del polipéptido alfa etiquetado.
La proteína W reemplaza un heterodímero αβ (el 15º en la Figura 1F), impidiendo así el cierre del bucle e inclinando los tres primeros heterodímeros αβ. Se observó que el ángulo de inclinación máximo del primer heterodímero αβ-1 con respecto a la normal de la película fue de 25° a 29° (Figura 1, A y E), que se formó por la inclinación de 2° a 8° de αβ-1 en RC A sharp contrast-LH116 (Figura 1, B y F). El segundo y tercer heterodímeros están inclinados a 12° a 22° y 5° a 10°, respectivamente. Debido al impedimento estérico de RC, la inclinación de αβ-1 no incluye el segundo par de αβ (que corresponde al 16º αβ en la Figura 1F), formando así un claro hueco en el anillo LH1 (Figura 1, A y E). Debido a la falta de dos heterodímeros αβ, acompañada de la pérdida de cuatro BChl y dos carotenoides, ninguno de los carotenoides se une a la subunidad αβ-1 retorcida, lo que da como resultado un anillo LH114-W que contiene 13 carotenoides vegetarianos y 28 BChl. Las estimaciones de resolución local de los dos complejos en las regiones αβ1 a 7 son más bajas que las del resto del bucle LH1, lo que puede reflejar la plasticidad inherente de la subunidad LH1 adyacente al sitio RC QB (Figura 4).
Las imágenes de RC-LH114-W (A y B) y RC-LH116 (C y D) se muestran desde la misma vista superior/lateral (A y B) (A y C) y la superficie de la cavidad de la Fig. 1 (B y D). Las claves de color se muestran a la derecha.
El único otro complejo central característico con una relación estequiométrica de 1:14 es el dímero RC-LH1-PufX de Rhodococcus sphaeroides (Rba.) (13). Sin embargo, la proteína W y PufX no tienen homología obvia y tienen un impacto significativo en sus respectivas estructuras LH1. PufX es un único TMH con un dominio citoplasmático N-terminal que interactúa con el lado citoplasmático de la subunidad RC-H (13) en una posición correspondiente a Rps. palustris LH116αβ-16. PufX crea un canal para el intercambio de quinona/quinolona entre RC-LH1 y el complejo citocromo bcl y está presente en todos los complejos centrales de Rba. sphaeroides (13). Aunque la interfaz monómero-monómero está en Rba. El dímero sphaeroides RC-LH1-PufX se encuentra en la posición de unión de la proteína W en RC-LH114-W, y el espacio inducido por PufX y la proteína W está en una posición equivalente (Figura S7A). El espacio en RC-LH114-W también se alinea con el hipotético canal de quinona (8) de Pseudomonas rosea LH1, que está formado por péptidos no relacionados con la proteína W o PufX (Figura S7B). Además, el canal de quinona en Blc. The emerald green LH1 formado al excluir una subunidad γ (7) se encuentra en una posición similar (Figura S7C). Aunque mediado por diferentes proteínas, la aparición de estos canales de quinona/quinolol en una posición común en el complejo RC-LH1 parece ser un ejemplo de evolución convergente, lo que indica que el espacio creado por la proteína W puede actuar como un canal de quinona.
El espacio en el bucle LH114-W permite la formación de una región de membrana continua entre el espacio interno del complejo RC-LH114-W y la membrana principal (Figura 1G), en lugar de conectar los dos dominios a través de un poro proteico como en las proteínas. El complejo RC-LH116 es similar a un complejo Tch. Needle cerrado (22) (Figura 1H). Dado que la difusión de quinona a través de la membrana es más rápida que la difusión a través del estrecho canal proteico, el bucle LH114-W abierto puede permitir un recambio RC más rápido que el bucle LH116 cerrado, y la difusión de quinona hacia el RC puede ser más restringida. Para probar si la proteína W afecta la conversión de quinonas a través del RC, realizamos un ensayo de oxidación de citocromo en una cierta concentración de ubiquinona 2 (UQ2) (un análogo de la UQ10 natural con una cola de isopreno más corta) (Figura 2E). Aunque la presencia de quinona quelada dificulta la determinación precisa de la constante de Michaelis aparente (RC-LH114-W y RC-LH116 son adecuados para 0,2±0,1 μM y 0,5±0,2 μM, respectivamente), la velocidad máxima de RC-LH114-W (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) es un 28±5% mayor que la de RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Inicialmente estimamos que la proteína-W está presente en aproximadamente el 10% del complejo central (16); aquí, las tasas de ocupación de las células de crecimiento de luz baja, media y alta son 15±0,6%, 11±1% y 0,9±0,5%, respectivamente (Figura 2F). La comparación cuantitativa de la espectrometría de masas mostró que la adición de la etiqueta de histidina no redujo la abundancia relativa de la proteína-W en comparación con las cepas de tipo silvestre (P = 0,59), por lo que estos niveles no son un artefacto de la proteína-W modificada (Figura S10). Sin embargo, esta baja ocupación de la proteína-W en el complejo RC-LH1 puede permitir que algunos RC se inviertan a una velocidad acelerada, mitigando así el intercambio más lento de quinona/quinolona en el complejo RC-LH116. Observamos que la alta tasa de ocupación de luz es inconsistente con los datos transcriptómicos recientes, que indican que la expresión del gen pufW aumenta bajo luz intensa (Figura S11) (23). La diferencia entre la transcripción de pufW y la incorporación de la proteína W al complejo RC-LH1 es confusa y puede reflejar la compleja regulación de la proteína.
En RC-LH114-W, se asignan y modelan 6 moléculas de cardiolipina (CDL), 7 de fosfatidilcolina (POPC), 1 de fosfatidilglicerol (POPG) y 29 de β-DDM. RC-LH116 (Figura 5, A y B). En estas dos estructuras, la CDL se ubica casi en el lado citoplasmático del complejo, mientras que la POPC, el POPG y la β-DDM se ubican principalmente en el lado luminal. Se aislaron dos moléculas de lípidos y detergentes en la región αβ-1 a αβ-6 del complejo RC-LH114-W (Figura 5A), y cinco se aislaron en la región equivalente de RC-LH116 (Figura 5B). Se encontraron más lípidos en el otro lado del complejo, principalmente CDL, acumulados entre RC y αβ-7 a αβ-13 (Figura 5, A y B). Otros lípidos y detergentes resueltos estructuralmente se encuentran fuera del anillo LH1, y cadenas acilo bien resueltas se extienden entre las subunidades LH1, designadas tentativamente como β-DDM en RC-LH114-W, y definidas como β-DDM en RC Una mezcla de β-DDM y POPC-LH116. Las posiciones similares de los lípidos quelantes y detergentes en nuestra estructura indican que son sitios de unión fisiológicamente relevantes (Figura S12A). Las posiciones de las moléculas equivalentes en Tch también tienen buena consistencia. Gentle y Trv. La cepa 970 RC-LH1s (Figura S12, B a E) (9, 12) y los residuos de enlaces de hidrógeno del grupo de cabeza lipídica mostraron una conservación bastante buena en la alineación de secuencias (Figura S13), lo que indica que el CDL conservado que se une a RC (24), estos sitios pueden estar conservados en el complejo RC-LH1.
(A y B) Los péptidos RC-LH114-W (A) y RC-LH116 (B) están representados por dibujos animados, y los pigmentos por varillas, utilizando el esquema de color de la Figura 1. Los lípidos se muestran en rojo y los detergentes en gris. La UQ unida a los sitios RC QA y QB es amarilla, mientras que la UQ aislada es azul. (C y D) Las mismas vistas que (A) y (B), con los lípidos omitidos. (E a ​​G) Vista ampliada de Q1(E), Q2(F) y Q3(G) de RC-LH116, con cadenas laterales que se influyen entre sí. Los enlaces de hidrógeno se muestran como líneas discontinuas negras.
En RC-LH116, tanto RC QA como QB UQ, que participan en la transferencia de electrones en el proceso de separación de carga, se descomponen en sus sitios de unión. Sin embargo, en RC-LH114-W, la quinona QB no se ha resuelto y se discutirá en detalle más adelante. Además de las quinonas QA y QB, dos moléculas de UQ queladas (ubicadas entre los anillos RC y LH1) se asignan en la estructura de RC-LH114-W de acuerdo con sus grupos de cabeza bien resueltos (ubicados en Q1 y Q2, respectivamente). espacio). Figura 5C). Dos unidades de isopreno se asignan a Q1, y el mapa de densidad resuelve las 10 colas de isopreno completas de Q2. En la estructura de RC-LH116, se resolvieron tres moléculas de UQ10 queladas (Q1 a Q3, Figura 5D), y todas las moléculas tienen una densidad clara a lo largo de la cola (Figura 5, D a G). En las dos estructuras, las posiciones de los grupos cabeza de quinona de Q1 y Q2 tienen una excelente consistencia (Figura S12F), y solo interactúan con RC. Q1 está ubicado en la entrada del hueco W de RC-LH114-W (Figura 1G y 5, C, D y E), y Q2 está ubicado cerca del sitio de unión de QB (Figura 5, C, D y F). Los residuos conservados L-Trp143 y L-Trp269 están muy cerca de Q1 y Q2 y proporcionan interacciones potenciales de apilamiento π (Figura 5, E y F, y Figura S12). L-Gln88, 3,0 Å del oxígeno distal de Q1, proporciona un fuerte enlace de hidrógeno (Figura 5E); este residuo está conservado en todos los RC excepto en la relación más distante (Figura S13). L-Ser91 se sustituye de forma conservativa por Thr en la mayoría de los demás RC (Figura S13), está a 3,8 Angstroms del oxígeno metílico de Q1 y puede proporcionar enlaces de hidrógeno débiles (Figura 5E). Q3 no parece tener una interacción específica, pero se encuentra en la región hidrofóbica entre la subunidad RC-M y la subunidad LH1-α 5 a 6 (Figura 5, D y G). Q1, Q2 y Q3 o quinonas queladas cercanas también se han resuelto en Tch. Gentle, Trv. Strain 970 y Blc. La estructura del iris (9, 10, 12) apunta a un sitio de unión de quinona auxiliar conservado en el complejo RC-LH1 (Figura S12G). Los cinco UQ descompuestos en RC-LH116 están en buena concordancia con el 5,8±0,7 de cada complejo determinado por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), mientras que los tres UQ descompuestos en RC-LH114-W son inferiores al valor medido de 6,2±0,3 (Fig. S14), lo que indica que hay moléculas de UQ no resueltas en la estructura.
Los polipéptidos L y M pseudo-simétricos contienen cada uno cinco TMH y forman un heterodímero que combina un dímero de BChl, dos monómeros de BChl, dos monómeros de bacteriófago (BPh), un hierro no hemo y una o dos moléculas de UQ10. A través de la presencia de enlaces de hidrógeno en el grupo cetona terminal y su conocida acumulación en Rps, los carotenoides se incorporan en la subunidad M, que se denomina cis-3,4-dehidroorodopina. Especie (25). El dominio de membrana externa de RC-H está anclado a la membrana por un único TMH. La estructura general de RC es similar a la RC de tres subunidades de especies relacionadas (como Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Los macrociclos de BChl y BPh, la estructura principal de carotenoide y el hierro no hemo se superponen dentro del rango de resolución de estas estructuras, al igual que el grupo de cabeza UQ10 en el sitio QA y la quinona QB en RC-LH116 (Figura S15).
La disponibilidad de dos estructuras RC con diferentes tasas de ocupación del sitio QB proporciona una nueva oportunidad para examinar los cambios conformacionales consistentes que acompañan a la unión de la quinona QB. En el complejo RC-LH116, la quinona QB se encuentra en la posición "proximal" completamente unida (26), pero la separación de RC-LH114-W no tiene quinona QB. No hay quinona QB en RC-LH114-W, lo cual es sorprendente porque el complejo es activo, más que el complejo RC-LH116 con la quinona QB estructuralmente resuelta. Aunque los dos anillos LH1 quelan alrededor de seis quinonas, cinco están estructuralmente resueltas en el anillo cerrado RC-LH116, mientras que solo tres están estructuralmente limitadas en el anillo abierto RC-LH114-W. Este mayor desorden estructural puede reflejar el reemplazo más rápido de los sitios QB de RC-LH114-W, una cinética de quinona más rápida en el complejo y una mayor probabilidad de cruzar el bucle LH1. Sugerimos que la falta de UQ en el sitio QB de RC-LH114-W puede ser el resultado de un complejo más complejo y más activo, y el sitio QB de RC-LH114-W se ha congelado inmediatamente en el recambio de UQ. La etapa específica (la entrada al sitio QB se ha cerrado) refleja la conformación de esta actividad.
Sin QB, la rotación concomitante de L-Phe217 a una posición que es incompatible con la unión de UQ10, porque causará una colisión espacial con la primera unidad de isopreno de la cola (Figura 6A). Además, los cambios conformacionales principales obvios son obvios, especialmente la hélice de (hélice corta en el bucle entre TMH D y E) donde L-Phe217 se desplaza al bolsillo de unión de QB y la rotación de L-Tyr223 (Figura 6A) para romper el enlace de hidrógeno con el marco M-Asp45 y cerrar la entrada del sitio de unión de QB (Figura 6B). La hélice de pivota en su base, el Cα de L-Ser209 se desplaza 0,33 Å, mientras que el Cα de L-Val221 se desplaza 3,52 Å. No hay cambios observables en TMH D y E, que son superponibles en ambas estructuras (Figura 6A). Hasta donde sabemos, esta es la primera estructura en el RC natural que cierra el sitio QB. Una comparación con la estructura completa (unida a QB) muestra que antes de que la quinona se reduzca, se requiere un cambio conformacional para que entre en la quinona. L-Phe217 rota para formar una interacción de apilamiento π con el grupo cabeza de la quinona, y la hélice se desplaza hacia afuera, lo que permite que el esqueleto de L-Gly222 y la cadena lateral de L-Tyr223 formen una red de enlaces de hidrógeno con una estructura de enlace de hidrógeno estable (Figura 6, A y C).
(A) Dibujo animado superpuesto del holograma (cadena L, naranja/cadena M, magenta) y la estructura apo (gris), en el que los residuos clave se muestran en forma de una representación en forma de varilla. UQ10 está representado por una barra amarilla. La línea punteada indica los enlaces de hidrógeno formados en toda la estructura. (B y C) La representación de la superficie de la apolipoproteína y la estructura completa del anillo, resaltando el oxígeno de la cadena lateral de L-Phe217 en azul y L-Tyr223 en rojo, respectivamente. La subunidad L es naranja; las subunidades M y H no están coloreadas. (D y E) Sitios RC QB de la apolipoproteína (D) y completos (E) [coloreados por (A) respectivamente] y Thermophilus thermophilus PSII (verde, azul con quinona plástica; ID de PDB: 3WU2) Align (58).
Inesperadamente, aunque se dispone de varias estructuras de RC deficientes en QB sin LH1, los cambios conformacionales observados en este estudio no se habían informado previamente. Estas incluyen la estructura de agotamiento de QB de Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) y Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), todas las cuales son casi iguales a su estructura QB general. Una inspección detallada de 3PRC reveló que las moléculas de detergente LDAO (óxido de lauril dimetilamina) se unen en la entrada de la posición QB, lo que puede impedir el reordenamiento a una conformación cerrada. Aunque el LDAO no se descompone en la misma posición en 1EYS o 1OGV, estos RC se preparan utilizando el mismo detergente y, por lo tanto, pueden producir el mismo efecto. La estructura cristalina de Rba. El RC de Sphaeroides cocristalizado con citocromo c2 (PDB ID: 1L9B) también parece tener un sitio QB cerrado. Sin embargo, en este caso, la región N-terminal del polipéptido RC-M (que interactúa con el sitio de unión QB a través del enlace H del residuo de tirosina en la hélice Q) adopta una conformación no natural, y el cambio conformacional de QB no se explora más (30). Lo que es tranquilizador es que no hemos visto este tipo de deformación del polipéptido M en la estructura RC-LH114-W, que es casi igual a la región N-terminal del RC-LH116. También debe señalarse que después de la erradicación de la antena LH1 basada en detergente, los RC de apolipoproteína en el PDB se resolvieron, lo que eliminó los grupos internos de quinona y lípidos en el espacio entre el RC y la superficie interna del anillo LH1 circundante (31, 32). El RC permanece funcional porque conserva todos los cofactores, excepto la quinona QB descomponible, que es menos estable y a menudo se pierde durante el proceso de preparación (33). Además, se sabe que la eliminación de LH1 y lípidos cíclicos naturales del RC puede afectar sus funciones, como la reducción de la vida útil del estado P+QB con separación de carga (31, 34, 35). Por lo tanto, especulamos que la existencia del anillo LH1 local que rodea al RC puede mantener el sitio QB "cerrado", preservando así el entorno local cerca del QB.
Aunque la apolipoproteína (sin la quinona QB) y la estructura completa representan solo dos instantáneas del recambio del sitio QB, en lugar de una serie de eventos, hay indicios de que la unión puede ser regulada para evitar la reasociación por hidroquinona para inhibir la inhibición del sustrato. La interacción de quinolol y quinona cerca del sitio QB de la apolipoproteína puede ser diferente, lo que lleva a su rechazo por RC. Se ha propuesto desde hace tiempo que los cambios conformacionales juegan un papel en la unión y reducción de quinonas. La capacidad de los RC congelados para reducir quinonas después de la adaptación a la oscuridad está afectada (36); la cristalografía de rayos X muestra que este daño se debe a que las quinonas QB están atrapadas en una conformación "distal" a unos 4,5 Å de la posición proximal activa (26), 37). Sugerimos que esta conformación de unión distal es una instantánea del estado intermedio entre la apolipoproteína y la estructura de anillo completa, que sigue a la interacción inicial con la quinona y la apertura del sitio QB.
El RC de tipo II que se encuentra en el complejo PSII de ciertas bacterias y cianobacterias fototróficas, algas y plantas presenta conservación estructural y funcional (38). La alineación estructural que se muestra en la Figura 6 (D y E) resalta la similitud entre los RC del PSII y el sitio QB del complejo RC bacteriano. Esta comparación ha servido durante mucho tiempo como modelo para estudiar los sistemas estrechamente relacionados de unión y reducción de quinonas. Publicaciones anteriores sugirieron que los cambios conformacionales van acompañados de la reducción de quinonas por el PSII (39, 40). Por lo tanto, considerando la conservación evolutiva del RC, este mecanismo de unión previamente no observado también podría aplicarse al sitio QB del RC del PSII en plantas fototróficas oxigenadas.
Cepas Rps ΔpufW (deleción de pufW sin marcar) y PufW-His (proteína W con etiqueta His 10x en el extremo C expresada desde el locus pufW natural). palustris CGA009 se describió en nuestro trabajo anterior (16). Estas cepas y el parental isogénico de tipo silvestre se recuperaron del congelador mediante la siembra de una pequeña cantidad de células en placas de agar PYE (5 g cada una, litro -1) (almacenadas en LB a -80 °C, que contiene 50 % (p/v) de proteína, extracto de levadura y succinato) [1,5 % (p/v)]. La placa se incubó durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente en condiciones anaeróbicas y luego se iluminó con luz blanca (~50 μmolm-2 s-1) proporcionada por bombillas halógenas OSRAM de 116 W (RS Components, Reino Unido) durante 3 a 5 días hasta que apareció una sola colonia. Se utilizó una sola colonia para inocular 10 ml de medio M22+ (41) suplementado con 0,1% (p/v) de aminoácidos de caseína (en adelante, M22). El cultivo se mantuvo en condiciones de bajo oxígeno en la oscuridad a 34 °C con agitación a 180 rpm durante 48 horas, y luego se inocularon 70 ml del cultivo en las mismas condiciones durante 24 horas. Se utilizó un cultivo semi-aeróbico con un volumen de 1 ml para inocular 30 ml de medio M22 en una botella de vidrio transparente universal de 30 ml con tapa de rosca y se irradió con agitación (~50 μmol m⁻² s⁻¹) durante 48 horas mediante una varilla de agitación magnética estéril. Luego, se inocularon 30 ml del cultivo con aproximadamente 1 litro de cultivo en las mismas condiciones, que luego se utilizó para inocular aproximadamente 9 litros de cultivo iluminado a ~200 μmol m⁻² s⁻¹ durante 72 horas. Las células se recolectaron mediante centrifugación a 7132 RCF durante 30 minutos, se resuspendieron en ~10 ml de tris-HCl 20 mM (pH 8,0) y se almacenaron a -20 °C hasta que se necesitaran.
Después de descongelar, agregue algunos cristales de desoxirribonucleasa I (Merck, Reino Unido), lisozima (Merck, Reino Unido) y dos tabletas de inhibidor de proteasa de holoenzima Roche (Merck, Reino Unido) a las células resuspendidas. En una celda de presión French de 20 000 psi (Aminco, EE. UU.), las células se rompieron de 8 a 12 veces. Después de eliminar las células intactas y los restos insolubles por centrifugación a 18 500 RCF durante 15 minutos a 4 °C, la membrana se precipitó del lisado pigmentado por centrifugación a 113 000 RCF durante 2 horas a 43 000 °C. Deseche la fracción soluble y resuspenda la membrana coloreada en 100 a 200 ml de tris-HCl 20 mM (pH 8,0) y homogeneice hasta que no haya agregados visibles. La membrana en suspensión se incubó en 20 mM de tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, EE. UU.) que contenía 2 % (p/v) de β-DDM durante 1 hora en la oscuridad a 4 °C con agitación suave. A continuación, se centrifugó a 70 °C para disolver 150 000 RCF a 4 °C durante 1 hora y eliminar los insolubles residuales.
La membrana solubilizante de la cepa ΔpufW se aplicó a una columna de intercambio iónico DEAE Sepharose de 50 ml con tres volúmenes de columna (VC) de tampón de unión [20 mM tris-HCl (pH 8,0) que contenía 0,03 % (p/v) de β-DDM]. Lave la columna con dos VC de tampón de unión y, a continuación, lávela con dos VC que contenían 50 mM de NaCl. El complejo RC-LH116 se eluyó con un gradiente lineal de 150 a 300 mM de NaCl (en tampón de unión) en 1,75 VC, y el complejo de unión restante se eluyó con un tampón de unión que contenía 300 mM de NaCl en 0,5 VC. Recopile el espectro de absorción entre 250 y 1000 nm, conserve la fracción con una relación de absorbancia (A880/A280) mayor que 1 entre 880 y 280 nm, dilúyala dos veces en el tampón de unión y utilice el mismo procedimiento nuevamente en la columna DEAE. En la purificación, diluya las fracciones con relaciones A880/A280 mayores que 1,7 y relaciones A880/A805 mayores que 3,0, realice la tercera ronda de intercambio iónico y conserve las fracciones con relaciones A880/A280 mayores que 2,2 y relaciones A880/A805 mayores que 5,0. El complejo parcialmente purificado se concentró a ~2 ml en un filtro centrífugo Amicon con un límite de exclusión de peso molecular (MWCO) de 100 000 (Merck, Reino Unido) y se cargó en una columna de exclusión por tamaño Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, EE. UU.) que contenía un tampón de NaCl de 200 mM, y luego se eluyó en el mismo tampón a 1,5 CV. Recoja los espectros de absorción de la fracción de exclusión por tamaño y concentre los espectros de absorción con relaciones A880/A280 superiores a 2,4 y relaciones A880/A805 superiores a 5,8 a 100 A880, y utilícelos inmediatamente para la preparación de rejillas de crio-TEM o para su almacenamiento. Mantener a -80 °C hasta que se necesiten.
La membrana solubilizante de la cepa PufW-His se aplicó a una columna HisPrep FF Ni-NTA Sepharose de 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8.0) que contenía 200 mM NaCl y 0.03% (p/p)) en tampón IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. La columna se lavó con cinco CV de tampón IMAC y luego con cinco CV de tampón IMAC que contenían 10 mM de histidina. El complejo central se eluyó de la columna con cinco tampones IMAC que contenían 100 mM de histidina. La fracción que contenía el complejo RC-LH114-W se concentró a ~10 ml en un tanque agitado equipado con un filtro Amicon 100,000 MWCO (Merck, Reino Unido), se diluyó 20 veces con tampón de unión y luego se agregó a 25 ml En la columna DEAE Sepharose, se utilizan cuatro CV unidos al tampón de antemano. Lave la columna con cuatro tampones de unión CV, luego eluya el complejo en ocho CV en un gradiente lineal de 0 a 100 mM NaCl (en tampón de unión), y los cuatro CV restantes que contienen 100 mM de tampón de unión. Los complejos residuales eluidos en el cloruro de sodio combinado con la relación A880/A280 superior a 2,4 y la relación A880/A805 superior a 4,6 fracciones se concentraron a ~2 ml en un filtro centrífugo Amicon 100.000 MWCO, y se llenaron con 1,5 CV IMAC previamente equilibrado con tampón columna de exclusión de tamaño Superdex 200 16/600, y luego se eluyó en el mismo tampón sobre 1,5 CV. Recopile los espectros de absorción de las fracciones de exclusión por tamaño y concentre los espectros de absorción con relaciones A880/A280 superiores a 2,1 y relaciones A880/A805 superiores a 4,6 hasta 100 A880, que se utilizan inmediatamente para la preparación de rejillas TEM congeladas o se almacenan a -80 °C hasta que se necesiten.
Se utilizó un congelador de inmersión Leica EM GP para preparar rejillas de TEM de baja temperatura. El complejo se diluyó en tampón IMAC hasta alcanzar una absorbancia a 880 nm de 50, y luego se cargaron 5 μl sobre una malla de cobre recubierta de carbono QUANTIFOIL 1.2/1.3 recién tratada con descarga luminiscente (Agar Scientific, Reino Unido). La rejilla se incubó a 20 °C y 60 % de humedad relativa durante 30 s, se secó con papel absorbente durante 3 s y, finalmente, se enfrió rápidamente en etano líquido a -176 °C.
Los datos del complejo RC-LH114-W se registraron en el eBIC (Centro de Bioimágenes Electrónicas) (Fuente de Luz de Diamante Británica) con un microscopio Titan Krios, que funciona a un voltaje de aceleración de 300 kV, con una magnificación nominal de 130 000 × y una energía de - Elija una brecha de 20 eV. Se utilizó un Gatan 968 GIF Quantum con detector de pico K2 para registrar imágenes en modo de conteo para recopilar datos. El tamaño de píxel calibrado es 1,048 Å, y la tasa de dosis es 3,83 e-Å-2s-1. Se recolectó la película en 11 segundos y se dividió en 40 partes. Se utilizó el área recubierta de carbono para reenfoque el microscopio, y luego se recolectaron tres películas por agujero. En total, se recolectaron 3130 películas, con valores de desenfoque entre -1 y -3 μm.
Los datos del complejo RC-LH116 se obtuvieron con el mismo microscopio en el Laboratorio de Bioestructura de Asterbury (Universidad de Leeds, Reino Unido). La adquisición de datos se realizó en modo de conteo con un aumento de 130 000x, y el tamaño del píxel se calibró a 1,065 Å con una dosis de 4,6 e-Å⁻²s⁻¹. La grabación del vídeo duró 12 segundos y se dividió en 48 partes. En total, se obtuvieron 3359 películas, con valores de desenfoque entre -1 y -3 μm.
Todo el procesamiento de datos se realiza en la canalización Relion 3.0 (42). Use Motioncorr 2 (43) para corregir el movimiento del haz mediante ponderación de dosis, y luego use CTFFIND 4.1 (44) para determinar el parámetro CTF (función de transferencia de contraste). Las fotomicrografías típicas después de estas etapas de procesamiento inicial se muestran en la Figura 2. S16. La plantilla de selección automática se genera seleccionando manualmente alrededor de 250 píxeles de 1000 partículas en un marco de 250 píxeles y sin clasificación bidimensional (2D) de referencia, rechazando así aquellas clasificaciones que cumplen con la contaminación de la muestra o no tienen características discernibles. Luego, se realizó la selección automática en todas las microfotografías, y el RC-LH114-W fue 849,359 partículas, y el complejo RC-LH116 fue 476,547 partículas. Todas las partículas seleccionadas se sometieron a dos rondas de clasificación 2D sin referencia, y después de cada ejecución, las partículas que cumplen con el área de carbono, contaminación de la muestra, no tienen características obvias o partículas fuertemente superpuestas son rechazadas, lo que resulta en 772,033 (90.9%) y 359,678 (75.5%) ) Partículas que se utilizan para la clasificación 3D de RC-LH114-W y RC-LH116 respectivamente. El modelo de referencia 3D inicial se generó utilizando el método de descenso de gradiente estocástico. Usando el modelo inicial como referencia, las partículas seleccionadas se clasifican en cuatro categorías en 3D. Usando el modelo en esta categoría como referencia, realiza un refinamiento 3D en las partículas en la categoría más grande, luego usa el filtro de paso bajo inicial de 15Å para cubrir el área del solvente, agrega 6 píxeles de bordes suaves y posprocesa los píxeles para corregir la función de transferencia de modulación del pico Gatan K2 del detector superior. Para el conjunto de datos RC-LH114-W, este modelo inicial se modificó eliminando la fuerte densidad en los bordes de la máscara (desconectada de la densidad del complejo central en UCSF Chimera). Los modelos resultantes (las resoluciones de RC-LH114-W y RC-LH116 son 3,91 y 4,16 Å, respectivamente) se utilizan como referencia para la segunda ronda de clasificación 3D. Las partículas utilizadas se agrupan en la clase 3D inicial y no contienen una fuerte correlación con el vecindario. Superposición o falta de características estructurales obvias. Después de la segunda ronda de clasificación 3D, se seleccionó la categoría con la resolución más alta [Para RC-LH114-W, una categoría es 377.703 partículas (44,5%), para RC-LH116, hay dos categorías, que suman 260.752 partículas (54,7%), donde son iguales solo cuando se alinean después de la rotación inicial con una pequeña diferencia]. Las partículas seleccionadas se reextraen en una caja de 400 píxeles y se refinan mediante refinamiento 3D. La máscara de disolvente se genera utilizando el filtro de paso bajo inicial de 15 Å, la expansión del mapa de 3 píxeles y la máscara suave de 3 píxeles. Utilizando el refinamiento CTF por partícula, la corrección de movimiento por partícula y la segunda ronda de refinamiento CTF por partícula, el refinamiento 3D, el enmascaramiento de disolvente y el postprocesamiento se realizan después de cada paso para refinar aún más la textura resultante. Utilizando el valor de corte FSC (coeficiente de correlación de la capa de Fourier) de 0,143, las resoluciones de los modelos finales de RC-LH114-W y RC-LH116 son 2,65 y 2,80 Å, respectivamente. La curva FSC del modelo final se muestra en la Figura 2. S17.
Todas las secuencias de proteínas se descargaron de UniProtKB: LH1-β (PufB; ID de UniProt: Q6N9L5); LH1-α (PufA; ID de UniProt: Q6N9L4); RC-L (PufL; ID de UniProt: O83005); RC-M (PufM; ID de UniProt: A0A4Z7); RC-H (PuhA; ID de UniProt: A0A4Z9); Proteína-W (PufW; ID de UniProt: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) se utilizó para construir un modelo de homología de RC, que contiene las secuencias de proteínas de RC-L, RC-M y RC-H y la estructura cristalina de Rba. Se utilizó RC de sphaeroides como plantilla (ID de PDB: 5LSE) (46). Utilice la herramienta “ajuste de mapa” en UCSF Chimera para ajustar el modelo generado al mapa (47), mejorar la estructura de la proteína y agregar el cofactor [4×BChl a (nombre del residuo de la biblioteca de monómeros = BCL), 2×BPh a (BPH), uno o dos tipos de UQ10 (U10), un hierro no hemo (Fe) y una 3,4-dihidrohexacarbonilcolina (QAK)] usando Coot (48). Dado que QAK no está disponible en la biblioteca de monómeros, se parametrizó utilizando la herramienta eLBOW en PHENIX (49).
A continuación, se construyó la subunidad LH1. Inicialmente, se utilizó la herramienta de construcción automática en PHENIX (49) para construir automáticamente parte de la secuencia LH1 utilizando el mapa y las secuencias de proteínas LH1-α y LH1-β como entrada. Seleccione la subunidad LH1 más completa, extráigala y cárguela en Coot, agregue manualmente la secuencia faltante en ella, y refine manualmente toda la estructura antes de agregar dos BCls a (BCL) y una espiriloxantina (CRT) [de acuerdo con la densidad de Rps relevante del complejo LH1 y el contenido de carotenoides conocido. Especie (17)]. Copie la subunidad LH1 completa, y use la "Herramienta de mapa de acoplamiento" de UCSF Chimera para acoplar en el área no modelo adyacente de densidad LH1, y luego refínela en Coot; repita el proceso hasta que todas las subunidades LH1 hayan sido modeladas. Para la estructura RC-LH114-W, al extraer la densidad no asignada en Coot, la proteína se segmenta de los componentes no proteicos restantes en el mapa de quimeras USCF y se utiliza la herramienta Autobuild para establecer el modelo inicial y las subunidades restantes (proteína-W) Modelado. En PHENIX (49). Agregue cualquier secuencia faltante al modelo resultante en Coot (48) y luego refine manualmente toda la subunidad. La densidad no asignada restante se ajusta a la combinación de lípidos (ID de la biblioteca de monómeros PDB de CDL = CDL, POPC = 6PL y POPG = PGT), detergente β-DDM (LMT) y moléculas UQ10 (U10). Utilice la optimización de PHENIX (49) y la optimización manual en Coot (48) para perfeccionar el modelo inicial completo hasta que las estadísticas del modelo y la calidad visual del ajuste no se puedan mejorar más. Finalmente, utilice LocScale (50) para mejorar el mapa local y, a continuación, realice varios ciclos más de modelado de la densidad no asignada y optimización automática y manual.
Los péptidos, cofactores y otros lípidos y quinonas acoplados dentro de sus respectivas densidades se muestran en las Figuras 1 y 2, S18 a S23. La información estadística del modelo final se muestra en la Tabla S1.
Salvo que se especifique lo contrario, los espectros de absorción UV/Vis/NIR se obtuvieron con un espectrofotómetro Cary60 (Agilent, EE. UU.) a intervalos de 1 nm desde 250 nm hasta 1000 nm y con un tiempo de integración de 0,1 s.
Diluya la muestra en una cubeta de cuarzo con una longitud de paso de 2 mm hasta A880 de 1 y recoja el espectro de absorción entre 400 y 1000 nm. Los espectros dicroicos circulares se obtuvieron con un espectropolarímetro Jasco 810 (Jasco, Japón) a intervalos de 1 nm entre 400 nm y 950 nm a una velocidad de barrido de 20 nm min-1.
El coeficiente de extinción molar se determina diluyendo el complejo central a una A880 de aproximadamente 50. Diluya el volumen de 10 μl en 990 μl de tampón de unión o metanol, y recoja el espectro de absorción inmediatamente para minimizar la degradación de BChl. El contenido de BChl de cada muestra de metanol se calculó mediante el coeficiente de extinción a 771 nm de 54,8 mM-1 cm-1, y el coeficiente de extinción se determinó (51). Divida la concentración medida de BChl por 32 (RC-LH114-W) o 36 (RC-LH116) para determinar la concentración del complejo central, que luego se utiliza para determinar el espectro de absorción de la misma muestra recogida en el tampón Coeficiente de extinción. paralelo. Se tomaron tres mediciones repetidas para cada muestra, y la absorbancia promedio del máximo Qy de BChl se utilizó para el cálculo. El coeficiente de extinción de RC-LH114-W medido a 878 nm es 3280±140 mM-1 cm-1, mientras que el coeficiente de extinción de RC-LH116 medido a 880 nm es 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 se cuantificó según el método en (52). En resumen, se realizó HPLC de fase inversa (RP-HPLC) utilizando el sistema HPLC Agilent 1200. Disuelva aproximadamente 0,02 nmol de RC-LH116 o RC-LH114-W en 50 μl de metanol:cloroformo 50:50 que contiene 0,02 % (p/v) de cloruro férrico, e inyecte la columna Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm preequilibrada. Disuelva en 1 ml-1 min-1 a 40 °C en disolvente HPLC (metanol:2-propanol 80:20) en una columna de ×25 cm. Realice una elución isocrática en un disolvente HPLC para monitorear la absorbancia a 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoides) y 780 nm (BChl) durante 1 hora. Se integró el pico en el cromatograma de 275 nm a los 25,5 minutos, el cual no contenía otros compuestos detectables. El área integrada se utilizó para calcular la cantidad molar de UQ10 extraída con referencia a la curva de calibración calculada a partir de la inyección de estándares puros de 0 a 5,8 nmol (Figura S14). Cada muestra se analizó por triplicado, y el error reportado corresponde a la desviación estándar del promedio.
Se preparó una solución que contenía el complejo RC-LH1 con una absorción Qy máxima de 0,1 con 30 μM de citocromo c2 de corazón de caballo reducido (Merck, Reino Unido) y de 0 a 50 μMUQ2 (Merck, Reino Unido). Se prepararon tres muestras de 1 ml en cada concentración de UQ2 y se incubaron durante la noche en la oscuridad a 4 °C para asegurar una adaptación completa a la oscuridad antes de la medición. La solución se cargó en un espectrofotómetro modular OLIS RSM1000 equipado con una rejilla de llama de 300 nm/500 líneas, rendijas de entrada de 1,24 mm, intermedias de 0,12 mm y de salida de 0,6 mm. Se colocó un filtro de paso largo de 600 nm en la entrada del fototubo de muestra y del tubo fotomultiplicador de referencia para excluir la luz de excitación. La absorbancia se monitorizó a 550 nm con un tiempo de integración de 0,15 s. La luz de excitación se emite desde el LED M880F2 de 880 nm (Thorlabs Ltd., Reino Unido) a través de un cable de fibra óptica con una intensidad del 90 % mediante un controlador DC2200 (Thorlabs Ltd., Reino Unido) y se emite hacia la fuente de luz con un ángulo de 90°. El haz de medición se opone al espejo para devolver cualquier luz que no haya sido absorbida inicialmente por la muestra. Se monitoriza la absorbancia 10 s antes de la iluminación de 50 s. Posteriormente, se monitoriza la absorbancia durante 60 s en la oscuridad para evaluar el grado en que el quinolol reduce espontáneamente el citocromo c23+ (véase la Figura S8 para los datos brutos).
Los datos se procesaron ajustando una tasa inicial lineal entre 0,5 y 10 s (dependiendo de la concentración de UQ2) y promediando las tasas de las tres muestras para cada concentración de UQ2. La concentración de RC-LH1, calculada mediante el coeficiente de extinción correspondiente, se utilizó para convertir la tasa en eficiencia catalítica, se representó gráficamente en Origin Pro 2019 (OriginLab, EE. UU.) y se ajustó al modelo de Michaelis-Menten para determinar los valores aparentes de Km y Kcat.
Para las mediciones de absorción transitoria, la muestra RC-LH1 se diluyó a ~2 μM en tampón IMAC que contenía 50 mM de ascorbato de sodio (Merck, EE. UU.) y 0,4 mM de terbutina (Merck, EE. UU.). El ácido ascórbico se utiliza como donador de electrones de sacrificio, y el tert-butaclofeno se utiliza como inhibidor de QB para asegurar que el donador RC principal permanezca reducido (es decir, no fotooxidado) durante todo el proceso de medición. Aproximadamente 3 ml de muestra se añaden a una celda giratoria personalizada (aproximadamente 0,1 m de diámetro, 350 RPM) con una longitud de trayectoria óptica de 2 mm para asegurar que la muestra en la trayectoria del láser tenga tiempo suficiente para la adaptación a la oscuridad entre pulsos de excitación. Utilice pulsos láser de ~100 fs para amplificar el sistema láser de Ti: Zafiro (Spectra Physics, EE. UU.) para excitar la muestra a 880 nm con una frecuencia de repetición de 1 kHz (20 nJ para NIR o 100 nJ para Vis). Antes de recopilar datos, exponga la muestra a la luz de excitación durante unos 30 minutos. La exposición provocará la inactivación de QA (posiblemente reduciendo QA una o dos veces). Pero tenga en cuenta que este proceso es reversible porque después de un largo período de adaptación a la oscuridad, RC volverá lentamente a la actividad de QA. Se utilizó un espectrómetro Helios (Ultrafast Systems, EE. UU.) para medir espectros transitorios con un tiempo de retardo de -10 a 7000 ps. Utilice el software Surface Xplorer (Ultrafast Systems, EE. UU.) para desagrupar los conjuntos de datos, luego fusionarlos y estandarizarlos. Utilice el paquete de software CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituania) para usar el conjunto de datos combinado y obtener espectros diferenciales relacionados con la desintegración, o utilice una función que convolucione múltiples exponentes con la respuesta del instrumento para ajustar la evolución espectral de una sola longitud de onda en Origin (OriginLab, EE. UU.).
Como se mencionó anteriormente (53), se preparó una película fotosintética que contenía el complejo LH1 sin RC ni antena periférica LH2. La membrana se diluyó en 20 mM de Tris (pH 8,0) y luego se cargó en una cubeta de cuarzo con una trayectoria óptica de 2 mm. Se utilizó un pulso láser de 30 nJ para excitar la muestra a 540 nm con un tiempo de retardo de -10 a 7000 ps. Procese el conjunto de datos como se describe para la muestra de Rps. pal.
La membrana se centrifugó a 150 000 RCF durante 2 horas a 4 °C, y luego su absorbancia a 880 nm se resuspendió en 20 mM tris-HCl (pH 8,0) y 200 mM NaCl. La membrana se disolvió agitando lentamente en 2 % (p/v) β-DDM durante 1 hora en la oscuridad a 4 °C. La muestra se diluyó en 100 mM carbonato de trietilamonio (pH 8,0) (TEAB; Merck, Reino Unido) hasta una concentración de proteína de 2,5 mg ml-1 (análisis Bio-Rad). El procesamiento posterior se llevó a cabo según el método publicado previamente (54), comenzando con la dilución de 50 μg de proteína en un total de 50 μl de TEAB que contenía 1 % (p/v) de laurato de sodio (Merck, Reino Unido). Después de la sonicación durante 60 s, se redujo con 5 mM de tris(2-carboxietil)fosfina (Merck, Reino Unido) a 37 °C durante 30 minutos. Para la S-alquilación, incube la muestra con 10 mM de metil S-metiltiometanosulfonato (Merck, Reino Unido) y agréguelo desde una solución madre de isopropanol de 200 mM durante 10 minutos a temperatura ambiente. La digestión proteolítica se llevó a cabo agregando 2 μg de mezcla de tripsina/endoproteinasa Lys-C (Promega, Reino Unido) e incubando a 37 °C durante 3 horas. El surfactante laurato se extrajo agregando 50 μl de acetato de etilo y 10 μl de ácido trifluoroacético (TFA; Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) de grado LC al 10 % (v/v) y agitando en vórtex durante 60 s. La separación de fases se promovió mediante centrifugación a 15 700 RCF durante 5 minutos. Siguiendo el protocolo del fabricante, se utilizó una columna de centrifugación C18 (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) para aspirar y desalar cuidadosamente la fase inferior que contenía el péptido. Tras el secado por centrifugación al vacío, la muestra se disolvió en TFA al 0,5 % y acetonitrilo al 3 %, y se analizaron 500 ng mediante cromatografía de fase inversa de nanoflujo acoplada a espectrometría de masas, utilizando los parámetros del sistema descritos previamente.
Utilice MaxQuant v.1.5.3.30 (56) para la identificación y cuantificación de proteínas y realice búsquedas en la base de datos del proteoma de Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Los datos de proteómica por espectrometría de masas se han depositado en la Alianza ProteomeXchange a través del repositorio asociado PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) con el identificador de conjunto de datos PXD020402.
Para el análisis por RPLC acoplado a espectrometría de masas con ionización por electrospray, el complejo RC-LH1 se preparó a partir de Rps de tipo silvestre. Utilizando el método publicado previamente (16), la concentración de proteína producida en células palustris fue de 2 mg ml-1 en 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl y 0.03% (p/v) β- (análisis Bio-Rad) ) DDM. Según el protocolo del fabricante, utilice el kit de purificación 2D (GE Healthcare, EE. UU.) para extraer 10 μg de proteína por el método de precipitación, y disuelva el precipitado en 20 μl de ácido fórmico (FA) al 60% (v/v), acetonitrilo al 20% (v/v) y agua al 20% (v/v). Cinco microlitros se analizaron por RPLC (Dionex RSLC) acoplado a espectrometría de masas (Maxis UHR-TOF, Bruker). Utilice una columna MabPac 1,2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) para la separación a 60 °C y 100 μl min -1, con un gradiente de 85 % (v/v) de solvente A [0,1 % (v/v) de FA y 0,02 % (v/v) de solución acuosa de TFA] a 85 % (v/v) de solvente B [0,1 % (v/v) de FA y 0,02 % (v/v) en 90 % (v/v) de acetonitrilo TFA]. Utilizando una fuente de ionización por electrospray estándar y parámetros predeterminados durante más de 60 minutos, el espectrómetro de masas obtiene de 100 a 2750 m/z (relación masa-carga). Con la ayuda de la herramienta FindPept del portal de recursos bioinformáticos ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), mapee el espectro de masas a las subunidades del complejo.
Las células se cultivaron durante 72 horas bajo 100 ml de luz NF-baja (10 μM m⁻² s⁻¹), media (30 μM m⁻² s⁻¹) o alta (300 μM m⁻² s⁻¹). Medio M22 (medio M22 en el que se omite el sulfato de amonio y el succinato de sodio se reemplaza por acetato de sodio) en una botella de 100 ml con tapa de rosca (23). En cinco ciclos de 30 s, se agregaron perlas de vidrio de 0,1 micras en una proporción de volumen de 1:1 para lisar las células y se enfriaron en hielo durante 5 minutos. La materia insoluble, las células intactas y las perlas de vidrio se eliminaron por centrifugación a 16 000 RCF durante 10 minutos en una microcentrífuga de mesa. La membrana se separó en un rotor Ti 70.1 con 100.000 RCF en tris-HCl 20 mM (pH 8,0) con un gradiente de sacarosa del 40/15% (p/p) durante 10 horas.
Como se describe en nuestro trabajo anterior, inmunodetección de la etiqueta His en PufW (16). En resumen, el complejo central purificado (11,8 nM) o la membrana que contenía la misma concentración de RC (determinada por oxidación restando el espectro de diferencia reducido y haciendo coincidir la carga en el gel teñido) en tampón de carga SDS 2x (Merck, Reino Unido) diluido dos veces. Las proteínas se separaron en un gel NuPage de bis-tris al 12% réplica (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido). Un gel se tiñó con azul brillante de Coomassie (Bio-Rad, Reino Unido) para cargar y visualizar la subunidad RC-L. La proteína en el segundo gel se transfirió a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) activada con metanol (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) para inmunoensayo. La membrana de PVDF se bloqueó en 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2 % (v/v) Tween-20 y 5 % (p/v) de leche desnatada en polvo, y luego se incubó con el anticuerpo primario anti-His (en tampón de anticuerpos diluido [50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl y 0,05 % (v/v) Tween-20] en 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, EE. UU.) durante 4 horas. Tras lavar la membrana 3 veces durante 5 minutos en tampón de anticuerpos, se combinó con un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (Sigma-Aldrich, Reino Unido) (diluido 1:10.000 en tampón de anticuerpos). Se incubó para permitir la detección (5 minutos después de 3 lavados en tampón de anticuerpos) utilizando el sustrato de quimioluminiscencia WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Italia) y el Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Reino Unido).
Al dibujar la distribución de intensidad de cada gel teñido o carril de inmunoensayo, integrar el área bajo el pico y calcular la relación de intensidad de RC-L (gel teñido) y Proteína-W (inmunoensayo), en ImageJ (57) procesar la imagen. Estas relaciones se convirtieron a relaciones molares asumiendo que la relación de RC-L a proteína-W en la muestra pura RC-LH114-W era 1:1 y normalizando todo el conjunto de datos en consecuencia.
Para consultar los materiales complementarios de este artículo, visite http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
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La estructura de alta resolución del complejo trampa de luz 1 en el centro de reacción proporciona nuevos conocimientos sobre la dinámica de la quinona.
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©2021 Asociación Estadounidense para el Avance de la Ciencia. reservados todos los derechos. AAAS es socio de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef y COUNTER. Avances científicos ISSN 2375-2548.